LncRNA-MIAT在腫瘤壞死因子α介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥中的表達(dá)及作用

任成龍，張璐，寧險(xiǎn)峰，趙青，蔡尚郎，張文忠

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

LncRNA-MIAT在腫瘤壞死因子α介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥中的表達(dá)及作用

任成龍，張璐*，寧險(xiǎn)峰，趙青，蔡尚郎，張文忠

目的：體外觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）在腫瘤壞死因子α（TNF-α）刺激下，細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（LncRNA-MIAT）的表達(dá)變化，并探討LncRNA-MIAT對(duì)ECs炎癥的調(diào)控作用。

方法：以TNF-α誘導(dǎo)ECs表達(dá)LncRNA-MIAT,采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分別檢測(cè)ECs炎癥狀態(tài)下細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和LncRNA-MIAT的表達(dá)情況。應(yīng)用MIAT小干擾核糖核酸（siRNAMIAT）轉(zhuǎn)染ECs細(xì)胞,觀察LncRNA-MIAT敲低對(duì)ICAM-1表達(dá)的影響。

結(jié)果：LncRNA-MIAT隨著TNF-α刺激時(shí)間的延長(zhǎng)與濃度的增高呈上升趨勢(shì),刺激24 h、48 h分別與刺激0 h、6 h、12 h比較，LncRNA-MIAT表達(dá)量均增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）； TNF-α刺激濃度為1.000 ng/ml、10.000 ng/ml分別與刺激濃度為0.000 ng/ml、0.125 ng/ml比較，LncRNA-MIAT表達(dá)量增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。 ECs經(jīng)siRNAMIAT轉(zhuǎn)染后，TNF-α誘導(dǎo)的ICAM-1蛋白表達(dá)被顯著抑制（P＜0.05）。

結(jié)論：LncRNA-MIAT可能參與血管ECs的炎癥反應(yīng)，并可能起到促炎作用。

核糖核酸酶類；腫瘤壞死因子α；細(xì)胞間黏附分子-1

冠心病的發(fā)生率和致死率呈逐漸上升趨勢(shì)，成為威脅人們健康與生命的重要慢性疾病和耗費(fèi)國(guó)家巨額財(cái)政的主要病種之一。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病的主要病理基礎(chǔ)，其起始于血管內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）的損傷，損傷后的ECs會(huì)分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷入內(nèi)膜，吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，即在粥樣硬化斑塊內(nèi)出現(xiàn)的特征性細(xì)胞，因此ECs在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用[1]。全基因關(guān)聯(lián)性研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物基因中超過(guò)98%轉(zhuǎn)錄為非編碼核糖核酸（ncRNA），只有不到2%的基因轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)[2]。而隨后的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸（LncRNA） 屬于ncRNA的重要組成部分，其是指長(zhǎng)度 ＞ 200 nt、無(wú)蛋白編碼功能的RNA，可從表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個(gè)層面實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控[3]，其表達(dá)水平的變化與多種疾病密切相關(guān)，亦影響到心血管疾病[4，5]。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA-心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本（MIAT）在血管動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中起調(diào)控作用[6]。

腫瘤壞死因子α（TNF-α）是目前公認(rèn)在血管粥樣硬化中重要的致炎因子之一[7]。我們應(yīng)用TNF-α誘導(dǎo)ECs炎癥狀態(tài)，觀察ECs炎癥狀態(tài)下細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）和LncRNA-MIAT的表達(dá)情況，后采用siRNAMIAT敲低ECs細(xì)胞中LncRNA-MIAT，進(jìn)一步觀察TNF-α刺激下敲低LncRNA-MIAT后的ECs中ICAM-1的表達(dá)情況，旨在探討LncRNA-MIAT在ECs炎癥中的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源

人血管ECs株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，用含體積分?jǐn)?shù)10%新生胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，以質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Solarbio公司，胎牛血清購(gòu)自上海依科賽生物科技有限公司，TNF-α購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司，ICAM-1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，總RNA抽提試劑Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，熒光定量試劑Premix Taq、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SYBR Green II購(gòu)自日本TAKARA公司，小干擾核糖核酸（siRNA）（siRNAScramble、siRNAMIAT）購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染試劑Hiperfect購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，RIPA蛋白裂解液購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 研究方法

