高效液相色譜法測(cè)定八寶粥罐頭中乙二胺四乙酸二鈉含量的不確定度評(píng)定

劉四磊，趙 允，戴絢麗，吳 平

杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司 (杭州 310018)

高效液相色譜法測(cè)定八寶粥罐頭中乙二胺四乙酸二鈉含量的不確定度評(píng)定

劉四磊，趙 允，戴絢麗，吳 平

杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司 (杭州 310018)

根據(jù)JJF1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》的原理與方法，建立了高效液相色譜法測(cè)定八寶粥罐頭食品中乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)含量的測(cè)量不確定度評(píng)定的數(shù)學(xué)模型。對(duì)數(shù)學(xué)模型中各不確定度分量的來(lái)源進(jìn)行分析、量化和合成。當(dāng)取樣量為2.0 g時(shí)，其測(cè)定的乙二胺四乙酸二鈉含量為(162.600±3.578) mg/L。最終結(jié)果的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品處理過(guò)程中回收率及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立引起。整體評(píng)定方法清晰合理，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，可為實(shí)驗(yàn)室在該檢測(cè)過(guò)程中進(jìn)一步提高檢測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性和一致性作參考。

乙二胺四乙酸二鈉；不確定度；液相色譜；八寶粥罐頭

乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)具有很高的穩(wěn)定常數(shù)，能夠與絕大多數(shù)金屬離子在微劑量下發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)形成穩(wěn)定的化合物，能消除金屬離子或由金屬離子誘導(dǎo)產(chǎn)生的破壞食品感官性能的影響[1]。在GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定其作為穩(wěn)定劑、凝固劑、抗氧化劑、防腐劑，允許使用于果醬，果脯、腌制蔬菜、罐頭、飲料等9類食品中[2]。利用EDTA-2Na較強(qiáng)的絡(luò)合作用，可有效阻止或延緩食品褪色、氧化、變質(zhì)，與防腐劑能表現(xiàn)出理想的協(xié)同作用，具有良好的抗菌活性[3]。然而過(guò)多的攝入EDTA-2Na會(huì)導(dǎo)致人體微量元素的損失，從而誘發(fā)一系列的疾病，因此，國(guó)內(nèi)外對(duì)EDTA-2Na制定了嚴(yán)格的限量要求，每日允許攝入量為0～205 mg/kg。我國(guó)在雜糧罐頭食品中規(guī)定其最大使用量不得超過(guò)250 mg/kg[2]。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于食品中EDTA-2Na的檢測(cè)方法有很多，主要有反相-高效液相色譜法(RP-HPLC)[4]、氣相色譜法[5]、離子色譜法[6]、分光光度法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS)[9]。其中HPLC法檢測(cè)過(guò)程中較多文獻(xiàn)采用CuCl2作為衍生化試劑，但和EDTA-2Na絡(luò)合后產(chǎn)物并不穩(wěn)定，尤其是對(duì)樣品基質(zhì)干擾較大的罐頭類食品，當(dāng)基質(zhì)中含有Fe3+時(shí)檢測(cè)結(jié)果將不準(zhǔn)確，難以滿足限量要求[10]。因此，有必要研究復(fù)雜基質(zhì)類食品中EDTA-2Na的檢測(cè)方法，來(lái)滿足食品添加劑中規(guī)定的限量要求。

