RhD陰性患者輸注DEL型血液的安全性研究*

王敏 王保龍 周明 完曉菊 廖艷秋

·論著·

RhD陰性患者輸注DEL型血液的安全性研究*

王敏 王保龍 周明 完曉菊 廖艷秋

目的 探討RhD陰性患者輸注DEL型血液的安全性。方法 采用間接抗人球蛋白法及熱吸收放散方法對RhD陰性獻血者血液進行DEL型檢測，并采用DNA測序方法分析DEL型獻血者的RHD基因序列，回顧性分析接受DEL型血液RhD陰性患者體內(nèi)抗-D產(chǎn)生情況。結(jié)果 經(jīng)吸收放散方法確認(rèn)的13例DEL陽性的獻血者均攜帶RHD1227A等位基因，12例接受DEL型血液的RhD陰性患者體內(nèi)抗-D水平均無變化，1例患者體內(nèi)抗-D水平由8升高到32。結(jié)論 DEL型血液引起抗-D同種免疫反應(yīng)的可能性較低，但DEL型血液仍具有一定的免疫原性，對于體內(nèi)已存在抗-D抗體的患者應(yīng)避免輸注DEL型血液。

DEL 抗-D RHD1227A等位基因 Rh血型

Rh血型系統(tǒng)抗原種類較多，其中D抗原免疫原性最強，具有重要的臨床意義。根據(jù)D抗原的有無將Rh血型分為RhD陽性及RhD陰性。DEL型是弱D的一種，其紅細(xì)胞膜表面D抗原表位數(shù)目較少，僅能通過敏感的吸收放散方法檢測出來，稱為D放散型。DEL型在高加索人種較少見，在我國RhD陰性人群中高達26%，絕大部分表現(xiàn)為RHD1227 G＞A堿基突變[1]。關(guān)于RhD陰性患者接受DEL型血液輸注的安全性一直備受臨床輸血界的關(guān)注，通過調(diào)查本院RhD陰性患者接受DEL型血液后體內(nèi)抗-D同種免疫反應(yīng)的產(chǎn)生情況，進一步分析RhD陰性患者接受DEL型血液輸注的安全性，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1 材料

1.1 標(biāo)本來源：收集本院2015年9月～2017年1月微柱玻璃珠卡式法初篩為RhD陰性的41例接受輸血的住院患者，經(jīng)間接抗球蛋白試驗（IAT）鑒定為RhD陰性，男性8例，女性33例，年齡2月~71歲。對41例RhD陰性患者所輸注的65例獻血者血液通過吸收放散試驗進行DEL型檢測，最終確認(rèn)為DEL者17例。

1.2 試劑：血型鑒定及意外抗體篩選用微柱玻璃珠卡 （Ortho-Clinical Diagnostic）；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ號O型抗體篩選用紅細(xì)胞、抗體鑒定用譜細(xì)胞、多特異性抗人球蛋白抗體、標(biāo)準(zhǔn)試劑紅細(xì)胞及抗-C、抗-c、抗-E、抗-e 血清（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；3種不同批號的IgG、IgM混合單克隆抗-D（美國IMMUCOR公司）；QIAamp DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）；RHD 1-10個外顯子引物（上海生工生物有限公司合成）；Mark 50bp DNA Ladder（美國life公司）；DNA溶解液（上海生工生物有限公司合成）；DNA染料（北京賽百盛公司）；Taq酶（上海 Promega公司）；瓊脂糖（法國 Biowest公司）；DNA Isolation Kit 提取試劑盒（北京PEL-FREEZ公司）。

1.3 儀器：AutoVue Innova全自動血型分析儀（美國強生）；2005-2型血型血清學(xué)專用離心機（臺灣BASO）；TDZ4A-WS型水平離心機（湖南湘儀）；PCR擴增儀（美國ABI公司）；DNA測序儀（美國ABI PRISM 3730全自動測序儀）。

2 方法

2.1 吸收放散方法鑒定DEL型：將間接抗人球蛋白法檢測為RhD陰性的獻血者紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3遍后，制成壓積紅細(xì)胞，加入等量的3種不同批號的IgG、IgM混合單克隆抗-D血清，混勻后置37℃水浴箱孵育1 h，采用大口徑試管用生理鹽水將孵育后的壓積紅細(xì)胞洗滌6遍，留取最后1次上清作為平行對照并經(jīng)IAT抗-D檢測為陰性；再加入等量的生理鹽水于壓積紅細(xì)胞中充分混勻，置56℃水浴箱中放散8~10 min，3 000 r/min，離心5 min，吸取200μl放散液并加入O型標(biāo)準(zhǔn)試劑紅細(xì)胞2滴，混勻后37℃水浴30 min，用生理鹽水洗滌3遍后，加入100μl多特異性抗人球蛋白試劑，1 000 r/min，離心1 min，顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.2 采用傳統(tǒng)的試管法檢測患者RhCE表型：參照文獻[2]。

