QCM實時監(jiān)測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在不同KRGD濃度自組裝膜上的動態(tài)粘附

熊 倫,周鐵安*,黃復(fù)深，沈海波，黃靚圓

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 細(xì)胞力學(xué)與生物傳感研究所，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

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QCM實時監(jiān)測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在不同KRGD濃度自組裝膜上的動態(tài)粘附

熊 倫1,2,周鐵安1,2*,黃復(fù)深1,3，沈海波1,2，黃靚圓1,2

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 細(xì)胞力學(xué)與生物傳感研究所，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

采用自組裝及化學(xué)耦合技術(shù)將細(xì)胞粘附分子KRGD(Lys-Arg-Gly-Asp)與3-巰基丙酸(MPA)以及防止細(xì)胞非特異性粘附的三乙二醇單-11-巰基十一烷基醚(TGME)修飾于石英晶體微天平(QCM)的金電極上，制備了KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面；采用QCM實時監(jiān)測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)在不同KRGD濃度(0 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、75 μg·mL-1、100 μg·mL-1)自組裝膜上的動態(tài)粘附過程。結(jié)果表明，當(dāng)KRGD濃度為50 μg·mL-1時，QCM頻率變化Δf、動態(tài)電阻變化ΔR、細(xì)胞黏彈性指數(shù)CVI(ΔR/Δf)最大，表明該條件下HUVEC在QCM表面的粘附最強，顯示出最有組織的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)而最硬；當(dāng)加入肌球蛋白Ⅱ抑制劑blebbistatin后，粘附有細(xì)胞的QCM響應(yīng)信號減弱，細(xì)胞粘附變?nèi)?，?xì)胞變軟。表明QCM可用于監(jiān)測不同KRGD濃度自組裝膜上HUVEC的動態(tài)粘附及細(xì)胞-藥物作用，從而提供有關(guān)細(xì)胞粘附強度與黏彈性的動態(tài)信息。

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞粘附；細(xì)胞黏彈性；石英晶體微天平；KRGD；blebbistatin

石英晶體微天平(QCM)是一種基于壓電效應(yīng)的應(yīng)用廣泛的非標(biāo)記生物傳感器，具有操作簡便、靈敏度和精確度高等優(yōu)點[1]，在測量細(xì)胞力學(xué)性能方面具有非常好的前景。Wu等[2]用QCM比較了年老與年輕腱干細(xì)胞的黏彈性，發(fā)現(xiàn)年老細(xì)胞的硬度與黏度較年輕細(xì)胞大[3]。Li等[4]研究證明，QCM可以有效地用作功能生物傳感器來確定活細(xì)胞的黏彈性。Zhou等[5-6]用QCM實時監(jiān)測細(xì)胞的粘附過程時發(fā)現(xiàn)，對癌癥與心血管疾病的治療或病理研究可以通過癌細(xì)胞和心肌細(xì)胞的粘附過程及其黏彈性變化來反映。

細(xì)胞粘附過程是動態(tài)的，且能反映微環(huán)境變化對細(xì)胞的影響，是研究復(fù)雜活細(xì)胞系統(tǒng)最好的模型之一。事實上，在許多生理和病理條件下，細(xì)胞粘附過程在很多生物過程(如細(xì)胞形態(tài)、生長發(fā)育、免疫反應(yīng)、癌變等)中起著十分重要的作用[7]。細(xì)胞粘附過程也是一個力傳感的過程，涉及細(xì)胞和基質(zhì)之間的相互作用力，反映活細(xì)胞的黏彈性變化，細(xì)胞對力信號的敏感過程是通過細(xì)胞外基質(zhì)、跨膜整合素受體、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和相關(guān)的信號分子所介導(dǎo)的[8-9]。

含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的RGD多肽是整合素與細(xì)胞外基質(zhì)表面配體蛋白相互作用的識別位點，在促進細(xì)胞粘附和細(xì)胞增殖等方面起著重要作用[10]，但關(guān)于RGD濃度如何影響細(xì)胞粘附過程的黏彈性變化鮮有報道。在QCM等細(xì)胞傳感器的相關(guān)研究中，核心技術(shù)是如何將細(xì)胞有效地固定于傳感界面上。細(xì)胞傳感界面的優(yōu)化是制備具有優(yōu)良性能細(xì)胞傳感器的核心技術(shù)。已有報道將RGD固定于QCM傳感界面用于細(xì)胞粘附研究[11-12]，但在促進細(xì)胞粘附過程的同時未考慮抑制細(xì)胞的非特異性粘附。此前，周鐵安課題組[13]采用自組裝技術(shù)將細(xì)胞粘附分子RGDC(Arg-Gly-Asp-Cys)和防止細(xì)胞非特異性粘附的三乙二醇單-11-巰基十一烷基醚(TGME)修飾于金電極表面，制備了致密、穩(wěn)定、對大鼠心肌H9C2細(xì)胞具有特異性粘附的傳感界面。

