miR—21在增生性瘢痕成纖維細胞增殖及青蒿琥酯等藥物作用下表達情況的實驗研究

梁剛　侯春　冀航等

[摘要]目的：研究青蒿琥酯抑制人增生性瘢痕成纖維細胞（HSFBs）增殖作用機制及miR-21所起的作用，為青蒿琥酯抑制皮膚瘢痕增生提供依據(jù)。方法：原代分離人皮膚增生性瘢痕成纖維細胞，分別使用100、200、300、500 μmol/L的青蒿琥酯處理24h，采用CCK8檢細胞的增值，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-21的表達情況。調(diào)控青蒿琥酯干預(yù)的HSFBs中的miR-21的表達，通過qRT-PCR和WB檢測細胞中結(jié)締組織生長因子（CTGF）以及機制金屬蛋白酶1（MMP-1）的表達。結(jié)果：青蒿琥酯能抑制HSFBs的增值，并且抑制miR-21的表達。HSFBs細胞使用mimics處理，能顯著降低青蒿琥酯對HSFBs的增值抑制作用，同時CTGF的表達升高，而MMP-I的表達降低。結(jié)論：青蒿琥酯可能通過調(diào)控miR-21的表達來抑制HSFBs的增值。

[關(guān)鍵詞]增生性瘢痕；成纖維細胞；青蒿琥酯；miR-21

[中圖分類號]R619⁺.6 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）03-0080-04

皮膚增生性瘢痕是病理性瘢痕的主要類型之一，常常給人們帶來瘙癢，病痛甚至活動障礙等多種并發(fā)癥。降低了人類正常的生活質(zhì)量，特別是形成于面部的瘢痕嚴重影響美觀，給患者帶來很大的精神壓力。增生性瘢痕主要組織學特點是成纖維細胞的增加，細胞外基質(zhì)的過度沉積以及膠原纖維紊亂無章的排列。

青蒿琥酯又稱青蒿酯，是由菊科植物黃花蒿葉提取的倍半萜烯的一種內(nèi)過氧化物。長期以來，人們一直用它作為一種治療瘧疾的傳統(tǒng)中藥。青蒿琥酯及其衍生物被世界衛(wèi)生組織列為治療瘧疾的首選藥物。它能特異性地抑制惡性瘧原蟲內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣腺苷三磷酸酶的活性。除了抗瘧活性外，青蒿琥酯及其衍生物在一些自身免疫疾病模型中也表現(xiàn)出潛在的免疫抑制活性，例如：系統(tǒng)性紅斑狼瘡，類風濕性關(guān)節(jié)炎和自身免疫腦脊髓炎。近年來，人們發(fā)現(xiàn)一定劑量的青蒿琥酯可以抑制HSFBs的增值，誘導(dǎo)其凋亡。

MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，大小約為20～25個核苷酸。miRNAs可調(diào)節(jié)細胞生長和組織分化，與生命過程中發(fā)育、疾病密切相關(guān)。有研究顯示，miR-21能促進纖維化的發(fā)生，可以通過促進細胞外基質(zhì)的沉積從而促進纖維化的出現(xiàn)。慕生枝等人指出，下調(diào)HSFBs中miR-21的表達可以抑制HSFBs的增值。本研究通過體外培養(yǎng)HSFBs，采用不同濃度的青蒿琥酯進行干預(yù)，檢測其對HSFBs增值的影響。同時通過抑制HSFBs中miR-21的表達，再一次驗證青蒿琥酯對HSFBs的增值影響，探討青蒿琥酯對HSFBs抑制作用可能的機制，為開發(fā)抗瘢痕藥劑提供實驗依據(jù)。

1材料

1.1主要儀器：TS-IOOF倒置顯微鏡，日本Nikon公司；全自動多功能型酶標儀，美國BIO-RAD公司，實時定量PCR擴增儀，美國ABI公司。

1.2主要試劑：青蒿琥酯，純度99.99%，桂林南藥股份公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，美國Gibico公司；CCK8，美國Sigma公司；鼠抗人波形蛋白、鼠抗人CTGF單克隆抗體、鼠抗人Ⅰ型膠原多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體，武漢博士德公司；RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，日本Takara公司；miR-21 mimics，上海吉碼生物。