2.3 RHD基因測序分析：參照李勤等[3]報道的方法，采用Sequencing scanner 1. 0 軟件進行分析。2.4 抗-D效價測定：采用傳統(tǒng)的抗人球蛋白試管法動態(tài)監(jiān)測RhD陰性患者輸注DEL型血液前及輸注后1周～12個月體內(nèi)抗-D水平的變化。抽取輸注DEL型血液的RhD陰性患者外周血5 ml于枸櫞酸鈉抗凝管中，充分混勻后離心分離血清，采用微柱玻璃珠卡式法對待測樣本進行意外抗體篩選，對結(jié)果為陽性的樣本進行意外抗體鑒定；對意外抗體鑒定為抗-D的樣本采用經(jīng)典的抗人球蛋白試管法進行效價測定，倍比稀釋待測血清后，每管加入O型標(biāo)準(zhǔn)試劑紅細(xì)胞1滴，置37℃水浴箱孵育30 min，生理鹽水洗滌3遍，再加入100μl多特異性抗人球蛋白試劑，1 000 r/min，離心1 min，顯微鏡下觀察結(jié)果。

結(jié)果

1 DEL表型的血清學(xué)及基因型檢測 通過間接抗人球蛋白法及吸收放散法確認(rèn)后，共有13例RhD真陰性患者輸注了DEL型血液，DEL型獻血者共17例，占總數(shù)的26.12%。DNA測序結(jié)果采用Sequencing scanner 1. 0 軟件分析。將得到的DNA測序結(jié)果與GenBank中的RHD基因序列比對，結(jié)果顯示17例DEL型獻血者均攜帶RHD1227A等位基因，結(jié)果見圖1。

2 RhD陰性患者輸注DEL型血液體內(nèi)抗-D水平的變化 經(jīng)追蹤隨訪13例輸注DEL型血液的RhD陰性患者（男性4例，女性9例），有孕產(chǎn)史的6例，4例為反復(fù)輸血。動態(tài)監(jiān)測13例RhD陰性患者輸注DEL型血液前及輸注后1 周～6 個月期間體內(nèi)抗-D水平變化，結(jié)果顯示12例患者體內(nèi)抗-D水平無任何變化，1例患者體內(nèi)抗-D效價由8升至32，結(jié)果見表1。

圖1 DEL表型RHD基因序列第9外顯子處存在堿基突變1227G→A

表1 13例RhD陰性患者輸注DEL型血液后體內(nèi)抗-D水平變化

討 論

Rh血型系統(tǒng)具有豐富的遺傳多態(tài)性，種族不同，RHD分子遺傳背景也存在一定的差異，且存在多種D變異體。D抗原變異型主要包括弱D及部分D，主要由RHD基因、重組、點突變、mRNA的表達降低等原因?qū)е耓4-6]。DEL型在20世紀(jì)80年代由日本學(xué)者Okubo發(fā)現(xiàn)，是一種極弱的D抗原，采用常規(guī)鑒定方法無法檢測出DEL型，只有通過敏感的吸收放散實驗才能被檢出[7]。與高加索人種相比，DEL型在亞洲人群中呈現(xiàn)高表達，約占總RhD陰性人群的1/3，我國各地區(qū)報道的DEL型比率不同，Shao等[8]報道廣東深圳地區(qū)DEL型占初篩RhD陰性人群的26%。本課題組報道安徽地區(qū)DEL型占初篩RhD陰性人群的比率為22%[9]。采用DNA測序檢測DEL型獻血者RHD基因序列，結(jié)果顯示17例DEL型獻血者均攜帶RHD1227A等位基因。亞洲人群中DEL型個體多數(shù)攜帶完整的RHD基因，國際基因組織最先收錄的DEL型等位基因為RHD1227A等位基因，是由單個核苷酸突變引起的，其等位基因第1 227處堿基G突變?yōu)锳[8，10-12]。 DEL型個體紅細(xì)胞D抗原位點數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常Rh 陽性個體紅細(xì)胞位點數(shù)目。朱美玲等[13]報道DEL型紅細(xì)胞膜表面D抗原的分子數(shù)約為22個。本課題組早在2011年研究發(fā)現(xiàn)DEL型個體基本擁有完整的D抗原表位，同時DEL紅細(xì)胞膜表面D抗原強度極低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于正常RhD陽性紅細(xì)胞，略高于真實RhD陰性紅細(xì)胞。