KRGD(Lys-Arg-Gly-Asp)是在RGD的一端連接了一個含氨基的賴氨酸，氨基端可經(jīng)酰胺化共價耦合與3-巰基丙酸(MPA)中的羧基相連，另一端的RGD則可與細(xì)胞產(chǎn)生粘附作用。鑒于此，作者采用KRGD對QCM金電極表面進行修飾，首先將MPA與TGME混合后自組裝于QCM金電極表面，之后通過1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)將MPA中的羧基與KRGD中含有氨基的賴氨酸經(jīng)化學(xué)耦合而將KRGD固定在金電極上，制備了KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面，研究不同KRGD濃度對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)動態(tài)粘附與黏彈性的影響；然后在最佳KRGD濃度下，用QCM實時監(jiān)測肌球蛋白Ⅱ抑制劑blebbistatin對HUVEC動態(tài)粘附的影響，以推動細(xì)胞傳感技術(shù)的進一步發(fā)展。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

HUVEC，上海通派生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清；濃硫酸、30%雙氧水、無水乙醇(分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；TGME、MPA、EDC、NHS，美國Sigma公司；KRGD，上海生工；青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺溶液，Life Technologies；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)；Millipore Milli-Q超純水。

QCM 922型八通道石英晶體微天平、9 MHz AT切型金電極石英晶體(基底直徑8 mm，電極直徑5 mm)，Seiko-EG&G公司；CO2培養(yǎng)箱，德國Binder公司。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC的培養(yǎng)

HUVEC貼壁培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM/高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃。一般2～3 d傳代一次。

1.2.2 金電極的預(yù)處理

將金電極先用無水乙醇、去離子水清洗，氮氣吹干；然后用Piranha溶液(30%H2O2∶H2SO4=1∶3，體積比，80 ℃)處理30 s；再用去離子水、無水乙醇清洗，氮氣吹干；重復(fù)3次。將無水乙醇滴到金電極上靜置幾分鐘，用滅菌水沖洗，氮氣吹干，備用。

1.2.3 KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面的制備及用于HUVEC的粘附

KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面的制備在常溫(20±5) ℃下進行。將預(yù)處理過的金電極組裝到Teflon井型池中，清洗的一面與Teflon井型池中的溶液接觸，另一面與O型橡膠圈接觸，與Teflon井型池底部形成一空氣室。連接QCM 922通道，置于20 mmol·L-1MPA+1 mmol·L-1TGME(無水乙醇為溶劑)溶液中，過夜(約15～24 h)，吸出溶液，將無水乙醇輕輕打進井型池中，吸出無水乙醇后，用Millipore Milli-Q超純水輕輕沖洗，氮氣吹干。將150 mmol·L-1EDC、30 mmol·L-1NHS(pH=5.5)溶液加入池中，浸泡約60 min后依次用PBS緩沖溶液(pH=5.5)、Millipore Milli-Q超純水沖洗，氮氣吹干。取200 μL濃度(μg·mL-1)分別為0、25、50、75、100的KRGD溶液(PBS為溶劑)加入到金電極表面，靜置1～2 h，得到不同KRGD濃度的KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面。

用PBS緩沖溶液、滅菌水輕輕沖洗，氮氣吹干；加入200 μL HUVEC(約20 000個細(xì)胞)。開啟QCM

實時監(jiān)測HUVEC在KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面上的動態(tài)粘附過程中(0～15 h)的頻率變化(Δf)與動態(tài)電阻變化(ΔR)。

1.2.4 藥物響應(yīng)

用肌球蛋白Ⅱ抑制劑blebbistatin研究KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面的藥物響應(yīng)。在KRGD-MPA/TGME/Au (KRGD濃度為50 μg·mL-1) 傳感界面粘附好20 000個HUVEC得到穩(wěn)定響應(yīng)曲線后，向各通道中同時加入5 μL 50 μmol·L-1blebbistatin，繼續(xù)監(jiān)測其Δf和ΔR，直到響應(yīng)曲線再次趨于穩(wěn)定為止。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面對HUVEC粘附過程中Δf和ΔR的影響

選用5種不同KRGD濃度(0、25、50、75、100，μg·mL-1)的KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面，比較KRGD濃度對20 000個HUVEC粘附過程中Δf和ΔR的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面對HUVEC粘附過程中Δf(a)和ΔR(b)的影響

從圖1可以看出，在不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面上，HUVEC粘附過程中的Δf和ΔR由小到大的順序依次為：0 μg·mL-1<20 μg·mL-1<100 μg·L-1<75 μg·mL-1<50 μg·mL-1，表明KRGD濃度為50 μg·mL-1時，KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面對HUVEC的粘附最強。