2方法

2.1 HSFBs的原代培養(yǎng)及鑒定：瘢痕標本來源于廣州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院燒傷整形科外科手術(shù)切除的增生性瘢痕，取材前經(jīng)患者知情同意。組織采納的標準為3年內(nèi)沒有接受抗瘢痕治療，沒有系統(tǒng)性疾病。采用組織塊法進行原代培養(yǎng)。20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基按照1：3反復(fù)傳代純化成纖維細胞。原代細胞、傳代細胞均通過倒置顯微鏡進行觀察。取3代成纖維細胞，制備細胞爬片，4%多聚甲醛固定，進行波形蛋白免疫組化染色鑒定。

2.2 CCK8檢測HSFBs增值：細胞棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞2次，棄去PBS，加入0.25%胰酶，在顯微鏡下觀察，當胞質(zhì)回縮，細胞之間不再連接成片，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，制備細胞懸液；然后調(diào)整細胞密度至1×10⁵/μl，取100 μl細胞懸液加入96孔板，即每孔種1×10⁴個細胞，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，常規(guī)培養(yǎng)；分別加入100、200、300、500μmol/L處理HSFBs，對照組加入培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。細胞處理結(jié)束的前4h，吸去培養(yǎng)液，按每lml完全培養(yǎng)基加入100 μl CCK-8將二者混合均勻后，每孔加入100 μl的CCK-8混合液，避免產(chǎn)生氣泡，將培養(yǎng)板放到培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，4h后，將96孔板中的液體移至酶標板中，在492nm波長下測定吸光度（A）值。

2.3 qRT-PCR檢測miR-21、CTGF及MMP1mRNA的表達：各組經(jīng)處理后的細胞根據(jù)RNA快速提取試劑盒說明書步驟提取細胞總RNA。按照Takara RNA PCR Kit（AMY）Vet.3.0說明書操作進行反轉(zhuǎn)錄。用RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA的第1鏈作為模板進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析、DNA吸光度掃描檢測；顯色條帶圖像分析系統(tǒng)（Alpha Imager 2000）檢測其積分吸光度值，與內(nèi)參GAPDH條帶的比值為mRNA表達水平參數(shù)。miR-21的基因表達檢測是以U6小RNA為內(nèi)參。所用引物均由上海生工有限公司合成。具體引物序列表1。

2.4免疫熒光檢測波形蛋白：細胞在蓋片上生長融合到95%～100%時，用1×PBS洗3次，每次10min；4%的甲醛室溫固定25min；O.2%TritonX-100透化2～5min；5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉30min，加一抗波形蛋白（用1%BSA按照1：1000稀釋）4℃過夜，1×PBS洗滌3次，每次10min；加二抗IgG（用1%BSA按照1：1000稀釋）暗室避光30min，95%甘油封片。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍攝圖片。

2.5 Western blot檢測CTGF和MMP1的表達：每25cm²細胞加入蛋白裂解液200 μl，冰上裂解細胞30min，離心收集總蛋白。常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2h，4℃孵育一抗過夜（CTGF1：500稀釋，Ⅰ型膠原1：1000稀釋），室溫下孵育二抗30min（1：5000稀釋）；GAPDH作為內(nèi)參照（1：10000稀釋）。暗室內(nèi)ECL化學發(fā)光及顯影、定影。

2.6數(shù)據(jù)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準（x±s）表示，統(tǒng)計學分析多樣本比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA），兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3結(jié)果

3.1 HSFBs原代分離及鑒定結(jié)果：培養(yǎng)5～7d可見組織塊周圍有細小呈長梭狀貼壁細胞，之后梭形細胞快速增值，20d左右可長滿25cm²培養(yǎng)瓶，生長狀態(tài)如圖1A；傳至第三代，可以獲得較純的成纖維細胞，所有細胞胞質(zhì)均呈抗波形蛋白染色陽性（圖1B）。

3.2青蒿琥酯對HSFBs的增值及miR-21的表達的影響：100、200、300、500μmol/L的青蒿琥酯處理HSFBs，CCK8結(jié)果顯示，隨著青蒿琥酯濃度的增加，對HSFBs增值的抑制作用增加，且與對照組相比，48h后，300及500μmol/L青蒿琥酯處理組有顯著性差異（P<0.05）（圖2A）。miR-21的表達也明顯下降，且200、300、500μmol/L的青蒿琥酯處理組與對照組相比，有顯著性差異（P<0.05）（圖2B）。使用300μmol/L的青蒿琥酯進行以下實驗。