國外有文獻報道[14，15]RhD 真實陰性受血者輸用DEL型血液后體內(nèi)抗-D 效價升高或抗-D抗體從無到有。我國學(xué)者馮雙利于2001年報道1例RhD陰性患者輸注DEL型血液后體內(nèi)產(chǎn)生抗-D抗體[16]，王寶燕等報道2例輸注DEL型血液的Rh陰性患者，抗-D 效價升高[17]。 目前我國通過間接抗人球蛋白法對RhD陰性獻血者進行弱D篩查，但并未進行DEL型檢測，臨床輸血中DEL型血液一直以此作為RhD陰性血液應(yīng)用于臨床輸血?；就暾腄抗原表位表達及攜帶完整的RHD基因表明DEL型血液仍具有一定的免疫原性，存在導(dǎo)致輸血不良反應(yīng)的風(fēng)險。

本次研究采用傳統(tǒng)的抗人球蛋白試管法，動態(tài)監(jiān)測RhD陰性患者輸注DEL型血液前及輸注后1周～12個月體內(nèi)抗-D水平的變化，從而評價DEL型血液輸注給RhD真陰性患者的安全性，同時采用DNA測序檢測DEL型獻血者的RHD基因序列，結(jié)果顯示17例DEL型獻血者均攜帶RHD1227A等位基因；12例RhD陰性患者體內(nèi)抗-D水平無任何變化，效價均是0，1例RhD陰性患者體內(nèi)抗-D效價由8升至32，結(jié)果提示，DEL型血液具有一定的免疫原性。由于DEL型個體紅細(xì)胞膜表面表達的D抗原數(shù)目較少，不足以引起初次抗-D免疫應(yīng)答，因此，DEL型血液對于患者輸注前體內(nèi)未產(chǎn)生抗-D的RhD陰性患者來說應(yīng)該是安全的，但對于患者輸注前體內(nèi)已存在抗-D抗體的患者應(yīng)避免輸注DEL型血液，因為RhD陰性個體首次輸血或妊娠時機體會被RhD陽性血液致敏，當(dāng)該個體再次受到D抗原刺激時，只需極少量的D抗原陽性的紅細(xì)胞即可激發(fā)B細(xì)胞回憶反應(yīng)，導(dǎo)致大量的抗-D產(chǎn)生。對于DEL型血液輸注的安全性分析尚需擴大樣本量，深入探討不同DEL基因型個體的免疫原性，制定出更加完善的RhD陰性患者血液輸注原則，規(guī)范RhD陰性患者血液輸注流程，確保臨床輸血安全。

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The Safety of DEL Red Blood Transfusion in RhD-negative Recipients

WANG Min，WANG Bao-Long，ZHOU Ming，et al.
Department of Blood Transfusion，Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001

Objective To explore the security of DEL red blood cells transfusion to Rh negative recipient. Methods IAT and adsorption-elution were performed on the investigated blood samples to test RhD-negative recipients and DEL phenotype. RHD genotyping were performed with gene sequencing for DEL phenotypes，anti-D alloimmunization was investigated in RhD-negative recipients transfused with DEL red blood cells. Results All the DEL donors were confirmed to carry RHD RHD1227A allele. The titer and strength of anti-D antibodies of 12 true D-negative recipients who were transfused with DEL blood showed no significant difference. However，the titer of anti-D antibodies of one true D-negative recipient increased from 8 to 32.Conclusions Alloanti-D immune response induced by DEL is a rare event in true D-negative recipients. But DEL donors should be excluded for transfusion to D-negative recipients who had carried anti-D.

DEL Anti-D RHD1227A allel Rh blood group

R457.1+1 R392.13

A

1671-2587（2017）03-0230-04

201-01-05）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.03.006

*本課題受國家自然科學(xué)基金（No.30972815）資助

230001 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院輸血科

王敏（1982–），女，安徽宿州人，主管技師，碩士，主要從事輸血醫(yī)學(xué)工作，（E-mail）1085054623@qq.com。通信作者：王保龍，男，主任技師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事血液免疫學(xué)研究，（E-mail）wbl1965@sohu.com。