培養(yǎng)方式對(duì)靈芝酸合成的影響及固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

陳 紅,方 磊,余曉斌

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院,糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

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培養(yǎng)方式對(duì)靈芝酸合成的影響及固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

陳 紅,方 磊,余曉斌*

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院,糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無錫 214122)

先比較靈芝振蕩培養(yǎng)、振蕩-靜置兩階段結(jié)合培養(yǎng)和固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)總靈芝酸及靈芝酸Mk、靈芝酸S、靈芝酸T和靈芝酸Me合成的影響。并以玉米粉為主要的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì),利用Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)篩選影響總靈芝酸合成的主要因素,然后以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)、中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)影響靈芝酸合成的主要因素進(jìn)行優(yōu)化。確定最優(yōu)培養(yǎng)條件為:39.0 g玉米粉(含水量38.0%)/瓶,1.08%蠶蛹粉,0.86%蔗糖,0.08%檸檬酸三銨,0.13%硫酸鎂,0.22% KH2PO4,0.02% VB1,接種量20%,培養(yǎng)溫度29.5 ℃,發(fā)酵時(shí)間為10 d。在此條件下,玉米靈芝菌絲體混合粉末中總靈芝酸含量到達(dá)了24.93 mg/g,靈芝酸Mk、靈芝酸S、靈芝酸T含量分別達(dá)到了0.86、0.69和3.69 mg/g。靈芝固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)三種靈芝酸單體具有較好的應(yīng)用前景。

靈芝菌絲體,固態(tài)發(fā)酵,Plackett-Burman(PB)設(shè)計(jì)法,響應(yīng)面法

靈芝(Ganodermalucidum)自古以來就是中國的名貴中藥,是一種隸屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、多孔菌科、靈芝屬的藥用真菌[1-2]。藥理研究表明,靈芝三萜可抑制腫瘤細(xì)胞、抗病毒、鎮(zhèn)靜止痛、抑制組織胺釋放等功能[3-6]。野生的靈芝非常稀少,人工栽培靈芝子實(shí)體技術(shù)和菌絲體液體培養(yǎng)技術(shù)得到快速發(fā)展[7-8],靈芝固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體技術(shù)研究的相對(duì)較少。靈芝子實(shí)體中三萜類物質(zhì)的種類豐富,其中靈芝酸A、B和C的含量較高,而菌絲體中的三萜主要是靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸R等[9]。在液體靜置培養(yǎng)條件下靈芝酸Mk、靈芝酸T、靈芝酸S和靈芝酸Me的含量遠(yuǎn)高于振蕩培養(yǎng),目前靈芝液體發(fā)酵研究的熱點(diǎn)主要是采用振蕩-靜置兩階段培養(yǎng)來提高靈芝酸的產(chǎn)量[10-11]。

譚顯東等[12]按照“雙向發(fā)酵”理論,以三七渣為原料固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)靈芝,可以獲得具有獨(dú)特功能的藥性菌質(zhì),實(shí)現(xiàn)三七渣的資源化利用、減少固態(tài)廢棄物的排放等。付銘等[13]以大米為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)培養(yǎng)靈芝菌絲體,靈芝米粉中含有非常豐富的賴氨酸和靈芝多糖等功能性物質(zhì)。韓建榮等[14]利用靈芝固態(tài)發(fā)酵降解玉米粉中的淀粉,還原糖和蛋白質(zhì)的含量大幅提高,增加了玉米粉的消化吸收率和營養(yǎng)價(jià)值。本文中先比較靈芝振蕩培養(yǎng)、振蕩-靜置兩階段結(jié)合培養(yǎng)和靈芝固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)總靈芝酸及靈芝酸Mk、靈芝酸S、靈芝酸T和靈芝酸Me合成的影響,來探究靈芝固態(tài)發(fā)酵高產(chǎn)靈芝酸單體的可行性;再以玉米粉為主要的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì),優(yōu)化培養(yǎng)條件來提高總靈芝酸和靈芝酸單體含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株 安徽靈芝菌種，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選及保存;玉米粉 無錫市歐尚超市;冰醋酸、乙醇、乙酸乙酯 上海國藥集團(tuán);甲醇、乙腈 阿拉丁試劑有限(中國)公司;其它實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

