戊酸雌二醇對(duì)大鼠胎鼠睪丸及睪丸引帶的影響*

張 煒，林 虹，王玉蓮

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 汕頭 515041)

隱睪癥早產(chǎn)兒發(fā)病率約為30%，健康新生兒約為3%，3月時(shí)約為1%。隱睪時(shí)因睪丸長期留在腹腔內(nèi)或腹股溝管里，受體內(nèi)“高溫”的影響，容易造成男性不育[1]。在助孕治療領(lǐng)域中，體外受精-胚胎移植和冷凍胚胎移植中經(jīng)常使用較大劑量的雌激素促進(jìn)子宮內(nèi)膜生長以利胚胎種植，一旦妊娠，持續(xù)用藥至妊娠12周胎盤功能建立后停藥，這就使早孕期處于器官分化發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的胚胎一直暴露在母體循環(huán)中的高雌激素環(huán)境[2-3]。研究顯示，雌激素樣化合物可直接作用于胚胎生殖器官和通過干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響胚胎發(fā)育及性腺發(fā)育，幾乎可引起各種形式的雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育障礙，睪丸小、無精子及尿中促性腺激素增高等統(tǒng)稱為睪丸發(fā)育不全綜合征[4-5]。本課題通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，在早孕期給予大鼠戊酸雌二醇，建立高雌激素狀態(tài)的動(dòng)物模型，觀察娩出的雄性子代出現(xiàn)睪丸發(fā)育不全綜合征的情況，觀察胎鼠睪丸及睪丸引帶外觀，生殖系統(tǒng)的使用功能和結(jié)構(gòu)的影響,探究出睪丸下降不全的相關(guān)因素。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康、性成熟的SD大鼠40只,由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；其中雌性30只,雄性10只,體重180～230 g，喂養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí))，室溫22℃～25℃ ,濕度40%～55%,晝夜周期為12/12 h。

1.2 動(dòng)物模型的建立

大鼠合籠交配，每天早晚兩次檢查雌鼠有無出現(xiàn)陰道栓，并行陰道涂片，以陰道涂片顯微鏡下見到精子確定受孕，孕鼠隨機(jī)分配各組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)醫(yī)學(xué)產(chǎn)品生殖毒性檢測(cè)指導(dǎo)原則，選擇早孕期大鼠給予戊酸雌二醇建立動(dòng)物模型。受孕大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、低劑量組(1.0 mg/kg )、中劑量組(1.5 mg/kg )和高劑量組(2.0 mg/kg )。以上共4組每組至少6只孕鼠,從孕鼠孕6～ 15 d每天1次連續(xù)灌胃給予戊酸雌二醇(法國LYS LEZLANNOY出品，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào):H20030177) ， 戊酸雌二醇溶解于生理鹽水1m，對(duì)照組給生理鹽水1 mL。孕鼠分娩的雄性子代，正常飼養(yǎng)至出生后60 d。處死各組雄性子鼠并取睪丸進(jìn)行觀測(cè)。

1.3 標(biāo)本采集及測(cè)量

摘取睪丸、附睪，電子天平稱重，計(jì)算臟器系數(shù)(睪丸或附睪重量/大鼠體重100)；睪丸放入10%甲醛液中固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，在100光鏡下觀察生精小管的形態(tài)學(xué)變化，每只大鼠睪丸橫切面切片中隨機(jī)選取10個(gè)的生精小管測(cè)其直徑，圖像分析軟件Image-pro-plus 6.0進(jìn)行手動(dòng)選定測(cè)量，測(cè)量方法：生精小管直徑為過中心兩固有層外界之間的距離，生精上皮高度為基膜上界到生精小管生精上皮頂端的距離，取平均值用于分析睪丸發(fā)育情況。

根據(jù)在較高溫度下(32℃～ 35℃ ， 30 min )睪丸不能墜入陰囊判定為隱睪。隱睪評(píng)分：睪丸位于腹腔內(nèi)：3分；腹股溝區(qū)：2分；皮下環(huán)處：1分；陰囊內(nèi)：0分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 存活率