3.3上調(diào)miR-21后，青蒿琥酯對HSFBs增值抑制作用鑒定：用青蒿琥酯處理HSFBs，處理后將細胞分成3組，分別為對照組，mimics NC組和mimics組。分別對三組細胞進行qRT-PCR，wB和CCK8檢測。與對照組和mimics NC相比，mimics組miR-21（圖3A）和CTGF mRNA（圖3B）表達上升，而MMP-1 mRNA（圖3C）的表達下降，且均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與對照組和mimics NC相比，mimics組CTGF的蛋白表達上升，MMP-1蛋白表達下降（圖3D）。與對照組和mimics NC相比，mimics組HSFBs增值抑制作用降低，且48h后具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

4討論

增生性瘢痕是人體對創(chuàng)傷產(chǎn)生過度愈合反應(yīng)的結(jié)果，是人體燒傷、外傷或者炎癥一種過度的皮膚纖維增生性疾病，成纖維細胞增殖旺盛、細胞外基質(zhì)中的膠原、糖蛋白等過度的沉積，膠原蛋白排列紊亂為主要的病理特征。而人們認為其可能與異物反應(yīng)、膠原降解、免疫反應(yīng)異常有關(guān)。成纖維細胞在傷口上皮化以后繼續(xù)旺盛增殖且凋亡過程發(fā)生抑制、膠原等細胞外基質(zhì)合成與降解失衡、部分生長因子的大量產(chǎn)生和持續(xù)性存在，這三者密切關(guān)聯(lián)構(gòu)成了增生性瘢痕形成的生物學基礎(chǔ)。增生性瘢痕與正常皮膚的成纖維細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)不同，表現(xiàn)為纖維細胞持續(xù)旺盛同時大量分泌膠原等細胞外基質(zhì)，使組織體積不斷的增大引起副作用，比如功能型障礙。所以成纖維細胞的生長異常，被認為是瘢痕形成過程中的主要因素。

miRNA是一種長度約為19-22nt的非編碼RNA，調(diào)節(jié)正常生理過程及病理過程，如器官的發(fā)育，創(chuàng)傷的愈合以及腫瘤的發(fā)生，幾乎參與調(diào)控細胞活動的各個環(huán)節(jié)。有報道指出，miR-21參與間質(zhì)纖維化和心肌肥厚的成纖維細胞中呈現(xiàn)高表達的狀態(tài)，miRNA-21的表達失調(diào)也可能調(diào)控肺纖維化的。本研究發(fā)現(xiàn)，使用青蒿琥酯可以降低miR-21的表達以及降低HSFBs的增殖。而通過加入miR-21minics可以降低青蒿琥酯的作用。這表明通過青蒿琥酯降低miR-21的表達能夠抑制瘢痕的形成。

Ⅰ型膠原的過度合成和降解減少是增生性瘢痕形成的原因之一。抑制成纖維細胞中膠原蛋白的形成可以明顯地抑制瘢痕增生。而基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可以調(diào)控細胞外基質(zhì)的持續(xù)降解。MMP-1能夠破壞膠原熱穩(wěn)定性。組織中的MMP-1含量的多少級活性的強弱和細胞外基質(zhì)的降解程度有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，提高miR-21的含量可以降低青蒿琥酯抑制HSFBs的增殖，而此過程與CTGF的表達升高和MMP-1的表達降低有關(guān)。從而推測青蒿琥酯可能一方面通過下降miR-21的表達而影響CTGF的表達，與此同時，通過上調(diào)MMP-1的表達，加速膠原的降解。

綜上所述，本實驗揭示青蒿琥酯可以抑制HSFBs增殖，通過下調(diào)miR-21的表達，而通過上調(diào)miR-21的含量，可以上調(diào)CTGF的表達而降低MMP-1的表達。從而增加細胞外膠原基質(zhì)的沉積，增大HSFBs的增殖。所以miR-21對瘢痕的發(fā)生起著至關(guān)重要的作用，這對于臨床上應(yīng)用miR-21靶向分子治療增生性瘢痕提供了理論基礎(chǔ)。