脈沖強光對枯草芽孢桿菌的致死工藝優(yōu)化

趙天惠,張佰清,謝 旭

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

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脈沖強光對枯草芽孢桿菌的致死工藝優(yōu)化

趙天惠,張佰清*,謝 旭

(沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院,遼寧沈陽 110866)

采用響應面法分析優(yōu)化脈沖強光對枯草芽孢桿菌致死的工藝參數(shù)。在單因素實驗基礎上,選取脈沖電壓、脈沖次數(shù)、照射距離為影響因素,致死率為指標,通過響應面法進行優(yōu)化設計。結(jié)果表明:脈沖強光對枯草芽孢桿菌的致死效果極顯著(p<0.01),根據(jù)最優(yōu)條件并結(jié)合實際操作,優(yōu)化工藝參數(shù)為脈沖電壓2450 V、脈沖次數(shù)65次、照射距離5 cm時,致死率可達到99.95%,各因素對致死率影響大小順序為A(脈沖電壓)>C(照射距離)>B(脈沖次數(shù)),為日后食品保藏和加工中枯草芽孢桿菌的滅活提供依據(jù)。

脈沖強光,枯草芽孢桿菌,致死率,響應面

微生物的生長繁殖引起食品腐敗變質(zhì)的現(xiàn)象十分普遍,由此造成的食品原料損失數(shù)量巨大。枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)是革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢菌,作為食品中常見的一種污染菌[1],對食品保藏造成巨大危害,特別是富含淀粉質(zhì)食品,枯草芽孢桿菌是造成其腐敗的主要菌種[2]。目前,食品中抑制枯草芽孢桿菌的主要方法是添加防腐劑,不僅存在一定的安全性隱患,還可能會造成食品感官品質(zhì)的下降,如生牛肉表面發(fā)黏、腌制的金槍魚肉質(zhì)糜爛[3]。因此,新型非熱殺菌技術受到日益重視并迅速發(fā)展,脈沖強光殺菌技術就是其中之一。

脈沖強光殺菌技術是一種具有廣闊發(fā)展前景的冷殺菌技術,利用與太陽光譜相近、但強度更高的脈沖光能量而瞬時殺滅微生物[4-6]。由于其顯著優(yōu)點,該技術被廣泛應用于食品微生物滅活和酶鈍化[7]。江天寶[8]和張佰清等[9-10]利用脈沖強光殺菌技術對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進行殺菌實驗,致死率分別為99.9%和99%。Caroline[11]研究發(fā)現(xiàn),脈沖強光對噴灑在不同材質(zhì)表面上的黑曲霉孢子的致死效果不同,在聚苯乙烯表面上的黑曲霉孢子的致死效果稍高于玻璃表面。Takeshita[12]研究了脈沖強光對食源性病原菌的殺滅效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果脈沖光波長在300 nm以下的光被濾去,殺菌效果降低,殺菌時間隨之延長。Marquenie[13]研究表明,脈沖強光照射40 s和41 ℃熱處理15 min結(jié)合,可使草莓灰霉菌孢子完全失活。

目前,江天寶[14]研究了脈沖強光的閃照時間對不同微生物的殺滅效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)全部殺滅大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉的閃照時間分別為12、14、16 s,表明不同微生物對脈沖強光處理耐受性由強到弱依次順序為黑曲霉、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌。Levy等[15]研究發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌的芽孢比菌體細胞對脈沖強光的處理更具有抵抗性。Nicorescu等[16]利用脈沖強光分別處理枯草芽孢桿菌菌懸液和接種于香料中的菌株,研究發(fā)現(xiàn)脈沖強光對液態(tài)菌株的處理不影響其形態(tài),卻嚴重破壞了固態(tài)菌株的細胞壁,改變其DNA結(jié)構,導致菌株死亡。本文在前期實驗的基礎上,采用脈沖強光殺菌技術對枯草芽孢桿菌進行致死效應研究。以脈沖電壓、脈沖次數(shù)和照射距離為影響因素,致死率為指標,進行單因素實驗研究。在此基礎上,采用響應面法進行優(yōu)化設計,得出最優(yōu)致死條件,希望為日后食品保藏和加工中枯草芽孢桿菌的滅活提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis) 由沈陽農(nóng)業(yè)大學土地與環(huán)境學院微生物實驗室提供；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 參照郝林的方法配制[17]。

