細(xì)菌對(duì)抗菌肽的抗性及機(jī)理

徐博成 王家俊 丑淑麗 單安山

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030)

細(xì)菌對(duì)抗菌肽的抗性及機(jī)理

徐博成 王家俊 丑淑麗 單安山*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030)

抗菌肽(AMPs)是一類(lèi)廣泛存在于自然界生物體中的小肽類(lèi)物質(zhì)，它是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。AMPs作為傳統(tǒng)抗生素的替代品被廣泛重視，然而細(xì)菌對(duì)于AMPs的抗性如同對(duì)抗生素的耐藥性一樣不容忽視。本文主要從浮游菌、生物膜和信號(hào)調(diào)節(jié)3個(gè)方面闡述細(xì)菌對(duì)于AMPs的抗性及機(jī)理。

細(xì)菌；抗菌肽；浮游菌；生物膜；信號(hào)調(diào)節(jié)；抗性；機(jī)理

由于抗生素的濫用，使得許多細(xì)菌進(jìn)化為耐藥性強(qiáng)的菌株，而抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)憑借其較難產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)，成為傳統(tǒng)抗生素最有潛力的替代品。AMPs多是強(qiáng)陽(yáng)離子性的小分子多肽，通過(guò)結(jié)合在帶有負(fù)電性的細(xì)菌細(xì)胞膜表面，促使膜破碎致死，而細(xì)菌則可以通過(guò)修飾細(xì)菌表面分子、分泌保護(hù)性物質(zhì)、上調(diào)或消除特殊蛋白質(zhì)以及形成生物膜進(jìn)而產(chǎn)生對(duì)AMPs的抗性[1]。由此，根據(jù)耐藥性機(jī)制，可以將細(xì)菌分為單細(xì)菌成因的浮游菌和多細(xì)菌成因的生物膜2類(lèi)。近年來(lái)AMPs耐藥性研究愈發(fā)增多，而大量使用或?yàn)E用AMPs勢(shì)必會(huì)引起同抗生素一樣的嚴(yán)重后果。加深A(yù)MPs耐藥性研究，有助于設(shè)計(jì)出更有成效的AMPs，防止AMPs耐藥性的產(chǎn)生。本文將著重闡述細(xì)菌對(duì)AMPs的抗性及機(jī)理。

1 浮游菌對(duì)AMPs的抗性

兩親性結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是AMPs抗菌功能的關(guān)鍵，而細(xì)菌的細(xì)胞膜表面是AMPs最主要的作用位點(diǎn)(圖1)，浮游菌正是通過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞壁的一系列變化，從而達(dá)到抵抗AMPs的目的。細(xì)胞質(zhì)膜是保護(hù)細(xì)胞內(nèi)容物的物理屏障，而細(xì)胞壁給予細(xì)菌結(jié)構(gòu)支持確保大多數(shù)細(xì)菌的存活。根據(jù)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不同可以將細(xì)菌分為革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，其中革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁包括1個(gè)較厚的肽聚糖層和其他糖類(lèi)，主要由磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)和壁醛酸合成；而革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁則更為復(fù)雜，包括較薄的肽聚糖層、脂蛋白、脂多糖和1個(gè)外膜[2]。對(duì)于AMPs的抗性也多是來(lái)自以上結(jié)構(gòu)的修飾。

1.1 胞外多糖與胞外蛋白

胞外多糖是由革蘭氏陽(yáng)/陰性菌合成并分泌的一種多糖聚合物，多呈陰離子性，當(dāng)共價(jià)連接到細(xì)胞壁時(shí)則被稱(chēng)為莢膜多糖。革蘭氏陽(yáng)性菌胞外多糖大多附著于肽聚糖層，其可以與AMPs結(jié)合，阻礙其進(jìn)一步發(fā)揮作用[4]。

革蘭氏陰性菌，如克雷白氏菌(K.pneumoniae)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，更傾向于釋放胞外多糖到細(xì)胞外，以便于誘捕AMPs，而這種分泌胞外多糖的功能有助于減少細(xì)菌表面的AMPs數(shù)量。此外，有研究表明誘導(dǎo)K.pneumoniae的莢膜多糖變異，會(huì)使其AMPs更易感，并且更容易與莢膜多糖結(jié)合[5-6]。

