細(xì)鱗魚(yú)3種氣單胞菌SSCP快速檢測(cè)方法的建立

杜迎春++時(shí)曉++陳春山++李博++劉寧

摘 要 采用PCR-SSCP（聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性）方法直接提取細(xì)菌DNA進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)保守序列，擴(kuò)增產(chǎn)物變性后，進(jìn)行SSCP分析，建立殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌的SSCP特異性圖譜。該方法可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出養(yǎng)殖水體及病魚(yú)體上的致病菌，在生產(chǎn)實(shí)踐上有重要意義。

關(guān)鍵詞 PCR-SSCP；殺鮭氣單胞菌；嗜水氣單胞菌；溫和氣單胞菌

中圖分類(lèi)號(hào)：S941 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.06.051

細(xì)鱗魚(yú)又稱(chēng)細(xì)鱗鮭，屬鮭形目、鮭科、細(xì)鱗魚(yú)屬，該魚(yú)在中國(guó)僅1屬1種，是一種名貴的鮭科陸封型冷水魚(yú)。在細(xì)鱗魚(yú)的馴養(yǎng)繁育過(guò)程中，各種疫病成為制約其發(fā)展的瓶頸問(wèn)題，其中，氣單胞菌是引起魚(yú)類(lèi)疾病的重要病原菌。

殺鮭氣單胞菌主要是鮭、鱒魚(yú)的病原菌，但近年來(lái)也有感染大菱鲆、鰈等其他魚(yú)類(lèi)的報(bào)道；嗜水氣單胞菌在水體中廣泛存在，可引起魚(yú)類(lèi)及其他水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的多種病害。溫和氣單胞菌也能引起多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物感染發(fā)病，且大多情況下是多種細(xì)菌混合感染。

傳統(tǒng)的病原菌鑒定方法雖較為經(jīng)典，使用廣泛，但操作繁瑣，周期較長(zhǎng)，而水生動(dòng)物致病菌多為條件性致病菌，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出致病菌對(duì)于病原的確定及診治尤為重要。本研究就是利用分子生物學(xué)的方法，建立殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌的PCR-SSCP快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚(yú)是北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心馴養(yǎng)繁育的細(xì)鱗魚(yú)。

1.1.2 試劑儀器

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；2× Es Taq Master Mix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；DL2000 DNA Marker，購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離

病魚(yú)鰓蓋、鰭基及魚(yú)體兩側(cè)出血、充血，嚴(yán)重的病魚(yú)體表充血甚至出血（如見(jiàn)圖1所示）。腹腔內(nèi)有淡黃色透明或紅色渾濁腹水。無(wú)菌采取患病細(xì)鱗魚(yú)病灶、肝臟、脾臟、腸等器官，用接種環(huán)劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上。挑取單個(gè)典型菌落接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，25 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。

圖1 患病細(xì)鱗魚(yú)

1.2.2 病原菌PCR擴(kuò)增

取分離培養(yǎng)的肉湯培養(yǎng)物，提取基因組DNA。用提取的DNA作為模板，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA V3區(qū)保守序列基因?；驍U(kuò)增通用引物27F和1492R，引物序列如下。

27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3；

1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。

引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：上游引物1 μL，下游引物1 μL，2× Es Taq Master Mix：12.5 μL，模板1 μL，雙蒸水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性

5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，PCR產(chǎn)物純化回收后，由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 病菌SSCP圖譜建立

將PCR產(chǎn)物98 ℃變性，而后快速?gòu)?fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子。變性產(chǎn)物利用10% PAGE膠電泳。通過(guò)放射性自顯影、銀染、溴化乙錠分析SSCP電泳圖譜。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

嗜水氣單胞菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，長(zhǎng)成圓形光滑、邊緣整齊、隆起、半透明或不透明、灰白色的菌落。殺鮭氣單胞菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上24 h生長(zhǎng)成菌落直徑0.3～0.4 mm灰白色、較不透明、隆起、邊緣整齊的菌落。

2.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增得到171 bp目的條帶。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后，送華大公司測(cè)序。將測(cè)序序列提交NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，確定目的基因片段分別是殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌。

2.3 SSCP

PCR變性產(chǎn)物經(jīng)多次重復(fù)電泳后，確定每種細(xì)菌圖譜的特異性、重復(fù)性及準(zhǔn)確性。殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單細(xì)胞菌的SSCP圖譜見(jiàn)圖3，建立了特異性PCR-SSCP快速檢測(cè)方法。

3 討論

氣單胞菌引發(fā)的疫病是細(xì)鱗魚(yú)人工養(yǎng)殖中的高發(fā)疫病，其中嗜水氣單胞菌、溫和氣單細(xì)胞菌、殺鮭氣單胞菌等氣單細(xì)胞菌引起的疫病最為常見(jiàn)，危害也最為嚴(yán)重，一旦發(fā)病常常會(huì)帶來(lái)毀滅性損失。因此建立氣單胞菌病源的快速檢測(cè)方法，對(duì)于疫病的早期防控和治療尤為重要。而傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生理生化等基礎(chǔ)檢測(cè)手段，由于靈敏度低、特異性差、費(fèi)時(shí)耗工，已不適應(yīng)當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)對(duì)疫病早期防控及時(shí)治療的需要。本研究采用SSCP方法直接提取細(xì)菌DNA進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)，通過(guò)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)保守序列，進(jìn)行變性電泳后，建立3種氣單胞菌的特異性SSCP圖譜，可用于病源的快速檢測(cè)分析。PCR-SSCP快速檢測(cè)方法的建立，可將病源的檢測(cè)時(shí)間控制在2 d以內(nèi)，重復(fù)率可達(dá)到95%以上，準(zhǔn)確率可達(dá)到90%以上，該方法所需儀器簡(jiǎn)單、操作方便、適宜在普通實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

（責(zé)任編輯：劉昀）