不確定度是指由于測(cè)量誤差的存在，造成測(cè)量值不能被確定的程度，是衡量測(cè)量結(jié)果質(zhì)量可靠性和準(zhǔn)確性的重要參數(shù)[11]。通過(guò)對(duì)不確定度的評(píng)定，一方面可以給出測(cè)量結(jié)果的可信程度，另一方面，可以使測(cè)量結(jié)果在國(guó)際和國(guó)內(nèi)不同檢測(cè)機(jī)構(gòu)間進(jìn)行量值比對(duì)和實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)共享。GB/T 27025—2008《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》指出，當(dāng)檢測(cè)結(jié)果處于標(biāo)準(zhǔn)要求的臨界值，有可能判定被檢產(chǎn)品不合格時(shí)，應(yīng)給出測(cè)量不確定度。目前，有關(guān)食品中EDTA-2Na的測(cè)量不確定度評(píng)定，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文根據(jù)JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》要求，通過(guò)分析檢測(cè)過(guò)程中影響檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性的主要影響因素，評(píng)定測(cè)定過(guò)程中不確定度的來(lái)源，建立了HPLC測(cè)定八寶粥罐頭食品中EDTA-2Na含量的不確定度評(píng)定方法。旨在為食品企業(yè)測(cè)定EDTA-2Na含量進(jìn)行質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈(色譜純)，德國(guó)Merck 公司；10%四丁基氫氧化銨(分析純)，上海展云化工；三氯化鐵(分析純)，天津科密歐化學(xué)試劑；EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；磷酸(分析純)，南京奧佳化工。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters HPLC(配有四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器及Empower 3化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國(guó)Waters公司；Beckman Avanti J-26XP 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman；Milli-Q Advantage A10超純水機(jī)，美國(guó)密理博公司；Sartorius電子天平(CP225D)，德國(guó)賽多利斯公司；IKA T25組織搗碎機(jī)，德國(guó)IKA公司。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：稱取1.15 g磷酸二氫銨，加水溶解至900 mL，加入8 mL 10%四丁基氫氧化銨溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾后加100 mL的乙腈，用磷酸調(diào)pH至2.42；流速：0.7 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.4 試劑與標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確 0.1 gEDTA-2Na固體標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，得濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，此溶液轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)液瓶中4 ℃下儲(chǔ)存。

EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：分別吸取 50、100、200、400、800、1000 μL的EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL 容量瓶中，加入1 mL濃度為0.02 mol/L的三氯化鐵溶液，混合均勻，于超聲條件下超聲20 min，冷卻至室溫后，用水定容至刻度，充分混合均勻后，過(guò)0.45 μm濾膜，供上機(jī)檢測(cè)。

1.5 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.0 g左右經(jīng)均質(zhì)器粉碎混勻的八寶粥罐頭樣品，加4 mL水稀釋后加入1 mL濃度為0.02 mol/L的三氯化鐵溶液，混合均勻，于超聲條件下超聲20 min，冷卻至室溫后，用水定容至刻度，充分混合均勻后，以8 000 r/min離心5 min，過(guò)0.45 μm濾膜，供上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

本實(shí)驗(yàn)中，八寶粥罐頭中EDTA-2Na含量的測(cè)量數(shù)學(xué)模型：

式中：X為樣品中EDTA-2Na的含量，mg/kg；A為樣液中EDTA-2Na衍生物的峰面積；C為標(biāo)準(zhǔn)工作液中EDTA-2Na衍生物的濃度，mg/L；V為樣液最終定容體積，mL；f為回收率校準(zhǔn)因子；As為標(biāo)準(zhǔn)工作液中EDTA-2Na衍生物的峰面積；m為試樣稱樣量，g。

依照以上數(shù)學(xué)模型，本測(cè)量結(jié)果的不確定度主要來(lái)源有：配制EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度ur(x1)、樣品稱量產(chǎn)生的不確定度ur(x2)、樣品定容體積引入的不確定度ur(x3)、樣品重復(fù)測(cè)定產(chǎn)生的不確定度ur(x4)、樣品處理過(guò)程中回收率引入的不確定度ur(x5)和最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品質(zhì)量濃度所引入的不確定度ur(x6)。

2.2 各不確定度分量的評(píng)定

2.2.1 配制EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的相對(duì)不確定度ur(x1)

2.2.1.1EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度ur(x1.1)

2.2.1.2 EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的相對(duì)不確定度ur(x1.2)

2.2.1.3 EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中器量校準(zhǔn)引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x1.3)

因此，EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中器量校準(zhǔn)引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

因此，EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制引入的不確定度ur(x1)為：

2.2.2 樣品稱量產(chǎn)生的不確定度ur(x2)

2.2.3 樣品定容體積引入的不確定度ur(x3)

樣品最終定容體積使用10mL容量瓶，其所引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 樣品重復(fù)測(cè)定產(chǎn)生的不確定度ur(x4)

重復(fù)性測(cè)定不確定度主要是由實(shí)驗(yàn)操作人員技能水平、檢測(cè)儀器的分辨率和穩(wěn)定性、樣品的混合均勻程度等因素引起的。按上述實(shí)驗(yàn)方法平行測(cè)定樣品6次，測(cè)定結(jié)果及計(jì)算數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 樣品重復(fù)測(cè)量結(jié)果

2.2.5 樣品處理過(guò)程中回收率引入的不確定度ur(x5)