圖1 抗菌肽作用機(jī)理Fig.1 The action mechanism of AMPs[3]

胞外蛋白則通過(guò)誘捕和降解AMPs使細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)AMPs的抗性。細(xì)菌用不同種蛋白酶如金屬、絲氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶，這些蛋白酶分泌出亦或是固定在細(xì)菌表面，用來(lái)降解AMPs并保護(hù)其靶位點(diǎn)[7]。停乳鏈球菌類(lèi)馬亞型(Streptococcusdysgalactiaesubsp.equisimilisa)可以合成與鏈球菌補(bǔ)體抑制劑(streptococcal inhibitor of complement,SIC)和鏈球菌補(bǔ)體抑制劑遠(yuǎn)親(distantly related to SIC,DRS)同源的蛋白DrsG，其可以被分泌到細(xì)胞外并與LL-37(一種AMPs)結(jié)合，從而抑制其活性[8]。

1.2 細(xì)胞膜修飾

細(xì)菌細(xì)胞膜包含幾種磷脂，如磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、磷脂酰甘油(phosphatidyglycerol，PG)和心磷脂(cardiolipin，CL)[9]。調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的組分不僅可以改變膜表面電性，還可以改變膜的流動(dòng)性與剛性。由此可見(jiàn)，細(xì)菌細(xì)胞膜組分的調(diào)節(jié)是細(xì)菌存活的關(guān)鍵，也是對(duì)AMPs抗性的要點(diǎn)。

可將細(xì)胞膜分成2種模型：1)只包含10%CL的膜，該膜可以在AMPs的作用下有效防止膜移位和小孔的形成。對(duì)青霉素具有抗性的金黃色葡萄球菌(S.aureus)菌株利用存在于膜內(nèi)的適應(yīng)因子，通過(guò)多種抗性因子(multiple peptide resistancefactor，mrpF)、心磷脂合酶(cardiolipin synthase，cls)、磷脂酰甘油合酶(phosphatidylglycerolsynthase，pgsA)并在其他機(jī)制協(xié)同作用下修飾膜表面使其呈現(xiàn)正電性，對(duì)AMPs產(chǎn)生抗性[10]。2)存在氨酰磷脂[賴(lài)氨酸(Lys)-PE、谷氨酰胺(Gln)-PE]的膜，這是一種常見(jiàn)的發(fā)病菌修飾脂質(zhì)雙分子層從而抵抗AMPs的方式[11]。

可將脂質(zhì)修飾劃分成2類(lèi)：1)PG修飾。在革蘭氏陽(yáng)性菌中，基因編碼大量的膜蛋白mrpF，為了增加賴(lài)氨酸和丙氨酸的含量，使PG去合成賴(lài)氨酰磷脂酰甘油(lysyl-phosphatidylglycerol，LPG)和丙氨酰磷脂酰甘油(alanyl-phosphatidylglycerol，APG)，同時(shí)傳遞這些物質(zhì)到外部[12]。與易感菌株相比，mrpF功能性突變并且包含大量LPG的S.aureus菌株被發(fā)現(xiàn)對(duì)AMPs具有更高的抗性，并且其表面電荷降低[10]。2)脂肪酸成分改變。減少支鏈脂肪酸含量可能增加糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)細(xì)胞膜的剛性，并伴隨正電荷內(nèi)容物的增加，從而阻止AMPs的穿透[13]。同樣，增加S.aureus細(xì)胞膜中不飽和、支鏈和氫化脂肪酸的含量，可以使膜具有一個(gè)較高的流動(dòng)性，可阻止AMPs的聚集[14]。

1.3 細(xì)胞壁修飾

1.3.1 革蘭氏陰性菌

在革蘭氏陰性菌的表面，主要的修飾場(chǎng)所位于脂多糖(LPS)和脂低聚糖(lipooligosaccharides，LOS)，LPS是由脂質(zhì)A、LPS核心以及O型抗原組成的，帶有負(fù)電荷(圖2)。LPS的結(jié)構(gòu)不僅可以維持細(xì)胞平衡，也可以形成物理屏障以及抵御AMPs，一些LPS的修飾依賴(lài)于細(xì)菌種類(lèi)以及環(huán)境因素，以此產(chǎn)生對(duì)AMPs的抗性，而眾多修飾方式中以脂質(zhì)A的修飾最為主要。