細(xì)胞培養(yǎng)方法：（1）常規(guī)培養(yǎng): ECs采用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1 %雙抗（青霉素/鏈霉素）的DMEM 高糖培養(yǎng)基，在37℃、常氧CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（2） TNF-α刺激ECs培養(yǎng)： ①時(shí)間刺激：按照六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞密度于加藥日達(dá)到50 %～60 %密度鋪板，以TNF-α濃度為1.000 ng/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，分別刺激0 h、6 h、12 h、24 h和48 h后收集細(xì)胞。 ②計(jì)量刺激：按照六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞密度于加藥日達(dá)50 %～60 %密度鋪板，分別以TNF-α濃度為0.000 ng/ml、0.125 ng/ml、0.250 ng/ ml、0.500 ng/ml、1.000 ng/m和l0.000 ng/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，于24 h后收集細(xì)胞。 ③常規(guī)TNF-α刺激：以TNF-α濃度為1.000 ng/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液設(shè)定時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞。

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）：檢測(cè)常規(guī)培養(yǎng)下ECs中LncRNA-MIAT表達(dá)，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù) （http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站獲得LncRNA-MIAT序列，以Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成LncRNA-MIAT正義鏈:5'-GAGATTGGCGATGGTTGTGA-3'，反義鏈: 5'-CAGTGACGCTCCTTTGTTGAA-3'，以Trizol提取細(xì)胞總RNA，合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）。PCR擴(kuò)增LncRNA-MIAT，以空白組作為內(nèi)部參照。配制20 μl反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件: 95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳后在紫外線下顯影拍照，根據(jù)條帶位置確定是否表達(dá)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：按Trizol試劑盒說(shuō)明書提取ECs總RNA，測(cè)得RNA濃度，質(zhì)量定為500 ng，求得逆轉(zhuǎn)錄體積后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將已經(jīng)提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒配置20 μl反應(yīng)體系（SYBRII 10 μl、cDNA 2 μl、上游引物 0.4 μl、下游引物 0.4μl、超純水 8.0 μl）。以β肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)部參照，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30 s：之后95℃ 5 s，60℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)復(fù)性；最后94℃90 s，60℃ 180 s延伸，繪制擴(kuò)增曲線。引物序列：正義鏈:5'-GAGATTGGCGATGGTTGTGA-3'，反義鏈:5'-CAGTGACGCTCCTTTGTTGAA-3'。

siRNA干擾：按照12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中細(xì)胞密度于轉(zhuǎn)染日達(dá)30%～40%密度鋪板，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑Hiperfect說(shuō)明書，轉(zhuǎn)染前將孔板內(nèi)細(xì)胞換液，每孔加入900 μl正常培養(yǎng)液。100 μl轉(zhuǎn)染體系： 6 μl Hiperfect、2 μl siRNA，DMEM補(bǔ)齊至100 μl，常溫孵育10 min后，加入12孔板，即每孔1 000μl（6孔板轉(zhuǎn)染時(shí)siRNA、Hiperfect加倍）。應(yīng)用siRNAScramble作為siRNAMIAT的陰性對(duì)照，分別于轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h、48 h，收細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。

蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)ICAM-1的表達(dá)：收集細(xì)胞，RIPA蛋白裂解液提取各組細(xì)胞中的總蛋白，BCA法定量蛋白，于10 %的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，濕法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上.以體積分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉封閉后，加入ICAM-1抗體，4 ℃孵育過(guò)夜，緩沖溶液（TBST）漂洗后加入二抗，化學(xué)發(fā)光法顯色，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，用目的蛋白ICAM-1的灰度值/內(nèi)參照灰度值的比值，作為ICAM-1的相對(duì)表達(dá)量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用Image J、Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物見圖1，與空白對(duì)照a相比，加入MIAT引物的b、c條帶明顯，提示ECs中表達(dá)LncRNA-MIAT，b與c條帶亮度的比較差異不明顯，說(shuō)明當(dāng)引物濃度增加時(shí)，LncRNA-MIAT表達(dá)量增加不明顯。

圖1 聚合酶鏈反應(yīng)電泳結(jié)果

2.2 TNF-α不同時(shí)間與不同濃度刺激ECs后LncRNA-MIAT表達(dá)結(jié)果（圖2）

隨著TNF-α刺激時(shí)間延長(zhǎng)，LncRNA-MIAT表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)。刺激24 h與0 h、6 h、12 h比較，LncRNA-MIAT表達(dá)量增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；刺激48 h與0 h、6 h、12 h比較，LncRNA-MIAT表達(dá)量增多，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。圖2A

隨著TNF-α刺激濃度增高，LncRNA-MIAT表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)。TNF-α刺激濃度1.000 ng/ml與刺激濃度0.000 ng/ml、0.125 ng/ml比較，LncRNA-MIAT表達(dá)量均增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）； TNF-α刺激濃度10.000 ng/ml與刺激濃度0.000 ng/ml、0.125 ng/ml比較，LncRNAMIAT表達(dá)量均增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。圖2B