G180T滅菌鍋 美國致微儀器有限公司;日立U-3900紫外可見光分光光度計(jì) 日本日立株式會(huì)社;安捷倫1260高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司;1525型半制備液相色譜儀 沃特世科技(上海)有限公司;三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件液體振蕩培養(yǎng) 培養(yǎng)基(g/L):40可溶性淀粉,5麩皮,2.25 KH2PO4,1.5 MgSO4,0.005 VB1,pH5.60,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min;培養(yǎng)條件:接種量為10%,溫度為30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min,培養(yǎng)時(shí)間為7 d。8000 r/min離心5 min,收集靈芝菌絲體,放置到60 ℃干燥箱中烘干至恒重。液體振蕩-靜置培養(yǎng):培養(yǎng)基(g/L):40可溶性淀粉,5麩皮,2.25 KH2PO4,1.5 MgSO4,0.005 VB1,pH5.60,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min;培養(yǎng)條件為:接種量為10%,溫度為30 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min,振蕩培養(yǎng)時(shí)間為6 d,轉(zhuǎn)接到平板上,靜置培養(yǎng)8 d。取靈芝靜置培養(yǎng)的上層菌絲體,洗滌后放置到60 ℃干燥箱中烘干至恒重。固態(tài)發(fā)酵:培養(yǎng)基(250 mL三角瓶):50 g/瓶玉米粉(含水量為38.0%),1.08%蠶蛹粉,0.86%蔗糖,0.08%檸檬酸三銨,0.22% KH2PO4,0.16%硫酸鎂,0.02% VB1,121 ℃高壓蒸汽滅菌40 min;培養(yǎng)條件:接種量20%,培養(yǎng)溫度30 ℃,發(fā)酵時(shí)間為10 d。培養(yǎng)結(jié)束后,玉米靈芝菌絲體放置到60 ℃干燥箱中烘干至恒重。

1.2.2 靈芝酸檢測波長的選擇 稱取實(shí)驗(yàn)室制備的靈芝酸Mk(純度≥95%)適量,溶于甲醇,定容得標(biāo)準(zhǔn)溶液。稀釋到適宜的濃度后,在191～600 nm內(nèi)進(jìn)行掃描,確定靈芝酸的檢測波長[15]。

1.2.3 總靈芝酸的提取及測定 取烘干后振蕩培養(yǎng)的靈芝菌絲體、液體振蕩-靜置培養(yǎng)靈芝菌絲體上層和玉米靈芝菌絲體混合物,粉碎機(jī)粉碎后,分別稱取一定量的菌絲體粉末用乙醇提取三次,合并提取液,用乙酸乙酯萃取兩次,減壓除去乙酸乙酯,用甲醇溶解定容,稀釋適宜濃度,在231 nm波長下測定吸光度[16]。

1.2.4 靈芝酸單體的制備 靈芝酸樣品液用大孔樹脂純化和濃縮后,用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾,靈芝酸單體的半制備液相的條件[17]:X Bridge C18柱子;流動(dòng)相為乙酸水溶液(乙酸的體積分?jǐn)?shù)為0.1%)(A)-乙腈(B),等度洗脫的濃度V(A)∶V(B)=25%∶75%,流速為3 mL/min;PDA檢測器,檢測波長為231 nm;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量400 μL。分管收集目標(biāo)物質(zhì),鑒定制備的靈芝酸單體純度。

1.2.5 靈芝酸單體的檢測方法 用高效液相測定菌絲體中各靈芝酸單體含量,液相條件為:ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫的濃度為(0～30 min:65% B→100% B;30～40 min:100% B);PDA檢測器,檢測波長為231 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量20 μL;流速為1 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

靈芝酸Mk在波長為191～600 nm的吸光度曲線如圖1所示,靈芝酸在波長為217、231 nm出現(xiàn)了兩個(gè)吸收峰極值,甲醇和乙腈在波長為210 nm左右有較強(qiáng)的紫外吸收,對(duì)實(shí)驗(yàn)有較大的干擾,后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇的檢測波長為231 nm。