1.3.1.1 脂質(zhì)A修飾

對(duì)于脂質(zhì)A的修飾種類(lèi)，可以分為4類(lèi)：1)增添氨基糖。氨基糖通常為氨基樹(shù)膠醛糖、葡糖糖胺和半乳糖胺。如鮑氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)、新兇手弗朗西絲氏菌(Francisellanovicida)和百日咳桿菌(Bordetellapertussis)通過(guò)添加半乳糖胺和葡糖糖胺對(duì)脂質(zhì)A進(jìn)行修飾。而在Bordetellapertussis的脂質(zhì)A中添加葡糖糖胺則可以對(duì)多黏菌素B(polymyxin B)、黏桿菌素(colistin)、LL-37、indolicidin、HHC-10和CP28產(chǎn)生抗性[15]。2)磷酸化和氫化。lpxF基因編碼的一種酶可以除去擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)LPS的脂質(zhì)A上的一個(gè)負(fù)電荷磷酸鹽。這種電荷的轉(zhuǎn)變使得正電荷AMPs較難結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞膜上并破壞它。這使得在構(gòu)建細(xì)胞膜時(shí)必要的磷酸鹽在細(xì)菌成熟時(shí)變?yōu)榱硕嘤辔铮纱水a(chǎn)生對(duì)AMPs的抗性[16]。3)酰化和脫?；?。在脂質(zhì)A上添加?；徽J(rèn)為是一種有效的對(duì)AMPs產(chǎn)生抗性的方式，pagP基因可編碼添加酰基到脂質(zhì)A上，pagP基因突變的副百日咳博德特菌(Bordetellaparapertussis)將會(huì)比野生菌株對(duì)C18G更加易感，而P.aeruginosa可以對(duì)C18G產(chǎn)生抗性，但是對(duì)polymyxin B并不明顯[17-18]。而且pagP基因可以維持膜流動(dòng)性的平衡，修復(fù)被AMPs破壞的膜，這是另一種產(chǎn)生AMPs抗性的方式[19]。4)增加甘氨酸。almEFG操縱子可以將甘氨酸加入到霍亂弧菌(Vibriocholerae)的脂質(zhì)A上，這可以對(duì)多黏菌素(polymyxin)產(chǎn)生抗性，而其明確原理尚未清楚[20]。

1.3.1.2 O型抗原

當(dāng)伯克霍爾德菌(Burkholderia)與豆蟲(chóng)腸道內(nèi)的點(diǎn)蜂緣蝽(Riptortuspedestris)共生繁殖時(shí)，失去了LPS的O型抗原會(huì)增加宿主AMPs對(duì)其的易感程度[21]。腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellaentericaserovar Enteritidis)中參與編譯O型抗原的ΔwbaV基因突變，使得其對(duì)AMPs的易感程度提高[22]。然而，就目前的研究來(lái)看，并沒(méi)有確鑿的證據(jù)說(shuō)明LPS的O型抗原的存在和長(zhǎng)度一定就對(duì)AMPs抗性產(chǎn)生影響。

1.3.2 革蘭氏陽(yáng)性菌

革蘭氏陽(yáng)性菌沒(méi)有外膜的保護(hù)，所以細(xì)胞壁承受全部的外界壓力以及抵御如AMPs和抗生素等有害分子的入侵。革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中含有大量的磷壁酸，磷壁酸又可分為壁磷壁酸(wall teichoicacid，WTA)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)2種，前者不深入質(zhì)膜，其末端以磷酸二酯鍵與肽聚糖的N-乙酰胞壁酸殘基相連，而脂磷壁酸橫跨過(guò)肽聚糖層，以其末端磷酸共價(jià)連接于質(zhì)膜中糖脂的寡糖基部分。

