低溫保護劑添加與去除過程對豬卵母細胞的滲透損傷

楊云周新麗戴建軍張德福衣星越滕蕓陶樂仁

（1上海理工大學(xué)生物熱科學(xué)研究所 上海 200093；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 上海 201106）

低溫保護劑添加與去除過程對豬卵母細胞的滲透損傷

楊云1周新麗1戴建軍2張德福2衣星越1滕蕓1陶樂仁1

（1上海理工大學(xué)生物熱科學(xué)研究所 上海 200093；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 上海 201106）

在卵母細胞低溫保存過程中，低溫保護劑的添加與去除是必不可少的步驟，但此過程會對細胞造成致命的滲透損傷和毒性損傷。為了研究保護劑添加和去除聯(lián)合過程對豬MII期細胞的損傷程度，本文設(shè)計并制作了一個適合卵母細胞低溫保護劑連續(xù)添加與去除的微流體裝置，分別采用微流控線性法和傳統(tǒng)的分步法加載和去除低溫保護劑，分析了兩種方法對卵母細胞的體積變化以及存活率與發(fā)育潛能的影響。結(jié)果表明：微流控線性法加載和去除低溫保護劑時，卵母細胞的體積變化明顯小于分步法；線性法處理后細胞的存活率、卵裂率、囊胚率分別為95.3%、64.4%、19.4%，都顯著高于傳統(tǒng)的分步法（79.4%、43.6%、9.7%）（P＜0.05）。因此，微流體裝置用于卵母細胞低溫保護劑添加與去除是有效的，能夠顯著減小細胞的滲透損傷，為卵母細胞低溫保存技術(shù)提供了新思路。

低溫保存；低溫保護劑；滲透損傷；卵母細胞

20世紀末D.C.Whittingham［1］和C.Chen［2］相繼成功地冷凍保存了小鼠卵母細胞和人卵母細胞，受精后均獲得了后代。之后，卵母細胞的低溫保存成為低溫生物醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容，一方面能夠使一些珍稀瀕危物種和優(yōu)良品種資源得以延續(xù)，另一方面可為某些因病理或其他原因而推遲生育的婦女提供生育機會［3－4］。隨著研究的深入，多種哺乳動物的卵母細胞已被保存，但保存效果并不理想［5］。目前，學(xué)術(shù)界普遍認為玻璃化冷凍更適合于卵母細胞的冷凍保存，因為玻璃化避免了胞內(nèi)外冰晶的生成［6－7］。但是，要想實現(xiàn)細胞的玻璃化保存，除了較高的降溫速率外，還需要添加高濃度的低溫保護劑［8］。在低溫保護劑添加和去除過程中，由于細胞內(nèi)外滲透壓的急劇變化，大量水或保護劑會快速流出或流入細胞，從而引起細胞體積的膨脹或收縮，造成細胞膜結(jié)構(gòu)的損傷［9］。

為了減小保護劑的滲透作用對卵母細胞的損傷，近年來，研究者對低溫保護劑的添加或去除過程進行了優(yōu)化。解政鼎等［10］認為采用等滲透壓差、滲透時間間隔逐漸減小的方式添加高濃度低溫保護劑，可以最大限度地減輕對細胞的損傷。S.E.Mullen等［11］實驗表明分步法添加6.4 mol／L乙二醇至人卵母細胞時，以四步添加最為理想。Y.S.Heo等［12］采用微流體裝置向卵母細胞中連續(xù)添加1.5 mol／L丙二醇，結(jié)果表明：整個保護劑的添加時間小于15 min，細胞體積的改變量小于10%。C.Mata等［13］提出用微流體裝置去除臍帶血低溫保護劑并制作了水平兩流的微流體裝置，實驗驗證了微流體裝置用于低溫保護劑去除的可行性。盡管這些研究明顯改善了細胞低溫保存的效果，但都是孤立地優(yōu)化添加過程或者去除過程，而事實上，低溫保護劑的添加與去除過程是相關(guān)的，解凍液濃度和平衡時間的選擇依賴于細胞在冷凍液中的濃度和平衡時間。X.Wang等［14］也指出分步法添加與去除牛卵母細胞低溫保護劑時，四步添加結(jié)合兩步去除的方案處理后細胞發(fā)育效果最好。