圖1 靈芝酸的紫外可見光光譜圖Fig.1 Absorption spectrum of the ganoderic acid

2.2 靈芝酸單體的結(jié)構(gòu)分析

圖2c和圖3c分別表示RT=6.63靈芝酸單體的正負(fù)離子質(zhì)譜圖,根據(jù)圖2c中出現(xiàn)的493.1、553.0、613.1、630.1和635.0分別代表的結(jié)構(gòu)為[M-2OAc]+、[M-OAc]+、[M+H]+、[M+NH4]+和[M+Na]+質(zhì)譜信號(hào)峰;圖3c中,在m/z 611.5處峰,代表了[M-H]-質(zhì)譜信號(hào),所對(duì)應(yīng)的M值與靈芝酸T的分子量612相符合,初步鑒定為靈芝酸T[19]。

圖2d和圖3d分別表示RT=7.78靈芝酸單體的正負(fù)離子質(zhì)譜圖,根據(jù)圖2d中出現(xiàn)的495.6、554.9、568.9、和577.1分別代表的結(jié)構(gòu)為[M-OAc]+、[M+H]+、[M+NH4]+和[M+Na]+質(zhì)譜信號(hào)峰;圖3d中,在m/z 553.5處峰,代表了[M-H]-質(zhì)譜信號(hào),所對(duì)應(yīng)的M值與靈芝酸Me的分子量554相符合,初步鑒定為靈芝酸Me[19]。

圖2 靈芝酸Mk(a)、S(b)、T(c)和Me(d)的正離子質(zhì)譜圖Fig.2 Positive-ion mass spectra of GA-Mk(a),GA- S(b),GA-T(c)and GA-Me(d)

圖3 靈芝酸Mk(a)、S(b)、T(c)和Me(d)的負(fù)離子質(zhì)譜圖Fig.3 Negative-ion mass spectra of GA-Mk(a),GA- S(b),GA-T(c)and GA-Me(d)

2.3 靈芝酸單體純度的鑒定及高效液相色譜峰面積和濃度的線性關(guān)系

取經(jīng)半制備液相制備的四種靈芝酸單體,通過HPLC檢測其純度,純度均≥95%。取適量的靈芝酸Mk,靈芝酸S,靈芝酸T和靈芝酸Me(經(jīng)質(zhì)譜初步鑒定)定容后,稀釋得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液,檢測靈芝酸單體峰面積與其濃度的線性關(guān)系,結(jié)果如表1所示,四種靈芝酸在適宜的濃度下,峰面積與濃度的線性關(guān)系擬合度高。

表1 峰面積與靈芝酸濃度的關(guān)系Table 1 Linear relationships between peak area and ganoderic acids concentration

2.4 培養(yǎng)方式對(duì)靈芝酸單體合成的影響

如圖4可見,靈芝液體振蕩-靜置兩階段培養(yǎng)上層菌絲體中總靈芝酸含量高達(dá)46.74 mg/g,是振蕩培養(yǎng)菌絲體的2.19倍,這與駱軍鑫[20]和鐘建江[11]等研究結(jié)果一致;兩階段培養(yǎng)的菌絲體中靈芝酸Mk、靈芝酸S、靈芝酸T和靈芝酸Me含量分別為2.30、2.34、4.67、1.53 mg/g,而振蕩培養(yǎng)并未檢測出這四種靈芝酸單體的存在,證明兩階段培養(yǎng)法的菌絲體醇提物中靈芝酸種類及含量明顯優(yōu)于液體振蕩培養(yǎng)法。固態(tài)發(fā)酵的玉米靈芝菌絲體粉末中總靈芝酸為14.83 mg/g,靈芝酸Mk、靈芝酸S和靈芝酸T含量分別為0.57、0.46和2.20 mg/g,未檢測到靈芝酸Me,這是首次報(bào)道靈芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)靈芝酸Mk、靈芝酸S和靈芝酸T。靜置培養(yǎng)上層菌絲體中鯊烯合成酶、羊毛甾醇合成酶和3-羥基-3-甲基戊二酰-乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)錄水平是振蕩培養(yǎng)的4.3、2.1和1.9倍,其基因表達(dá)量的上調(diào)是靈芝酸合成提高的主要原因[11]。通過振蕩-靜置兩階段培養(yǎng)來提高靈芝菌絲體中的靈芝酸的種類及含量已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)報(bào)道,但該法也存在一定的局限性。靈芝液體振蕩-靜置培養(yǎng)條件的要求較為嚴(yán)格,培養(yǎng)周期較長,且僅有液體表面形成白色菌絲層中的靈芝酸種類及含量有較大的提高,不利于擴(kuò)大化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)中采用靈芝固態(tài)培養(yǎng)的玉米靈芝菌絲體中也含有振蕩-靜置培養(yǎng)上層菌絲體中存在的靈芝酸Mk、靈芝酸S和靈芝酸T。相對(duì)于振蕩-靜置培養(yǎng),固態(tài)培養(yǎng)的總靈芝酸及幾種靈芝酸的單體含量較低,但在擴(kuò)大培養(yǎng)、培養(yǎng)的效率及成本等方面有很大的優(yōu)勢,具有較好的研究前景。