革蘭氏陽(yáng)性菌中LTA的修飾被認(rèn)為是普遍的對(duì)AMPs產(chǎn)生抗性的方式，尤其是LTA的D-丙氨酰化，而其他的LTA的修飾如加入膽堿磷酸和糖基化并未證實(shí)可對(duì)AMPs產(chǎn)生抗性[23]。dlt操縱子負(fù)責(zé)編碼D-丙氨酸的載體蛋白連接酶，該酶可將D-丙氨酸加到磷壁酸上，這可以增加細(xì)菌表面的正電荷，提高對(duì)于AMPs的抗性[24]。此外，產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的WTA中含有L-鼠李糖(L-rhamnosylation)，其可以通過(guò)形成空間阻礙滯后AMPs與膜之間的作用，促進(jìn)對(duì)AMPs抗性的形成[25]。

2 生物膜對(duì)AMPs的抗性

2.1 生物膜的成因與組成

細(xì)菌已經(jīng)演化出形成多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的能力，在臨床環(huán)境中，細(xì)菌被暴露在各種不利條件下，如抗菌劑、營(yíng)養(yǎng)限制、厭氧和熱休克等，這些條件可以刺激細(xì)菌的應(yīng)激反應(yīng)，這和其他防御機(jī)制協(xié)同可以形成生物膜，生物膜可以使細(xì)菌在惡劣的環(huán)境中得以存活。生物膜對(duì)于宿主的免疫機(jī)制和抗菌劑來(lái)說(shuō)都是很難清除的，正因如此，生物膜是對(duì)AMPs產(chǎn)生抗性的主要因素之一[26]。從浮游狀態(tài)過(guò)渡到生物膜是環(huán)境變化引起多重調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)異常的結(jié)果，從而在一個(gè)傳感壓力信號(hào)作用下，浮游細(xì)胞將會(huì)接觸一個(gè)表面形成生物膜，以便于有能力抵抗環(huán)境變化帶來(lái)的影響[27-28]。

PG:磷脂酰甘油 phosphatidylglycerol；DPG:雙磷脂酰甘油 bisphosphatidylglycerol；Acyl-PG:?；字８视?acylphosphatidylglycerol；Lys-PG:賴(lài)氨酸磷脂酰甘油 lysine phosphatidylglycerol；Ala-PG:丙氨酸磷脂酰甘油 alanyl phosphatidylglycerol。

圖2 革蘭氏陰性菌外膜(腸道沙門(mén)氏菌)

Fig.2 Gram negative bacteria outer membrane (S.enterica)[1]

生物膜是由細(xì)胞外基質(zhì)、特定的多糖、蛋白質(zhì)、水通道和胞外DNA(eDNA)組成[29]。其中胞外聚合物(extracellular polymeric substance，EPS)作為生物膜基質(zhì)，在生物膜內(nèi)部的通道允許水、空氣以及養(yǎng)分通過(guò)[30]。EPS的組分：1)胞外多糖。胞外多糖是從胞內(nèi)或胞外合成并分泌到外部環(huán)境由糖殘基組成的高分子聚合物，它們呈線性或支長(zhǎng)鏈連接貼在細(xì)胞表面并向外伸出形成巨大的網(wǎng)絡(luò)，胞外多糖作為骨架使其他碳水化合物、蛋白質(zhì)、核酸和脂類(lèi)附著[31]。2)胞外蛋白(extracellular proteins)。胞外蛋白是另一種主要的EPS組分，其可以附著在細(xì)胞和胞外多糖的表面，有助于生物膜的形成和穩(wěn)固。3)eDNA。eDNA是由溶解細(xì)胞(lyzed cells)分泌的，是生物膜附著的關(guān)鍵，它的負(fù)電荷在原有的附著物里呈現(xiàn)斥力，但是當(dāng)細(xì)菌和表面之間只有幾納米時(shí)，它將與下層表面受體相互作用促進(jìn)黏附[32]。

2.2 生物膜的形成過(guò)程

形成生物膜的前提是細(xì)菌與表面足夠近，當(dāng)細(xì)菌接近表面時(shí)具有引力與斥力，距表面10～20 nm時(shí)，細(xì)菌表面的負(fù)電荷與環(huán)境表面的負(fù)電荷相互排斥，但是這種斥力被細(xì)菌和表面之間的范德華力所克服，同時(shí)鞭毛和菌毛可以幫助細(xì)菌機(jī)械的附著于表面[33]。一旦生物膜成熟，隨著菌群的發(fā)展，一些細(xì)胞從原有的固著結(jié)構(gòu)分離出去，這個(gè)階段被稱(chēng)為傳播，它是生物膜完成循環(huán)的關(guān)鍵[34]。生物膜的形成可以分為3個(gè)階段：附著、成熟和傳播。