對(duì)照組(A)娩雄性子代18只、低劑量組(B)娩雄性子代17只、中劑量組(C)娩雄性子代19只、高劑量組(D)娩雄性子代17只。各組仔鼠存活率較對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 體重、附睪睪丸重量和臟器系數(shù)

雄性子代的體重、附睪睪丸重量和臟器系數(shù)中、高劑量組與對(duì)照組、低劑量組觀察比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，以高劑量組的系數(shù)為最低。見表1。

表1 對(duì)照組和低、中、高劑量組雄性子代的體重、附睪睪丸重量和臟器系數(shù)

2.3 各組的隱睪發(fā)生率

各組的隱睪發(fā)生率分別為5.5%(2/36)、35.8%(2/34)、34.2%(3/38)， 58.8%(20/34)；對(duì)照組、低劑量組兩組隱睪發(fā)生率對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中、高劑量組組與對(duì)照組對(duì)比，有明顯差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ， 而中、高劑量組之間差異有顯著性(P>0.05)，高劑量組的發(fā)生率為最高。見表2。

表2 對(duì)照組和低、中、高劑量組雄性子代的隱睪評(píng)分

注：單雙側(cè)隱睪為例數(shù)。每側(cè)為雙側(cè)，故此表中除組別項(xiàng)，其他項(xiàng)例數(shù)翻倍。

3 討論

到現(xiàn)在,睪丸下降不全的的病因還不能確定，睪丸下降不全是指睪丸下降障礙，停留在下降過程的途中，未能進(jìn)入陰囊[6]。臨床上也習(xí)慣稱為隱睪癥，是先天性疾病。睪丸下降不全的原因有很多，例如遺傳因素：有大多數(shù)人隱睪病人有家里遺傳的情況，所以遺傳也可能是睪丸下降不全的機(jī)制[7]。隱睪的發(fā)生可能還有其他的因素，跟隨著社會(huì)日新月異的進(jìn)步，科學(xué)醫(yī)療水平都在日益的提高，一定會(huì)找出治療睪丸下降不全的有效方法，從而抑制隱睪這種疾病的發(fā)生；內(nèi)分泌因素：睪丸的下降胎兒睪丸間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生雄激素是要靠母體的促性腺激素，假若促性腺激素不產(chǎn)生下降說明睪丸自身發(fā)育有缺陷，而促使隱睪[8-11]，因?yàn)檠褐写傩韵偌に貪舛确浅８邥r(shí)睪丸下降發(fā)生，當(dāng)母體本身缺少促性腺激素時(shí)，也會(huì)發(fā)生隱睪。器質(zhì)性因素：導(dǎo)致隱睪的器質(zhì)性因素主要有睪丸系帶很短或缺，如睪丸系膜發(fā)生粘連、精索的血管或輸精管太短、睪丸畸形發(fā)育以及陰囊發(fā)育不正常等[12]。雌激素的作用同樣需與其受體結(jié)合后方可發(fā)揮其生物效應(yīng)，在Ivell、Raivio、Emmen、Shono等都發(fā)現(xiàn)了可誘發(fā)睪丸引帶發(fā)育遲緩改變， 可以會(huì)影響雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育并且使正常內(nèi)分泌功能紊亂，使泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)生了畸形。