為了綜合評價添加和去除聯(lián)合過程對細胞的損傷程度，并且填補微流體裝置用于卵母細胞低溫保護劑連續(xù)添加與去除的研究空白，本文設(shè)計制作了一個適合卵母細胞低溫保護劑連續(xù)添加與去除的微流體裝置，比較了微流控線性法和傳統(tǒng)分步法添加與去除低溫保護劑時，豬MII期卵母細胞的體積變化及對卵母細胞存活率與發(fā)育率的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

組織培養(yǎng)液（tissue culture medium 199，TCM199）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、二甲基亞砜（Me2SO）、蔗糖、山梨醇、醋酸鈣、醋酸鎂，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco公司。實驗中所用其他試劑除特別說明外，均購自美國Sigma公司。

1.2 玻璃化冷凍／解凍液

實驗中所用溶液的濃度均為體積比濃度?；A(chǔ)液：TCM199＋20%FBS。分步法玻璃化冷凍液：（VS1）基礎(chǔ)液＋15%Me2SO；（VS2）基礎(chǔ)液 ＋30% Me2SO。微流體線性法玻璃化冷凍液：基礎(chǔ)液＋30% Me2SO。分步法解凍液：（WS1）基礎(chǔ)液＋1 mol／L蔗糖；（WS2）基礎(chǔ)液＋0.5 mol／L蔗糖；（WS3）基礎(chǔ)液。微流體線性法解凍液：基礎(chǔ)液＋1 mol／L蔗糖。

1.3 豬卵母細胞的采集及MII期卵母細胞的獲得

從上海市嘉定區(qū)某屠宰場采集新鮮豬卵巢組織，置于37℃含1 000 μg／mL的雙抗生理鹽水中，1 h內(nèi)運回實驗室。用生理鹽水沖洗2～3次，選擇卵巢表面直徑為2～6 mm的卵泡，用10 mL的一次性注射器將卵母細胞復(fù)合體連同卵泡液一起吸出。將抽出的液體置于10 mL離心管中，在39.5℃的恒溫水浴中靜置15～20 min，移除上清液。取胞質(zhì)均勻且有3層以上致密卵丘細胞的卵丘卵母細胞復(fù)合體，即GV期卵母細胞。將GV期卵母細胞洗滌三次后，置于已平衡4 h以上的成熟培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液為TCM199＋10%FBS＋10%豬卵泡液＋0.1% 血清促性腺激素（PMSG）＋0.1% 人絨毛膜促性腺激素（hCG），然后再放入 CO2培養(yǎng)箱（（39±0.5）℃、5%CO2，BCJ160S，上海博訊實業(yè)有限公司，中國）中，成熟培養(yǎng)44～46 h，得到MII期卵母細胞。MII期卵母細胞用0.1%透明質(zhì)酸酶消化以去除卵丘細胞，再用TCM199洗滌3～5次備用。

1.4 微流體芯片的設(shè)計與制作

用于卵母細胞低溫保護劑連續(xù)添加和去除的微流體芯片主要包括流體混合通道、細胞分析腔、細胞出入通道等，如圖1所示。蛇形混合通道的尺寸（長×寬×高）為100 mm×150 μm×150 μm，兩股流體在混合通道內(nèi)層流擴散混合，實現(xiàn)溶液濃度的連續(xù)線性變化。細胞分析腔的尺寸（長×寬×高）為1 200 μm×1 000 μm×150 μm，卵母細胞經(jīng)細胞通道導(dǎo)入細胞分析腔。為防止卵母細胞被流體沖走，在細胞分析腔的內(nèi)部加工了兩排直徑為100 μm的柱狀障礙物，障礙物之間的間距為50 μm。

采用模塑法制作微流體芯片，首先在硅晶片上利用光刻膠得到微流控芯片結(jié)構(gòu)的光刻模具，然后將PDMS和固化劑混合均勻并澆注在模具上，完全固化后將PDMS材料從模具上剝落下來，得到刻有微通道的微流控芯片基片；將PDMS基片和PDMS蓋片對齊復(fù)合完成封接，然后置于75℃的烘箱中加熱10 min，得到牢固的PDMS芯片；最后在芯片的制定位置處用鉆孔器打四個直徑為0.6 mm的孔，用塑料管連接注射泵和口吸器，使流體和細胞進出微流體芯片。