附著可以分為2個(gè)階段，不可逆附著與可逆附著。不可逆附著的生物膜可以抵抗更強(qiáng)烈的物理和化學(xué)的侵襲，在可逆附著中，鞭毛和菌毛介導(dǎo)的機(jī)動(dòng)性十分重要，鞭毛是細(xì)菌和表面最初接觸的關(guān)鍵，而菌毛則可以使細(xì)菌聚集在一起形成菌落[35]。

成熟的生物膜由于種種原因引發(fā)生物膜的分離傳播，原因可能是缺乏營(yíng)養(yǎng)、激烈的競(jìng)爭(zhēng)和過(guò)度生長(zhǎng)的菌群等，傳播可能發(fā)生在部分或整個(gè)生物膜上，釋放浮游菌促進(jìn)其在其他位點(diǎn)上形成新的生物膜[34]。

2.3 生物膜對(duì)AMPs的抗性機(jī)理

AMPs抑制或清除生物膜的方式可以分為以下2類(lèi)[36]。1)當(dāng)AMPs濃度等于或高于最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)時(shí)，AMPs可以通過(guò)殺死浮游菌阻止生物膜形成，也可殺死生物膜分離的細(xì)菌，同樣可以通過(guò)殺死生物膜內(nèi)部細(xì)菌減少或根除生物膜。2)當(dāng)AMPs濃度低于MIC時(shí)：a.干擾生物膜附著。可通過(guò)AMPs結(jié)合在材料表面、細(xì)菌表面或EPS組分來(lái)抑制或阻止生物膜的生成；b.干擾基因表達(dá)。通過(guò)干擾修飾、下調(diào)參與基質(zhì)合成的基因表達(dá)、其他基因調(diào)節(jié)異?？刂粕锬ど铑?lèi)型，以及針對(duì)信號(hào)分子如嚴(yán)禁反應(yīng)的ppGpp。而生物膜則通過(guò)結(jié)構(gòu)障礙和誘導(dǎo)阻礙對(duì)AMPs產(chǎn)生抗性。

生物膜比浮游菌具有對(duì)抗菌劑和宿主免疫系統(tǒng)分泌的活性因子更強(qiáng)的抗性，據(jù)估計(jì)，生物膜對(duì)AMPs的抗性是浮游菌的10 000倍[29]。然而細(xì)菌對(duì)于AMPs的抗性機(jī)理并沒(méi)有像其他抗菌劑那樣研究的那么透徹，此外，也沒(méi)有特定的細(xì)菌對(duì)于AMPs抗性的機(jī)理被發(fā)現(xiàn)，僅僅是一些假設(shè)的機(jī)理被提出(圖3)。生物膜對(duì)AMPs產(chǎn)生抗性的途徑可分為以下3類(lèi)。1)結(jié)構(gòu)障礙：包括胞外基質(zhì)、不均質(zhì)性菌群和外排泵；2)基因控制：包括群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)、環(huán)二鳥(niǎo)苷酸[bis-(3’—5’)-cyclic diguanosine monophosphate，c-di-GMP]和小RNAs(small RNAs,sRNAs)；3)信號(hào)調(diào)節(jié)：包括雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(two-component regulatory system，TCS)。其中基因控制與信號(hào)調(diào)節(jié)可視之為誘導(dǎo)阻礙。

圖3 生物膜對(duì)AMPs抗性機(jī)理Fig.3 Mechanism of biofilms resistance to AMPs[26,37]