圖2 TNF-α不同時(shí)間不同濃度刺激后LncRNA-MIAT的表達(dá)結(jié)果

2.3 qRT-PCR檢測(cè)siRNAMIAT轉(zhuǎn)染ECs后LncRNA-MIAT表達(dá)結(jié)果 （圖3）

siRNAMIAT轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 48 h與siRNAScramble比較，LncRNA-MIAT表達(dá)量顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；siRNAMIAT 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h與siRNAMIAT 24 h相比，LncRNA-MIAT表達(dá)量下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 Western Blot檢測(cè)ICAM-1結(jié)果（圖4）

應(yīng)用濃度為1.000 ng/ml 的TNF-α刺激ECs后，ICAM-1的表達(dá)與空白對(duì)照（不加TNF-α）相比顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4A）。應(yīng)用siRNAMIAT轉(zhuǎn)染ECs培養(yǎng)48 h后，應(yīng)用濃度為1.000 ng/ml TNF-α刺激ECs后，與陽(yáng)性對(duì)照（加1.000 ng/ml TNF-α刺激而未經(jīng)siRNAMIAT轉(zhuǎn)染）相比，ICAM-1表達(dá)量被明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與空白對(duì)照相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。圖4B

圖3 siRNAMIAT轉(zhuǎn)染ECs后LncRNA-MIAT的表達(dá)結(jié)果

圖4 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)ICAM-1的表達(dá)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，由于LncRNA在人類疾病的多種作用而獲得廣泛關(guān)注[8]。相對(duì)于編碼蛋白質(zhì)的基因，LncRNA的表達(dá)量不高，但是由于它們?cè)谏镞^(guò)程和人類疾病中所起的重要作用而受到生物學(xué)家和臨床醫(yī)生的關(guān)注[4]。LncRNA的保守性相較于編碼蛋白質(zhì)的RNA較差，但在其分子內(nèi)部，卻含有較為保守的序列或二級(jí)結(jié)構(gòu)，且其表達(dá)具有時(shí)空特異性，這些現(xiàn)象都提示LncRNA具有重要的生理生化功能。有些LncRNA和信使RNA（mRNA）一樣具有5'帽子結(jié)構(gòu)和 PolyA尾結(jié)構(gòu)，通過(guò)剪切加工而成熟。在大多數(shù)情況下，LncRNA通過(guò)不同的作用機(jī)制參與表遺傳學(xué)的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。同時(shí)，LncRNA還可作為小RNA的前體和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組織框架。特定的LncRNA發(fā)生結(jié)構(gòu)突變，引起表達(dá)水平及定位的改變，已被證明參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究中，我們提供了直接證據(jù)，LncRNAMIAT參與調(diào)節(jié)ECs功能和病理變化。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種LncRNA參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。LncRNA-Bvht可以通過(guò)作為心血管調(diào)節(jié)基因網(wǎng)絡(luò)中的核心基因調(diào)節(jié)心血管病的進(jìn)程[9]。LncRNA-Fendrr通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)修飾，從而影響心血管系統(tǒng)的發(fā)育[10]。血管ECs存在大量LncRNAMalat1，其參與調(diào)節(jié)一些血管內(nèi)皮功能，例如細(xì)胞遷移和血管側(cè)枝形成[11]。此外一些LncRNA已被證明與血管緊張素II相關(guān)性疾病有相關(guān)性，這些疾病其中包括冠脈粥樣硬化[12]。

血管粥樣硬化是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其起始于ECs的損傷[13]，而TNF-α是目前公認(rèn)的致炎因子之一[14]，同樣，蛋白ICAM-1也被認(rèn)為是提示炎癥的主要目的蛋白之一[15]。自LncRNAMIAT被發(fā)現(xiàn)后，隨后的一系列研究發(fā)現(xiàn)MIAT通過(guò)某些機(jī)制參與微血管功能失調(diào)的過(guò)程[16]，而微血管功能失調(diào)恰恰是動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中至關(guān)重要的因素。此外有研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)中，LncRNA-神經(jīng)生長(zhǎng)（LncRNA-ND）促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞的分化，并在神經(jīng)細(xì)胞分化過(guò)程中起到調(diào)節(jié)作用[17]，而當(dāng)LncRNA-ND功能失調(diào)時(shí)可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能障礙，甚至影響細(xì)胞正常生存[16]。在內(nèi)分泌系統(tǒng)中，LncRNA-MIAT也參與糖尿病性視網(wǎng)膜病變的病理進(jìn)程[6，18]。應(yīng)用siRNA敲低LncRNA-MIAT后，可降低大鼠ECs凋亡、血管通透性增加和減少糖尿病誘導(dǎo)產(chǎn)生的促炎蛋白，從而減輕視網(wǎng)膜血管損傷[6]。