脈沖強光裝置 脈沖寬度為20 μs,波長為200～1100 nm,輸出最大電壓為5000 V,輸入最大能量為644 J，沈陽農(nóng)業(yè)大學食品學院自行設計;HZQ-F160A恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司;PHS-3C型酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司;電熱手提式高壓蒸汽消毒鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;紫外可見分光光度計 上海尤尼科儀器有限公司;3K15型離心機 sigma公司;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)液的制備 菌株活化24 h之后,接種到液體培養(yǎng)基中32 ℃搖床培養(yǎng)12 h,形成種子液,將種子液培養(yǎng)6 h后形成處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)液,配成濃度為106個/mL,存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 脈沖強光處理與致死率的測定 在無菌環(huán)境中,將放置在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液放入脈沖裝置處理室,使培養(yǎng)皿與氙燈垂直,進行脈沖強光處理,利用平板菌落計數(shù)法測定菌落總數(shù),以不同處理條件下的菌株致死率來評價菌株的致死效果。

致死率(%)=(未處理活菌數(shù)-處理后活菌數(shù))/未處理活菌數(shù)×100

1.2.2.1 單因素實驗 分別以脈沖電壓、脈沖次數(shù)、照射距離為實驗因素,固定兩個因素,分別對另外一個影響因素進行實驗,測定各因素對菌株致死效果的影響。以原始菌株作為對照。

當脈沖次數(shù)為60 次,照射距離為6 cm,分別研究脈沖電壓為300、500、1000、1500、1800、2000、2500 V時對菌株致死率的影響。

當脈沖電壓為2000 V,照射距離為6 cm,分別研究脈沖次數(shù)為8、21、34、47、60、73次時對菌株致死率的影響。

當脈沖電壓為2000 V,脈沖次數(shù)為60 次,分別研究照射距離為4、6、8、10、12 cm時對菌株致死率的影響。

1.2.2.2 響應面實驗設計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以菌株致死率為響應值,對脈沖電壓、脈沖次數(shù)、照射距離進行3因素3水平實驗設計[18]。利用Design Expert 8.0.6軟件進行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合,采用Box-Behnken響應面分析[19]得到回歸模型和優(yōu)化的工藝參數(shù)。實驗因素和水平如表1所示。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the response surface design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 脈沖電壓對菌株致死效果影響 由圖1可知,枯草芽孢桿菌致死率隨脈沖電壓增大而增大,且不同脈沖電壓對菌株致死率存在顯著差異(p<0.05),這可能是因為脈沖電壓增大時,脈沖強光的能量增強,高能輻射導致瞬間溫度升高,造成菌體細胞內(nèi)水分快速蒸發(fā)形成微小的蒸汽,從而導致細胞膜膨脹破裂,細胞質(zhì)泄露,造成菌株致死率提高[20-21]。在脈沖電壓0～1500 V范圍內(nèi),致死率顯著升高,當脈沖電壓為2000 V時,菌株的致死率為97.91%;當脈沖電壓大于2000 V時,隨脈沖電壓的增大,雖然致死率繼續(xù)升高,但趨勢變緩慢;當脈沖電壓為2500 V時,致死率達到最大值為98.4%。綜合考慮兩評價指標的最適脈沖電壓,選取1500、2000、2500 V繼續(xù)對枯草芽孢桿菌的致死效果做響應面分析以確定最佳的脈沖電壓。

圖1 脈沖電壓對菌株致死效果影響研究Fig.1 The study on lethal effects of the strains from pulse voltage