2.3.1 結(jié)構(gòu)障礙

EPS：以P.aeruginosa為例，P.aeruginosa會(huì)合成并釋放3種胞外多糖，分別命名為藻酸鹽(alginate)、富葡萄糖多糖(glucose rich polysaccharide，Pel)以及戊多糖(pentasaccharide，Psl)，它們可以使得生物膜更加穩(wěn)固，藻酸鹽可以和養(yǎng)分與水相互作用并且提供養(yǎng)分到生物膜，而Pel和Psl則起到支撐生物膜結(jié)構(gòu)的功能[38]。而P.aeruginosa的eDNA則可以通過(guò)螯合陽(yáng)離子對(duì)AMPs產(chǎn)生抗性，否則將會(huì)對(duì)生物膜的結(jié)構(gòu)功能以及PhoPQ和PmrAB調(diào)節(jié)因子的誘導(dǎo)作用產(chǎn)生影響[39]。由此可見(jiàn)，胞外多糖多以隔離的方式抵抗AMPs，而eDNA則是通過(guò)與其電性不同的AMPs結(jié)合抵抗AMPs。

不均質(zhì)性菌群：生物膜菌群包括處在不同生長(zhǎng)時(shí)期的不均質(zhì)性細(xì)菌，而這些細(xì)菌的差異將會(huì)按照氧氣和養(yǎng)分的梯度劃分，以此判定細(xì)菌應(yīng)該存在于生物膜的表面還是深層。新陳代謝旺盛的細(xì)菌處于生物膜的表面，而養(yǎng)分與氧氣被掠奪的細(xì)菌則處于生物膜的深層，它們?cè)诒┞队诓煌NAMPs時(shí)產(chǎn)生不同的嚴(yán)禁反應(yīng)[26]。在不均質(zhì)性菌群里，有一類(lèi)可以產(chǎn)生顯著抗性的細(xì)胞就是持留細(xì)胞，持留細(xì)胞在生物膜內(nèi)的數(shù)量遠(yuǎn)多于浮游菌。持留細(xì)胞生長(zhǎng)速度幾近于零，AMPs對(duì)其的效果也幾乎沒(méi)有，因此持留細(xì)胞可以作為細(xì)菌的存儲(chǔ)器，一旦抗菌壓力消失又可以重新生長(zhǎng)。TN-5可以有效抵抗P.aeruginosaPDO300的持留細(xì)胞，而不是其生物膜[40]。持留細(xì)胞是否能轉(zhuǎn)移AMPs對(duì)于生物膜的殺傷還需進(jìn)一步研究。

外排泵：外排泵對(duì)于AMPs的抗性可以分為浮游菌與生物膜2個(gè)時(shí)期，但是外排泵在生物膜中比在浮游菌中起更大作用，排外泵可以將AMPs等抗菌劑排出細(xì)菌以及生物膜。排外泵有6個(gè)家族，分別為ABC、MFS、MATE、SMR、RND和DMT[41]。其中只有ABC利用ATP作為能源將AMPs排出，其他排外泵則依靠電化學(xué)性質(zhì)將AMPs排出。

2.3.2 基因控制

生物膜的生成與傳播由基因與環(huán)境信號(hào)所調(diào)控。現(xiàn)在所知道的生物膜主要的調(diào)節(jié)因子有QS、c-di-GMP和sRNAs[42]。1)QS：當(dāng)細(xì)菌密度達(dá)到一定程度時(shí)，細(xì)菌會(huì)分泌出一種自產(chǎn)的信號(hào)小分子，稱(chēng)之為自誘導(dǎo)物(autoinducers)，當(dāng)自誘導(dǎo)物濃度達(dá)到閾值時(shí)，靶基因?qū)?huì)對(duì)生物膜進(jìn)行調(diào)控，而且QS還可以調(diào)控eDNA、凝集素和生物表面活性劑的生成。研究發(fā)現(xiàn)，椰稙伯克霍爾德菌(B.cenocepacia)的QS調(diào)控大量的表面蛋白、凝集素和eDNA的表達(dá)[43]。2)c-di-GMP：作為一種第二信使調(diào)控胞外多糖、表面蛋白的合成以及生物膜流動(dòng)性，有2類(lèi)酶控制c-di-GMP在細(xì)菌中的含量，分別是DGGs和CGDEF[44]。P.aeruginosa的c-di-GMP通常包括5個(gè)部分，分別是環(huán)境信號(hào)感受器、涉及c-di-GMP合成與分解的酶、具體效應(yīng)(由c-di-GMP調(diào)控蛋白或核糖開(kāi)關(guān)變構(gòu))、靶位點(diǎn)(DNA、酶和分子結(jié)構(gòu))以及合成輸出[45]。3)sRNAs：是非編碼小分子RNA包括核糖開(kāi)關(guān)，參與細(xì)菌基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，參與一部分代謝途徑、壓力適應(yīng)以及發(fā)病機(jī)理[46]。現(xiàn)在研究較為清晰的是P.aeruginosa生物膜中的基因控制，詳見(jiàn)表1。

