HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定酵母中谷胱甘肽

杜梨梨，羅必英

（安琪酵母股份有限公司檢測中心，湖北宜昌443005）

HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定酵母中谷胱甘肽

杜梨梨，羅必英

（安琪酵母股份有限公司檢測中心，湖北宜昌443005）

通過HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行酵母中還原型和氧化型谷胱甘肽含量測定的研究，利用Intersil ODS-3 C18柱，以庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液（pH3.0）和甲醇（v∶v=90∶10）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210nm，得到氧化型和還原型谷胱甘肽的相關(guān)系數(shù)均為0.9999，檢測限分別為2.40mg/L、2.27mg/L，定量限分別為9.0 mg/L、8.5 mg/L，精密度分別為2.00%、0.94%，回收率分別為100.12%～103.43%和95.23%～96.44%之間。

谷胱甘肽； 氧化型； 還原型； HPLC； 酵母

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合而成的含有巰基的三肽，有還原型和氧化型兩種形式[1]。它廣泛存在于所有的生物細(xì)胞中，以酵母[2]、小麥胚芽以及人和動(dòng)物肝臟、腎等含量最為豐富。谷胱甘肽具有整合解毒作用，能幫助人體保持正常的免疫系統(tǒng)功能。它可以用于藥物，也可以作為功能性食品的有效成分，在延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等功能性食品中廣泛應(yīng)用。

酵母中谷胱甘肽的檢測方法較多，有比色法、熒光法、碘量法和高效液相色譜法（HPLC）等[2-5]。本實(shí)驗(yàn)采用沸水浴提取酵母中的谷胱甘肽，用高效液相色譜法檢測其含量，該方法對完善和改進(jìn)谷胱甘肽的檢測方法有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

耗材及試劑：還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品：沃凱，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，CAS：70-18-8；氧化型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-Aldrich，CAS：27025-41-8；庚烷磺酸鈉，磷酸二氫鉀，磷酸，鹽酸。

儀器設(shè)備：Agilent1200高效液相色譜儀；電熱恒溫水浴鍋；色譜柱：Intersil ODS-3 C18，250 mm× 4.6 mm，5μm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母細(xì)胞中谷胱甘肽的提取

稱取樣品0.5 g，加0.01 mol/L鹽酸40 mL，100℃水浴加熱，并不停攪拌，5 min后迅速置于冰浴中冷卻至室溫，用0.01 mol/L鹽酸定容至50 mL。搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾后待測。

1.2.2 谷胱甘肽的HPLC分析條件

流動(dòng)相：A∶B=90∶10（v∶v）。

A相（庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液）：稱取磷酸二氫鉀3.4 g，庚烷磺酸鈉1.1 g，溶于500 mL水中，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，0.45μm微孔濾膜過濾。

B相：甲醇。

檢測波長，210 nm；流速，1.0 mL/min；進(jìn)樣量，20μL；柱溫，35℃。

1.2.3 谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制濃度分別為8μg/mL、20μg/mL、35μg/mL、70μg/mL、140μg/mL的谷胱甘肽系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，依上述分析條件進(jìn)樣分析，制作氧化型和還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品工作曲線。

1.2.4 HPLC測定酵母細(xì)胞中谷胱甘肽的含量

取1.2.1中待測液進(jìn)樣分析，色譜條件如上所述。依據(jù)1.2.3中谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)系列工作曲線計(jì)算樣品中氧化型和還原型谷胱甘肽的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

取一定濃度的還原型和氧化型谷胱甘肽進(jìn)行檢測，兩者的光譜圖見圖1、圖2。由圖1、圖2可知，氧化型與還原型谷胱甘肽的最大吸收波長在190～195 nm之間，由于儀器在此波長時(shí)不夠穩(wěn)定，故檢測波長選擇210 nm。

2.2 流動(dòng)相（庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液）pH值的選擇

流動(dòng)相pH值會(huì)影響樣品的出峰時(shí)間。選擇3個(gè)不同pH值的庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，還原型和氧化型谷胱甘肽的出峰時(shí)間見表1。由于pH2.5時(shí)標(biāo)樣出峰時(shí)間較長，且不利于保護(hù)色譜柱，故選擇庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液的pH3.0。

2.3 流動(dòng)相比例的選擇

圖1 還原型谷胱甘肽光譜圖

圖2 氧化型谷胱甘肽光譜圖

表1 不同pH值流動(dòng)相對應(yīng)谷胱甘肽出峰時(shí)間表

流動(dòng)相成分不同，樣品出峰時(shí)間不同。選擇5個(gè)不同的流動(dòng)相比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，還原型和氧化型谷胱甘肽的出峰時(shí)間見表2。依據(jù)出峰時(shí)間選擇A相與B相比例為90∶10，氧化型和還原型谷胱甘肽的圖譜見圖3。

表2 不同流動(dòng)相比例對應(yīng)谷胱甘肽出峰時(shí)間表

2.4 樣品處理方法考察

酵母中谷胱甘肽的提取受鹽酸濃度、水浴鍋溫度以及提取時(shí)間3個(gè)因素的影響。本實(shí)驗(yàn)對每個(gè)因素進(jìn)行3個(gè)水平的考察。溫度選擇80℃、100℃、121℃，鹽酸濃度選擇0.005 mol/L、0.01 mol/L、0.02 mol/L，處理時(shí)間選擇5 min、10 min、15 min進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