因此本研究首先通過(guò)TNF-α對(duì)ECs的刺激模擬動(dòng)脈粥樣硬化ECs的炎癥損傷，通過(guò)Wstern Blot檢測(cè)確定ICAM-1的表達(dá)增加。通過(guò)qRTPCR檢測(cè)ECs中LncRNA-MIAT的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)ECs中能夠表達(dá)LncRNA-MIAT。之后，我們研究了LncRNA-MIAT在TNF-α誘導(dǎo)的血管ECs炎癥中的表達(dá)及調(diào)控作用。結(jié)果顯示，對(duì)于致炎因子TNF-α的刺激，ECs中LncRNA-MIAT的表達(dá)是增加的，隨著TNF-α的刺激時(shí)間延長(zhǎng)，LncRNAMIAT的表達(dá)趨勢(shì)是逐漸上升的，而隨TNF-α的刺激濃度的升高，LncRNA-MIAT的表達(dá)趨勢(shì)也是逐漸上升的。我們又通過(guò)siRNA MIAT敲低LncRNAMIAT來(lái)檢測(cè)ECs中ICAM-1的表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)LncRNA-MIAT敲低后，ICAM-1的表達(dá)量較對(duì)照明顯減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，LncRNA-MIAT可能參與ECs的炎癥進(jìn)程，并對(duì)ECs有促炎作用。

目前，對(duì)于LncRNA-MIAT的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)[4]，但研究尚不透徹。而對(duì)于LncRNA-MIAT在其他系統(tǒng)中的作用以及其在神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)中的研究成果與其它系統(tǒng)相關(guān)性尚不明確，因此，尚需要深入細(xì)致的研究。本研究結(jié)果表明LncRNAMIAT可能參與ECs的炎癥反應(yīng)，豐富了關(guān)于LncRNA的研究，并提示LncRNA-MIAT在動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病的治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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Expression and Effect of LncRNA-MIAT in Tumor Necrosis Factor-α Induced Endothelial Cell Inflammation

REN Cheng-long, ZHANG Lu, NING Xian-feng, ZHAO Qing, CAI Shang-lang, ZHANG Wen-zhong.
Department of Cardiology, Qingdao University Affiliated Hospital, Qingdao (266003), Shandong, China

NING Xian-feng, Email: nxf66@163.com

Objective: To observe the expression of long non-coding RNA myocardial infarction associated transcript (LncRNAMIAT) in tumor necrosis factor-α (TNF-α) induced endothelial cells (ECs) inflammation in vitro and to study the impact of LncRNA-MIAT on inflammatory regulation.

Methods: LncRNA-MIAT expression in ECs was induced by TNF-α at different time and concentration. Expressions of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and LncRNA-MIAT in inflammatory ECs were examined by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot analysis. Moreover, ECs was transfected by siRNAMIAT to observe the effect of LncRNA-MIAT knock-down on ICAM-1 expression.

Results: LncRNA-MIAT expression showed the increasing trend by elevated time and concentration of TNF-stimulation. Compared with TNF-α stimulation at 0h, 6h and 12h, LncRNA-MIAT expressions were increased at 24h and 48h of TNF-α stimulation respectively, all P＜0.05; compared with TNF-α concentration at 0ng/ml and 0.125ng/ml, LncRNA-MIAT expressions were elevated by TNF-α stimulation at 1.000ng/ml and 10.000ng/ml respectively, all P＜0.05. With siRNAMIAT knock-down, TNF-α induced ICAM-1 protein expression was significantly reduced in ECs, P＜0.05.

Conclusion: LncRNA-MIAT might be involved in ECs inflammatory response and it may play a role to promote inflammation.

Ribonucleases; Tumor necrosis factor alpha; Cell adhesion molecule-1 (Chinese Circulation Journal, 2017,32:607.)

2016-09-26）

（編輯：常文靜）

山東省自然科學(xué)基金培養(yǎng)基金項(xiàng)目（ZR2014HP017）

266003 山東省青島市，青島大學(xué)附屬醫(yī)院 心內(nèi)科（任成龍、寧險(xiǎn)峰、趙青、蔡尚郎、張文忠），中心實(shí)驗(yàn)室（張璐）

任成龍 碩士研究生 主要研究方向:冠心病的診斷與治療 Email：17614494@qq.com 通訊作者：寧險(xiǎn)峰 Email：nxf66@163.com*為共同第一作者

R54

A

1000-3614（2017）06-0607-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.06.018