表1 P. aeruginosa生物膜中的基因控制Fig.1 Genetic control of P. aeruginosa biofilm[42]

3 信號(hào)調(diào)節(jié)

TCS包括組氨酸蛋白激酶(histidine kinase，HK)和應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(response regulator，RR)。HK是一個(gè)傳感器蛋白，通常由N端的配體結(jié)合域和C端的激酶結(jié)構(gòu)域組成。信號(hào)傳遞是通過(guò)磷?；霓D(zhuǎn)移，即一個(gè)特定的組氨酸殘基從ATP轉(zhuǎn)移到HK上，隨后HK將磷?；鶑慕M氨酸殘基轉(zhuǎn)移到RR上的天冬氨酸殘基，這種磷酸激活RR的活動(dòng)被視為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[47]。

參與AMPs抗性的TCS可以分為4類(lèi)。1)PhoPQ TCS：普遍存在于鼠傷寒沙門(mén)氏菌(S.typhimurium)中，PhoQ作為感受蛋白激酶，用于識(shí)別一些低水平的刺激如鎂離子、酸性pH和AMPs(polymyxin B、C18G、LL-37和protegrin)，每一個(gè)刺激都會(huì)促進(jìn)不同水平PhoP調(diào)控基因的表達(dá)[48]。在S.thyphimurium中PhoPQ TCS可控制PgtE的分泌，從而對(duì)AMPs產(chǎn)生抗性[49]。2)PmrAB TCS：多存在于S.thyphimurium、大腸埃希氏菌(E.coli)、K.pneumoniae、鼠疫耶爾森菌(Y.pestis)、鼠類(lèi)檸檬酸桿菌(C.rodentium)和P.aeruginosa中，PmrB可以感知到高濃度的鐵離子、鎂離子、弱酸pH和陽(yáng)離子AMPs[50]。PmrAB在抵抗polymyxin B有著較好的效果，易獲得黏菌素抗性菌株[51]。3)CsrRS TCS：存在于A群鏈球菌(group AStreptococcus)中，CraS作為感受蛋白激酶可以識(shí)別LL-37、RP-1和polymyxin B[52]。此外，CsrRS TCS還可以通過(guò)增加甘氨酸控制Vibriocholerae的LPS修飾，CraS通過(guò)直接結(jié)合在almEFG操縱子的調(diào)節(jié)區(qū)域促進(jìn)其調(diào)控[53]。4)GacSA TCS：存在于P.aeruginosa、S.thyphimurium，可促進(jìn)生物膜的生成[38]。

TCS往往還存在交聯(lián)對(duì)話(cross-talk)，在E.coli中由PrmD介導(dǎo)的PhoPQ TCS和PrmAB TCS發(fā)生交聯(lián)對(duì)話，但是活化PrmD不依賴(lài)PhoP/PhoQ，這個(gè)展現(xiàn)了TCS的復(fù)雜過(guò)程[54]。此外，TCS可以與外排泵協(xié)同作用，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中有一個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)稱(chēng)之為肽感應(yīng)與排毒分子(peptide sensing and detoxificationmodules，PSD)，這是由TCS識(shí)別AMPs和ABC外排AMPs協(xié)同的結(jié)果[55]。