表2 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(n=12)Table 2 Design of PB test(n=12)

圖4 不同培養(yǎng)方式下靈芝酸種類及含量Fig.4 Ganoderic acid contents under different culture conditions

2.5 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

由2.4的分析可知,靈芝在不同培養(yǎng)條件下靈芝酸的種類及含量有較大差別,以玉米等可食性固態(tài)基質(zhì),發(fā)酵生產(chǎn)靈芝酸Mk、靈芝酸S和靈芝酸T等具有抗癌活性的天然物質(zhì),具有較好的發(fā)展?jié)摿?。在靈芝固態(tài)發(fā)酵中,靈芝酸單體的含量與總靈芝含量呈正相關(guān),為簡便后續(xù)的數(shù)據(jù)分析處理,在固態(tài)發(fā)酵中以總靈芝酸含量為優(yōu)化的指標(biāo)。

2.5.1 PB實(shí)驗(yàn)及結(jié)果 采用PB兩水平法對(duì)靈芝固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)中9種因素進(jìn)行了考察,篩選影響靈芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)靈芝酸的主要因素。PB的實(shí)驗(yàn)因素和水平見表3,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表2。經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件建模后,所建模型p值為0.0406<0.05,證明該模型效果顯著。9個(gè)因素中,瓶裝量、硫酸鎂添加量和培養(yǎng)溫度對(duì)靈芝菌絲體中總靈芝酸含量的影響顯著,結(jié)果見表3。

表3 PB實(shí)驗(yàn)因素水平及效應(yīng)分析Table 3 Factors,levels and efficiency evaluation of Placket-Burman experiment

注:“*”表示顯著。

表4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)Table 4 Design of the steepest ascent experiment

2.5.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 由PB實(shí)驗(yàn)可知瓶裝量、硫酸鎂添加量和培養(yǎng)溫度是影響總靈芝酸合成的3個(gè)顯著因素,因此根據(jù)這3個(gè)因素效應(yīng)的大小比例設(shè)定其變化方向及其變化步長進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示,可知最優(yōu)總靈芝酸含量在編號(hào)2和4之間。

2.5.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化分析

2.5.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,做三因素三水平共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析。A(瓶裝量,g/瓶),B(硫酸鎂,g/kg),C(溫度, ℃),Y(總靈芝酸含量,mg/g),響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Design and results of response surface experiment

2.5.3.2 響應(yīng)面曲面方差分析 表6分析可知,模型p=0.0004<0.01,失擬誤差p=0.4407>0.05,說明該模型回歸顯著;該模型的R2=0.98,說明該模型與實(shí)際擬合度高,自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著,可用于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)靈芝酸的理論預(yù)測。利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表5進(jìn)行多元回歸擬合,得到總靈芝酸二次回歸方程模型:Y=23.36-3.49A-0.22B+1.50C-0.32AB-0.03AC+0.44BC-2.60A2-2.88B2-4.20C2。

表6 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis of regression mode

注:*p<0.05,模型或考察因素顯著;**p<0.01模型或考察因素極顯著。

2.5.3.3 兩因素交互影響 總靈芝酸含量的響應(yīng)面分析如圖5所示,靈芝酸含量的響應(yīng)面開口均向下,總靈芝酸含量和3個(gè)因素呈現(xiàn)明顯的二次拋物線關(guān)系。利用Design Expert 8.0.6軟件中多元二次回歸模型對(duì)靈芝酸含量進(jìn)行估算,對(duì)二次拋物線函數(shù)模型進(jìn)行極值分析,預(yù)測三因素的最佳組合為:瓶裝量38.92 g/瓶,硫酸鎂添加量1.30 g/kg,培養(yǎng)溫度29.47 ℃時(shí),該模型預(yù)測極大值Y=24.59 mg/g。