由表3可知，溫度的影響最大，其中100℃時(shí)提取效果最好。鹽酸濃度為0.005 mol/L和0.01 mol/L時(shí)差別不大，提取結(jié)果均高于0.02 mol/L，此時(shí)選擇0.01 mol/L。處理時(shí)間不同，提取效果也不同，依次是5 min的提取效果＞15 min的提取效果＞10 min的提取效果。

針對正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。對某一樣品，處理?xiàng)l件為溫度100℃、鹽酸濃度0.01 mol/L，時(shí)間選擇3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、10 min和15 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖3 流動(dòng)相比例為90:10時(shí)氧化型和還原型谷胱甘肽圖譜

圖4 不同樣品處理時(shí)間對應(yīng)的谷胱甘肽含量

由圖4可知，當(dāng)處理時(shí)間為5 min時(shí)，還原型和氧化型谷胱甘肽的提取效果都比較好，因此樣品處理時(shí)間選擇5 min，樣品圖譜見圖5。

圖5 樣品處理時(shí)間為5 min時(shí)對應(yīng)的色譜圖

表3 3因子3水平正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表4 HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測氧化型和還原型谷胱甘肽結(jié)果

2.5 線性范圍考察

配制濃度在1～200 mg/L范圍內(nèi)的一系列混標(biāo)進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果表明，當(dāng)谷胱甘肽的濃度達(dá)到145 mg/L以上時(shí)，氧化型和還原型谷胱甘肽的峰形不對稱，說明最大濃度應(yīng)小于145 mg/L。當(dāng)氧化型、還原型谷胱甘肽濃度分別為2.40 mg/L、2.27 mg/L時(shí)，檢測限約為3倍的噪聲水平。當(dāng)氧化型、還原型谷胱甘肽濃度分別為9.0 mg/L、8.5 mg/L時(shí)，檢測限約為10倍的噪聲水平，此濃度為儀器的定量限。

2.6 精密度考察

稱取同一樣品6份，進(jìn)行平行測定。由表4可知，氧化型和還原型谷胱甘肽的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.00%、0.94%。

2.7 回收率考察

根據(jù)精密度測定的結(jié)果，可知樣品含量。以上同一個(gè)樣取9份，分別添加約80%、100%、120%進(jìn)行回收率測定。測定數(shù)據(jù)見表4，氧化型和還原型谷胱甘肽的加標(biāo)回收率在95.23%～103.43%之間。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種快速、準(zhǔn)確測定谷胱甘肽的高效液相色譜方法。利用Intersil ODS-3 C18柱，以庚烷磺酸鈉-磷酸鹽緩沖溶液（pH3.0）和甲醇（v∶v= 90∶10）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，在10 min內(nèi)成功分離和定量分析了還原型和氧化型谷胱甘肽。該方法下，氧化型和還原型谷胱甘肽的相關(guān)系數(shù)均為0.9999，檢測限分別為2.40 mg/L、2.27 mg/L，定量限分別為9.0 mg/L、8.5 mg/L，精密度分別為2.00%、0.94%，回收率分別為100.12%～103.43%、95.23%～96.44%。

[1] 賈貞,王丹,游松.谷胱甘肽的研究進(jìn)展[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2009,26(3)：238-241.

[2] 范崇東,王淼,徐榕榕.熱水提取酵母中谷胱甘肽的條件優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2004(2)：127-129.

[3] 杜小莉,朱珠,傅強(qiáng),等.HPLC測定還原型谷胱甘肽的血漿濃度[J].中國藥學(xué)雜志,2005(6)：64-67.

[4] 滕艷坤,闞微娜.HPLC法測定還原型谷胱甘肽片中雜質(zhì)氧化型谷胱甘肽含量[J].中國藥師,2014(2)：45-47.

[5] 陳芬,趙曉燕,饒欽雄,等.HPLC測定姬松茸中谷胱甘肽的含量[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2014(9)：122-125.

Determination of Glutathione in Yeast by HPLC Standard Curve Method

DU Lili and LUO Biying
(Angel Yeast Co.Ltd.,Yichang,Hubei 443005,China)

The content of reduced/oxidized glutathione in yeast was measured by HPLC standard curve method.Intersil ODS-3 C18 column was applied,sodium heptane sulfonate-hydrogen phosphate buffer solution(pH=3)and methanol(v∶v=90∶10)was used as mobile phase,flowing rate was 1.0 mL/min,and detection wavelength was 210 nm.The correlation coefficient of reduced/oxidized glutathione was 0.9999,and their detection limits were 2.27 mg/L and 2.40 mg/L respectively,their quantification limits were 8.5 mg/L and 9.0 mg/L respectively,their precision were 0.94%and 2.00%respectively,and their recoveries were 95.23%to 96.44%and 100.12%to 103.43%respectively.(Trans.by YUE YANG)

glutathione;oxidized;reduced;HPLC;yeast

TS261.1；TS261.7；TQ926

A

1001-9286（2017）06-0119-04

10.13746/j.njkj.2017014

2017-01-22

杜梨梨（1983-），女，從事生物技術(shù)方面的專業(yè)研究。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2017-04-17；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170417.1056.008.html。