2.1.2 脈沖次數(shù)對菌株致死效果影響 由圖2可知,枯草芽孢桿菌的致死率隨脈沖次數(shù)增加而增大。這可能是由于菌株的致死率與光流量呈正相關,隨脈沖次數(shù)的增加,每次釋放的光流量逐漸積累,最終得到的光流量總量增大,菌株致死率提高[7]。在脈沖次數(shù)為0～60次的范圍內(nèi),枯草芽孢桿菌的致死率顯著提高;當脈沖次數(shù)達到60次時,致死率為97.09%;當脈沖次數(shù)大于60次時,隨脈沖次數(shù)的增加,致死率上升幅度減小,趨于平緩。在脈沖次數(shù)為73次時,致死率最大值為98.11%。綜合考慮兩評價指標的最適脈沖次數(shù),選取47、60、73 次繼續(xù)對枯草芽孢桿菌的致死效果做響應面分析以確定最佳的脈沖次數(shù)。

圖2 脈沖次數(shù)對菌株致死效果影響研究Fig.2 The study on lethal effects of the strains from pulsed light times

2.1.3 照射距離對菌株致死效果影響 由圖3可知,枯草芽孢桿菌的致死率隨照射距離的增加而減小,方差分析表明,不同照射距離對菌株致死率存在顯著差異(p<0.05)。這可能是由于菌液距離燈越近,殺菌效果越顯著,可能是距離的縮短增強脈沖強光的光化學和光熱作用,而脈沖強光對微生物的殺滅是光熱和光化學效應共同作用的結(jié)果[22]。照射距離在6 cm范圍內(nèi),照射距離對枯草芽孢桿菌的致死效果影響不大,但照射距離大于6 cm時,致死效果明顯降低。當照射距離為6 cm時,致死率為96.47%,與照射距離為4 cm時相比,致死率僅下降了2.42%;當距離為10 cm時,致死率為43.76%,比照射距離為6 cm時的致死率下降了54.64%。綜合考慮兩評價指標的最適照射距離,選取4、6、8 cm繼續(xù)對枯草芽孢桿菌的致死效果做響應面分析以確定最佳的照射距離。

圖3 照射距離對菌株致死效果影響研究Fig. 3 The study on lethal effects of the strains from irradiation distance

2.2 實驗模型的建立及顯著性檢驗

在單因素研究基礎上,根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件進行實驗設計,以脈沖電壓、脈沖次數(shù)、照射距離為因素,以致死率為響應值(Y),進行響應面實驗,實驗設計及結(jié)果見表2、表3。

表2 響應面分析方案及實驗結(jié)果Table 2 Program and experimental results of RSA

將實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合,得到以致死率(Y)為目標函數(shù)的二次回歸方程模型為:

Y(%)=98.92+4.59A+0.90B-2.14C-3.20AB-3.18AC-1.30BC-6.15A2-2.83B2-6.50C2

該模型極顯著(p<0.0001),失擬項不顯著(p>0.05),模型的校正后系數(shù)R2adj為0.9973,表示該模型成立,方程與實際擬合較好。能有效反映出菌株的致死率與脈沖電壓、脈沖次數(shù)和照射距離之間的關系,因此,該方程能預測響應值隨各參數(shù)的變化規(guī)律。

模型一次項(A、C)、交互項(AB、AC)、二次項(A2、C2)極顯著;二次項B2顯著;一次項B、交互項BC不顯著。由顯著性大小可看出,各因素對致死率影響大小順序為A(脈沖電壓)>C(照射距離)>B(脈沖次數(shù))。

2.3 響應面分析與優(yōu)化

回歸模型方程的響應面分別見圖4～圖6。對響應面及等高線圖進行分析,可以直觀地看出優(yōu)化區(qū)域和不同因素之間相互作用的程度[23]。此外,橢圓形等高線圖表示兩兩之間的交互作用比較顯著。

圖4 脈沖電壓、脈沖次數(shù)的響應面Fig.4 Response surface curve for pulse voltage and pulse frequency