2.2 不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面對HUVEC粘附過程中黏彈性指數(shù)(CVI)的影響

細(xì)胞黏彈性是與細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能密切相關(guān)的重要生物物理特性，其大小主要由細(xì)胞骨架決定，在細(xì)胞生長、分化等過程中起著重要作用。用于單細(xì)胞黏彈性

參數(shù)的研究方法較多，如原子力顯微鏡(AFM)已被用于不同細(xì)胞(包括內(nèi)皮細(xì)胞)硬度的測定[14]。用于細(xì)胞群黏彈性測定的方法較為缺乏，QCM由于其無損、動態(tài)監(jiān)測、且可從細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)粘附界面處研究細(xì)胞群的平均黏彈性等特征而成為細(xì)胞群黏彈性研究的重要方法。

本實驗采用細(xì)胞黏彈性指數(shù)CVI(ΔR/Δf)來表征細(xì)胞的黏彈性，CVI越大，細(xì)胞骨架的組織程度越高、細(xì)胞越硬；CVI越小，細(xì)胞越軟[5]。不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面對20 000個HUVEC粘附過程中CVI的影響如圖2所示。

圖2 不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面對HUVEC粘附過程中CVI的影響

由圖2可以看出，當(dāng)KRGD濃度為50 μg·mL-1時，CVI最大，而后依次為75 μg·mL-1、100 μg·

mL-1、25 μg·mL-1，最小為0 μg·mL-1(即裸電極)，與Δf及ΔR變化規(guī)律一致。

2.3 blebbistatin對QCM實時監(jiān)測HUVEC粘附過程的影響

肌球蛋白Ⅱ抑制劑blebbistatin是小分子抑制劑的一種，它能與肌球蛋白和ADP-Pi復(fù)合體優(yōu)先結(jié)合，從而減少磷酸根的釋放[15]。blebbistatin可以抑制哺乳動物動脈平滑肌[16]，阻斷肌動蛋白分離狀態(tài)下的肌球蛋白Ⅱ和防止僵化肌動球蛋白交聯(lián)的特性是其體內(nèi)應(yīng)用的一個很大的優(yōu)勢[17]。因此，本實驗研究了blebbistatin對QCM實時監(jiān)測HUVEC粘附過程的影響。待20 000個HUVEC粘附在KRGD-MPA/TGME/Au(KRGD濃度為50 μg·mL-1)上達到平穩(wěn)后(約24 h)，加入5 μL 50 μmol·L-1blebbistatin來研究其對HUVEC粘附過程的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 blebbistatin對QCM實時監(jiān)測HUVEC粘附過程的影響

從圖3a可以看出，在KRGD濃度為50 μg·mL-1的KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面上加入20 000個HUVEC后，Δf逐漸降低，ΔR逐漸升高，表明HUVEC粘附在了KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面上；待曲線趨于穩(wěn)定后，加入5 μL 50 μmol·L-1blebbistatin(最終濃度為1.22 μmol·L-1)，QCM響應(yīng)信號減弱，Δf上升，ΔR下降。

從圖3b可以看出，在blebbistatin作用下，CVI減小，吸附變?nèi)?、?xì)胞變軟，與Tarantola等[18]研究的加入blebbistatin后細(xì)胞軟化的結(jié)論一致。

2.4 討論

本實驗采用自組裝及化學(xué)耦合技術(shù)將KRGD與MPA、TGME修飾于QCM金電極上，制備了5種不同KRGD濃度的KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面，通過QCM實時監(jiān)測HUVEC在傳感界面上的Δf、ΔR及CVI。當(dāng)KRGD濃度為50 μg·mL-1時，Δf、ΔR、CVI最大，其次為75 μg·mL-1、100 μg·mL-1、25 μg·mL-1，最小為0 μg·mL-1(即裸電極)。因此可認(rèn)為當(dāng)KRGD濃度為50 μg·mL-1時，HUVEC與KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面有很強的粘附作用并使HUVEC得以順利鋪展，粘附效果最佳，表明細(xì)胞應(yīng)力纖維量最多，所搭建的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定、細(xì)胞最硬。這可能是由于在較高KRGD濃度(75 μg·mL-1、100 μg·mL-1)下，HUVEC與KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面的粘附作用由于KRGD的取向受空間位阻影響較50 μg·mL-1KRGD濃度下有所減弱，較裸電極和25 μg·mL-1KRGD濃度下強很多，故Δf、ΔR、CVI處于中間值；與文獻[19]研究的當(dāng)RGD濃度超過一定值后對細(xì)胞已不具備特異性粘附能力的結(jié)論一致。