圖5 兩因素交互影響總靈芝酸含量的響應(yīng)曲面圖分析Fig.5 Response surface analysis of the recovery rate affected by two-factors

2.5.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性和有效性,對(duì)預(yù)測的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行調(diào)整,調(diào)整后的培養(yǎng)條件:39.0 g/瓶玉米粉,1.08%蠶蛹粉,0.86%蔗糖,0.08%檸檬酸三銨,0.22% KH2PO4,0.13%硫酸鎂,0.02%VB1,接種量20%,培養(yǎng)溫度29.5 ℃,每組3重復(fù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示?？傡`芝酸含量在靈芝固態(tài)發(fā)酵10 d后達(dá)到了最高為(24.93±0.51) mg/g,說明該回歸模型能準(zhǔn)確預(yù)測固態(tài)發(fā)酵中總靈芝酸的含量,靈芝酸Mk、靈芝酸S和靈芝酸T的含量分別為0.86、0.69和3.69 mg/g。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)靈芝酸合成的影響Fig.6 Effect of cultivation duration on the production of ganoderic acid

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)先鑒定了從振蕩-靜置培養(yǎng)上層菌絲體中提取的四種靈芝酸單體;再比較不同培養(yǎng)方式對(duì)總靈芝酸及靈芝酸單體合成的影響,證實(shí)了靈芝固態(tài)發(fā)酵能合成在振蕩-靜置兩階段培養(yǎng)菌絲體上層中存在的靈芝酸Mk、靈芝酸S和靈芝酸T;固態(tài)發(fā)酵條件經(jīng)優(yōu)化后,玉米靈芝菌絲混合粉末中總靈芝酸含量達(dá)到了24.93 mg/g,提高了68.11%,其中靈芝酸Mk、靈芝酸S和靈芝酸T的含量分別為0.86、0.69和3.69 mg/g。相較于振蕩培養(yǎng)和振蕩-靜置培養(yǎng),靈芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)三種靈芝酸單體有更廣闊的應(yīng)用前景。

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Influence of different cultivation methods on ganoderic acid synthesis and solid-state fermentation condition optimization

CHEN Hong,FANG Lei,YU Xiao-bin*

(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Compared shake culture,two-stage culture process by combining shake culture with static cultureand solid-state fermentationofGanodermalucidum,analyzed the influence of different cultivation methods on total ganoderic acid,ganoderic acid Mk,ganoderic acid S,ganoderic acid T and ganoderic acid Me synthesis. Corn was used as the main medium to produce ganoderic acids,Plackett-Burman(PB)design was applied to screen potential key factors associated with total ganoderic acid content. Then,the steepest ascent experiment,central composite design and response surface methodology were applied to optimize the significant factors.The final results were as follows:39.0 g solid substrate(moisture content 38.0%)shake flask,1.08% silkworm chrysalis powder,0.86% sucrose,0.08%tri-ammonium citrate,0.22% KH2PO4,0.13% MgSO4,0.02% VB1,culture temperature 29.5 ℃,and fermentation time 10 days. Under this condition,the total ganoderic acids content was 24.93 mg every gram of theganodermalucidummycelium and corn powder,and ganoderic acid Mk,ganoderic acid S and ganoderic acid content reached 0.86,0.69 and 3.69 mg/g,respestively.Production of three ganodericacids byGanodermalucidumsolid-state fermentation has good application prospect.

Ganodermalucidummycelium;solid-state fermentation;Plackett-Burman design;response surface methodology

2016-11-17

陳紅(1993-),男,碩士研究生,研究方向:靈芝酸提取、純化及發(fā)酵優(yōu)化,E-mail:13771099158@163.com。

*通訊作者:余曉斌(1965-),男,博士,教授,研究方向:發(fā)酵法生產(chǎn)功能食品因子,E-mail:xbyu@jiangnan.edu.cn。

TS201.3

A

1002-0306(2017)11-0167-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.023