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

圖5 脈沖電壓、照射距離的響應面Fig.5 Response surface curve for pulse voltage and irradiation distance

圖6 脈沖次數(shù)、照射距離的響應面Fig.6 Response surface curve for pulse frequency and irradiation distance

注:*差異顯著(p<0. 05);**差異極顯著(p<0. 01)。

由圖4可知,將照射距離控制在0水平,隨著脈沖電壓和脈沖次數(shù)的增大,菌株致死率逐漸增強,且兩者交互作用影響極顯著。當脈沖次數(shù)為60次,脈沖電壓為2000V以上時,菌株致死率均在95%以上。隨著脈沖電壓增大,脈沖電能增加,菌株死亡率越高。符合Oms等[24]認為脈沖強光的照射能量越強,對微生物的抑制作用越顯著的觀點。由圖5可知,將脈沖次數(shù)控制在0水平,菌株致死率與脈沖電壓成正比,與照射距離成反比。且兩者交互作用影響極顯著。由圖6可知,將脈沖電壓控制在0水平,隨著脈沖次數(shù)增大,菌株致死率呈遞增趨勢;隨著照射距離增大,菌株致死率呈遞減趨勢。且兩者交互作用影響不顯著。

分析回歸模型并結(jié)合響應面圖可確定脈沖強光對菌體致死的最優(yōu)條件為:脈沖電壓2446.18 V,脈沖次數(shù)64.55次,照射距離5.46 cm,此條件下預測的致死率為99.59%。結(jié)合實際操作,優(yōu)化工藝參數(shù),即脈沖電壓2450 V,脈沖次數(shù)65次,照射距離5 cm,并對最佳條件做3次重復實驗進行驗證,結(jié)果得到菌株致死率為99.95%,實驗值與預測值相差很小,所得參數(shù)較為可靠。表明該模型可以較好地反映出脈沖強光對枯草芽孢桿菌的致死效果,具有一定的實際指導意義。

3 結(jié)論

本研究表明,脈沖強光對枯草芽孢桿菌的致死效果明顯,在單因素實驗基礎上,利用響應面法優(yōu)化脈沖強光對枯草芽孢桿菌的致死工藝,建立了致死率與脈沖電壓、脈沖次數(shù)和照射距離3個因素間的二次回歸方程模型。最佳致死條件為:脈沖電壓2450 V、脈沖次數(shù)65次、照射距離5 cm,該條件下致死率可達99.95%。各因素對致死率影響大小順序為A(脈沖電壓)>C(照射距離)>B(脈沖次數(shù))。因此,脈沖強光可有效致死枯草芽孢桿菌,有助于避免微生物污染造成的食品腐敗,并在一定程度上可發(fā)揮其在食品保藏中防腐劑的替代作用。

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Optimization of pulsed light parameters for lethal effect ofbacillussubtilis

ZHAO Tian-hui,ZHANG Bai-qing*,XIE Xu

(College of Food Science,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China)

Response surface methodology was adopted to optimize pulsed light parameters for lethal effect ofbacillussubtilis. On the basis of single factor experiments,through the response surface experiment design,pulse voltage,pulse frequency,irradiation distance were selected as the response factor,and the fatality rate was investigated. The results showed that the lethal effect of pulse light onbacillussubtiliswas extremely significant(p<0.01),according to the optimal conditions and combined with the actual operation,the optimized parameters were pulse voltage of 2450 V,pulse number of 65,distance of 5 cm,the fatality rate can reach 99.95%,and the order of the influencing factors was A(pulse voltage)>C(distance)>B(pulse number),and that can be the basis ofbacillussubtilisexisted in the preservation and the processing of food is inactivated in the future.

pulsed light;bacillussubtilis;fatality rate;response surface

2016-12-29

趙天惠(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品冷殺菌理論與技術,E-mail：1183412100@qq.com。

*通訊作者:張佰清(1966-)，男，博士，教授，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工技術,E-mail：sybaiqingxl@sina.com。

TS201.3

B

1002-0306(2017)11-0214-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.032