QCM生物傳感器可用于檢測細(xì)胞骨架改變和動力學(xué)，并且可以對受到細(xì)胞骨架擾動或細(xì)胞附著影響的生物活性藥物或生物大分子進行有價值的篩選[1,20]。本實驗發(fā)現(xiàn)，KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面粘附HUVEC后，在blebbistatin的作用下，細(xì)胞黏彈性減小、細(xì)胞變軟、與傳感界面之間的粘附作用減弱。

3 結(jié)論

用QCM實時監(jiān)測HUVEC在不同KRGD濃度KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面上的動態(tài)粘附過程以及加入肌球蛋白Ⅱ抑制劑blebbistatin后的響應(yīng)變化。結(jié)果表明，當(dāng)KRGD濃度為50 μg·mL-1時，QCM頻率變化Δf、動態(tài)電阻變化ΔR、細(xì)胞黏彈性指數(shù)CVI(ΔR/Δf)最大，表明該條件下HUVEC在QCM表面的粘附最強、顯示出最有組織的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)而最硬；當(dāng)加入肌球蛋白Ⅱ抑制劑blebbistatin后，粘附有細(xì)胞的QCM響應(yīng)信號減弱，細(xì)胞粘附變?nèi)?、?xì)胞變軟。

本實驗所構(gòu)建的KRGD-MPA/TGME/Au傳感界面可以達到保持細(xì)胞活性和穩(wěn)定性的效果，能夠防止細(xì)胞的非特異性粘附。通過不同濃度KRGD修飾的傳感界面對細(xì)胞粘附效果的對比實驗，獲得了最佳KRGD濃度，確保傳感界面對細(xì)胞運動和結(jié)構(gòu)變化等有較高的靈敏度。細(xì)胞黏彈性等關(guān)鍵信息可用于量化藥物的影響、突變或疾病細(xì)胞的結(jié)構(gòu)分析。該研究對推動細(xì)胞傳感技術(shù)的進一步發(fā)展及應(yīng)用于藥物篩選和評估領(lǐng)域具有積極意義。

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Real-Time Monitoring of Dynamic Adhesion of Human Umbilical Vein Endothelial Cells on Self-Assembled Films with Different KRGD Concentrations Using Quartz Crystal Microbalance

XIONG Lun1,2,ZHOU Tie-an1,2*,HUANG Fu-shen1,3,SHEN Hai-bo1,2，HUANG Jing-yuan1,2

(1.InstituteofCellMechanicsandBiosensing,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 2.CollegeofBioscienceandBiotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China; 3.CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China)

CelladhesionpeptideKRGD(Lys-Arg-Gly-Asp),3-mercaptopropionicacid(MPA)andTGMEwhichpreventednon-specificadhesionweremodifiedonquartzcrystalmicrobalance(QCM)Auelectrodebyself-assemblyandchemicalcoupling,andKRGD-MPA/TGME/Ausensinginterfacewasprepared.QCMwasusedforreal-timemonitoringofthedynamicadhesionsofhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVEC)onthemodifiedself-assembledfilmswithdifferentKRGDconcentrations(0μg·mL-1,25μg·mL-1,50μg·mL-1,75μg·mL-1,100μg·mL-1).Resultsindicatedthat,QCMgavethelargestresponsesignalsincludingfrequencychangeΔf,motionalresistancechangeΔR,andcellviscoelasticindexCVI(ΔR/Δf)whenKRGDconcentrationwas50μg·mL-1.SoitwasindicatedtheadhesionofHUVEConQCMsurfacewasthestrongest,andthemostorganizedcytoskeletalstructurewasthehardest.InthepresenceofmyosinⅡinhibitorblebbistatin，ΔfandΔRsignalsofQCMadheredHUVECreducedlargely,cells′adhesionbecameweaker,andcellsbecamesofter.TheresultsdemonstratedthatQCMcouldbeusedtomonitortheadhesionofHUVEConthemodifiedsurfaceswithdifferentKRGDconcentrationsandcell-druginteraction,soastoprovidedynamicinformationaboutcelladhesionstrengthandcellviscoelasticity.

humanumbilicalveinendothelialcell(HUVEC);celladhesion;cellviscoelasticity;quartzcrystalmicrobalance(QCM);KRGD;blebbistatin

國家自然科學(xué)基金面上項目(21275048)，湖南省科技廳重點項目(2013TT1009)

2017-01-04

熊倫(1991-)，女，湖南長沙人，碩士研究生，研究方向：細(xì)胞與分子生物物理學(xué)，E-mail：15211082804@163.com；通訊作者：周鐵安，教授，tieanzhou@hunau.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.008

O647.1

A

1672-5425(2017)06-0036-05

熊倫，周鐵安，黃復(fù)深，等.QCM實時監(jiān)測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在不同KRGD濃度自組裝膜上的動態(tài)粘附[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(6)：36-40.