回收率可以用來(lái)確定樣品處理方法、分析方法等產(chǎn)生的偏差。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)加標(biāo)回收率來(lái)進(jìn)行不確定度的評(píng)定。分別完成0.8、1.0、1.2倍的目標(biāo)物含量3個(gè)水平的添加，每個(gè)添加水平做2個(gè)重復(fù)，計(jì)算回收率?；厥章史秶?97.3%～100.67%，平均回收率為 98.51%，見(jiàn)表2。

表2 樣品回收率測(cè)定值

標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，標(biāo)準(zhǔn)不確定度和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

同時(shí)，必須對(duì)平均回收率進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以確定回收率校正因子f是否在計(jì)算公式中采用[14]。t檢驗(yàn)是用t分布理論來(lái)推論差異發(fā)生的概率，從而比較兩個(gè)平均數(shù)的差異是否顯著。本實(shí)驗(yàn)用t-檢驗(yàn)確定加標(biāo)平均回收率與100%有無(wú)顯著性差異，設(shè)顯著水平為α=0.05，t1-0.05(n-1)=1.943(n=6)，則，

由于平均回收率與100%差異顯著，因此必須考慮回收率引入的不確定度。

2.2.6 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(x6)

測(cè)定過(guò)程中采用了1 000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制了6種濃度(5mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L、100mg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別上機(jī)測(cè)定3次，得到相應(yīng)的峰面積，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，采用最小二乘法擬合，得出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程為y=3 269x-29 207，斜率b和截距a分別23 269和-29 207，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度由下式求得:

則EDTA-2Na標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度：

2.2.7 計(jì)算合成不確定度和擴(kuò)展不確定度

2.2.8 測(cè)量不確定度報(bào)告

因此，依據(jù)本文所建立的方法，所測(cè)定的八寶粥罐頭樣品中EDTA-2Na的含量檢測(cè)結(jié)果為：(162.600±3.578)mg/L。

2.2.9 不確定度的分析

將各不確定度分量值按比例繪成圖1，可以看出，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度最大，其次是樣品處理過(guò)程中回收率引入的不確定度和最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品質(zhì)量濃度所引入的不確定度。由于樣品稱量引入的不確定度極小，因此可忽略不計(jì)。

圖1 測(cè)量不確定度分量分布示意圖

3 結(jié)論

采用本文建立的方法，當(dāng)取樣量為2 g時(shí)，k=2(95%置信度)，所測(cè)定的八寶粥罐頭中EDTA-2Na的含量檢測(cè)結(jié)果為：(162.600±3.578) mg/L。

測(cè)定過(guò)程中不確定度分析表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的不確定度最大，其次是樣品處理過(guò)程中回收率引入的不確定度和最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品質(zhì)量濃度所引入的不確定度。因此，在檢測(cè)過(guò)程中要按規(guī)范配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，盡可能保證標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，盡可能的減少測(cè)量結(jié)果誤差，來(lái)降低不確定度。本研究對(duì)八寶粥罐頭食品中EDTA-2Na檢測(cè)不確定度進(jìn)行評(píng)定，為HPLC法測(cè)定食品中EDTA-2Na含量的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

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Uncertainty evaluation for the determination of ethylenediamine tetraacetic acid disodium saltin in canned eight-ingredient porridge by HPLC

Liu Silei, Zhao Yun, Dai Xuanli, Wu Ping

Hangzhou Wahaha Group Company Limited (Hangzhou 310018)

Based on JJF1059.1—2012 “EvaluationandExpressionofUncertaintyinMeasurement”, a mathematical model was established to assess the uncertainty of analyzing ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt (EDTA-2Na) in canned eight-ingredient porridge by high performance liquid chromatography (HPLC). Factors contributing to the uncertainty were analyzed, quantified and synthesized. The expanded uncertainty of EDTA-2Na determination for 2.0 g of samples was 3.578 mg/L. The results show that the uncertainty of measurement is mainly caused by the preparation of standard solution, recovery of sample during processing and the establishment of the standard curve. The evaluation method is reasonable, clear, simple, accurate, and references for the reliability and consistency of the laboratory testing data．

ethylenediamine tetraacetic acid disodium (EDTA-2Na); uncertainty; high performance liquid chromatography (HPLC); canned eight-ingredient porridge

2017-02-09

劉四磊，男，1987年出生，碩士研究生，工程師，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量檢測(cè)與安全控制。

TS297

A

1672-5026(2017)03-065-06