在信號(hào)調(diào)節(jié)還包括如下3個(gè)部分。1)嚴(yán)禁反應(yīng)：是細(xì)菌在貧養(yǎng)環(huán)境(如缺少氨基酸)中生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成及其他一些代謝活性被關(guān)閉的現(xiàn)象，其中ppGpp是介導(dǎo)嚴(yán)禁反應(yīng)的關(guān)鍵，其可以誘導(dǎo)毒素抗毒素反應(yīng)(toxin-antitoxin，TA)來(lái)控制細(xì)菌持留現(xiàn)象[56]。(p)ppGpp通過(guò)Obg與毒素HokB的轉(zhuǎn)錄激活相聯(lián)系，Obg通過(guò)誘導(dǎo)HokB的表達(dá)可以在P.aeruginosa生物膜中控制持留，同時(shí)HokB水平的提高會(huì)引起生物膜的兩極化與休眠[57]。2)TA模型：TA模型是誘導(dǎo)持留現(xiàn)象的關(guān)鍵，而第2類(lèi)TA模型通常由2種蛋白組成，可以抑制細(xì)胞重要功能的毒素和由毒素組成并使毒素失活的抗毒素，在應(yīng)激反應(yīng)中抗毒素被降解成游離的毒素，而毒素可以阻礙DNA轉(zhuǎn)錄翻譯、AMPs或細(xì)胞壁的合成[41]。3)SOS反應(yīng)：可以修復(fù)受損的DNA，防止AMPs使細(xì)菌關(guān)鍵基因發(fā)生突變，以此對(duì)AMPs產(chǎn)生抗性。

4 小 結(jié)

革蘭氏陽(yáng)性菌多以較厚的肽聚糖層和改變表面電性抵抗AMPs的侵入，還會(huì)分泌一些蛋白酶或分子附著在細(xì)菌表面消除或減少AMPs。革蘭氏陰性菌主要通過(guò)外膜修飾產(chǎn)生對(duì)AMPs的抗性。此外，細(xì)菌還可以分泌囊泡或胞外多糖、胞外蛋白來(lái)誘捕AMPs，外排泵同樣會(huì)阻止AMPs接近細(xì)菌細(xì)胞膜。浮游菌達(dá)到一定菌群數(shù)時(shí)將會(huì)形成生物膜，所產(chǎn)生的誘導(dǎo)阻礙與結(jié)構(gòu)障礙將會(huì)對(duì)AMPs產(chǎn)生更大的抗性。目前細(xì)菌對(duì)AMPs抗性的研究還只停留在實(shí)驗(yàn)室階段，而大量臨床試驗(yàn)證明AMPs所引起的細(xì)菌耐受性與傳統(tǒng)抗生素相比輕微的多。因此AMPs作為新一代抗菌藥物仍具有廣闊的前景，但對(duì)其將來(lái)出現(xiàn)耐藥性的可能性也應(yīng)引起足夠的重視。只有從AMPs抑菌機(jī)理和細(xì)菌對(duì)AMPs抗性機(jī)理2個(gè)方面綜合考慮，才能設(shè)計(jì)出高效抗菌的AMPs，在投入生產(chǎn)時(shí)要嚴(yán)加控制大規(guī)模使用與濫用，這樣才能揚(yáng)長(zhǎng)避短造福人類(lèi)。

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*Corresponding author, professor, E-mail: asshan@neau.edu.cn

(責(zé)任編輯 菅景穎)

Bacteria Resistance to Antimicrobial Peptides and It’s Mechanism

XU Bocheng WANG Jiajun CHOU Shuli SHAN Anshan*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

Antimicrobial peptides (AMPs), are a class of small peptides that widely exist in many creatures in nature, and they are essential components of the innate immune system. AMPs, as a potential alternative to the traditional antibiotics, gain more extensive attention; however, the resistance of bacteria to AMPs as well as to antibiotics should not be ignored. This review summarized the resistance of bacteria to AMPs and it’s mechanism from three aspects of planktonic bacteria, biofilm and signal regulatory.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(6)：1874-1883]

bacteria; antibacterial peptides; planktonic bacteria; biofilm; signal regulatory; resistance; mechanism

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.06.008

2016-12-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31472104，31672434)；東北農(nóng)業(yè)大學(xué)SIPT項(xiàng)目(201610224035)

徐博成(1996—)，男，黑龍江哈爾濱人，本科生，動(dòng)物科學(xué)專(zhuān)業(yè)。E-mail: xubocheng1996@163.com

*通信作者:單安山，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail： asshan@neau.edu.cn

S816.7

A

1006-267X(2017)06-1874-10