目前國內(nèi)外對(duì)戊酸雌二醇安全用藥方面的研究主要集中在評(píng)價(jià)其作為避孕藥及絕經(jīng)期激素替代治療方面，而對(duì)子宮內(nèi)早期接觸戊酸雌二醇后對(duì)性成熟期雄性子代生育能力的影響較少關(guān)注,文獻(xiàn)僅見從致死率及畸形率來評(píng)價(jià)戊酸雌二醇的胚胎毒性，而未見評(píng)價(jià)子代成年后的生育能力。我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)戊酸雌二醇在早孕期注射低劑量未觀察到雄性子代的生殖系統(tǒng)發(fā)育有什么異樣，這與我們先前的研究結(jié)果基本一致。然而中劑量以及高劑量的戊酸雌二醇卻顯著引起隱睪的發(fā)生，其中、高劑量組雙側(cè)隱睪的發(fā)生率為29.4%(5/17)，為各組最高。中、高劑量組的隱睪評(píng)分均明顯升高，表明了外源性雌激素對(duì)雄性子代明顯影響睪丸的下降及發(fā)育，高劑量組隱睪下降不全程度最為嚴(yán)重[14-15]。我們推測(cè)： Insl3誘導(dǎo)的睪丸引帶細(xì)胞增生和阻止雄激素的促進(jìn)顱側(cè)懸韌帶退化可以使用外源性雌激素將拮抗雄激素受體，阻止睪丸引帶經(jīng)歷逐漸發(fā)育、生長擴(kuò)張腹股溝管,隨后又逐漸縮短、退化,從而牽引睪丸下降的過程。

對(duì)子宮內(nèi)激素環(huán)境的改變最明顯的是動(dòng)物生殖系統(tǒng)。生殖系統(tǒng)發(fā)育有所改變是由于雄性動(dòng)物在子宮內(nèi)的外源性雌激素的暴露，而且雌激素活性物質(zhì)對(duì)嚙齒動(dòng)物生殖毒性的作用敏感性與特定的胚胎發(fā)育關(guān)鍵時(shí)間相關(guān)。Fisher等采用具有雌激素樣活性的鄰苯二甲酸酯(DBP)誘發(fā)的動(dòng)物模型顯示：給妊娠期母鼠一定劑量的DBP后其不同日齡的雄性子代睪丸重量均明顯低于對(duì)照組，子代成年后約80%出現(xiàn)不育，睪丸發(fā)育不良。

附睪、睪丸的重量是這兩種器官的傳統(tǒng)的定量指標(biāo)，而且睪丸重量與生殖細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān),睪丸重量及睪丸組織病理學(xué)效應(yīng)對(duì)生育力有較大的預(yù)測(cè)價(jià)值。睪丸組織學(xué)方面其量化指標(biāo)包括生精小管直徑和上皮高度， 就辨別生精損壞的程度來說，其價(jià)值要比睪丸重量測(cè)定要大。睪丸在受到毒物作用后，影響到生精過程,必然引起生精上皮細(xì)胞的退化，失去正常的生精相， 使上皮變薄，生精小管內(nèi)精子減少或消失。睪丸的各種病理變化最終都造成生精小管的萎縮，因此，睪丸生精小管管腔直徑和上皮高度的變化，能在一定程度上反映睪丸的損傷情況[16]。

此次研究利用戊酸雌二醇提示睪丸質(zhì)量有所改變，并且發(fā)現(xiàn)了有不同程度發(fā)育缺陷，發(fā)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，生精上皮層次變薄，曲細(xì)精管發(fā)生退行性變化，睪丸不能產(chǎn)生成熟的精子，并且支持細(xì)胞和生精細(xì)胞出也現(xiàn)了故障，從而得出了戊酸雌二醇能對(duì)睪丸的生精細(xì)胞成熟和細(xì)胞發(fā)育有很大影響。大量的戊酸雌二醇使睪丸中的Leydig細(xì)胞大量增多，而且睪丸間質(zhì)組織產(chǎn)生增生。經(jīng)過此次研究發(fā)現(xiàn)戊酸雌二醇影響T的合成和對(duì)AR受體的拮抗作用， 產(chǎn)生抗雄激素效應(yīng)，通過下丘腦-垂體-性腺軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致睪丸Leydig細(xì)胞反應(yīng)性增生。通過實(shí)驗(yàn)里的各組各項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組對(duì)比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明外源性雌激素給藥對(duì)胎鼠性別和身體的發(fā)育沒有顯著的影響。

綜上所述，根據(jù)此次研究證明戊酸雌二醇能使大鼠睪丸下降出現(xiàn)問題，同時(shí)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的能力得到改變睪丸分泌睪酮降低。

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