1.5 微流控線性法和分步法添加與去除低溫保護劑

實驗中，微流控線性法和分步法添加與去除低溫保護劑的具體程序如圖2所示。

圖1 微流控線性法添加與去除低溫保護劑的示意圖Fig.1 The schematic diagram of CPA loading and unloading with the microfluidic linear method

圖2 線性法和分步法添加與去除低溫保護劑的程序Fig.2 The protocols of CPA loading and unloading with the step?wise method and the microfluidic method

微流控線性法：在導(dǎo)入卵母細胞前，先用基礎(chǔ)液充滿混合通道，然后用口吸器將卵母細胞吹入細胞分析腔并開啟注射泵（Pump 11 Plus微量注射泵：Harvard，美國），通過注射泵分別將基礎(chǔ)液和高濃度的低溫保護劑注入微流體芯片內(nèi)，保持混合通道內(nèi)總流量為1.2 μL／min，控制基礎(chǔ)液的流量從1.2 μL／min減小到0 μL／min，同時保護劑的流量從0 μL／min減小到1.2 μL／min，使胞外保護劑體積濃度從0線性增加到30%，加載時間為10 min。完成低溫保護劑的添加后，不取出卵母細胞，迅速更換注射溶液（基礎(chǔ)液和解凍液）進行低溫保護劑的去除，保持混合通道內(nèi)溶液的總流量為5 μL／min，控制基礎(chǔ)液的流量從0 μL／min增加到5 μL／min，同時解凍液的流量從5 μL／min減小到0 μL／min，使細胞外解凍液濃度從1 mol／L線性減小到0 mol／L，去除時間為8 min。

分步法：將卵母細胞從基礎(chǔ)液中移至體積濃度為15%Me2SO中平衡3 min，然后移至體積濃度為30% Me2SO中平衡30 s，然后快速轉(zhuǎn)移至1 mol／L蔗糖溶液中平衡2 min，然后移至0.5 mol／L蔗糖溶液中平衡3 min，然后轉(zhuǎn)移至基礎(chǔ)液中平衡3 min。

1.6 細胞圖像采集與數(shù)據(jù)處理

在低溫保護劑添加與去除過程中，用帶有圖像采集系統(tǒng)的顯微鏡（TS100倒置熒光顯微鏡：Nikon，日本）連續(xù)記錄并獲取整個過程中卵母細胞（n＝5）的體積變化圖片。假設(shè)卵母細胞為理想球體，利用圖像分析軟件測量細胞的二維投影面積，再通過球體體積與投影面積的換算關(guān)系式（V＝0.752 S3／2），計算得到細胞的體積變化。

1.7 細胞存活率與發(fā)育率判斷

按照實驗中設(shè)計的方案添加與去除冷凍保護劑后，將卵母細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中，放入CO2培養(yǎng)箱孵育1 h，然后將一部分細胞用熒光素雙醋酸酯（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）染色5 min，再用TCM199洗3～5遍，在倒置熒光顯微鏡下觀察是否著色。有強熒光反應(yīng)的為活卵，無熒光反應(yīng)或弱熒光反應(yīng)的為死卵。活卵數(shù)與細胞總數(shù)之比為存活率。將另一部分細胞進行孤雌激活，激活后的細胞轉(zhuǎn)移至胚胎培養(yǎng)液中，然后放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)的第二天和第七天觀察細胞卵裂率和囊胚率。每組實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)分析軟件SPSS Statistics 13.0進行顯著性分析，P ＜0.05為顯著性差異標準。

2 結(jié)果與討論

2.1 微流控線性法與分步法添加與去除低溫保護劑時卵母細胞的體積變化

圖3所示為微流控線性法與分步法添加與去除低溫保護劑時卵母細胞的體積變化。由圖3可知，分步法添加與去除低溫保護劑時，細胞體積會出現(xiàn)多次的膨脹和收縮，而且去除過程中細胞體積的變化幅度要明顯大于添加過程，其中最小收縮歸一化體積達到了0.46±0.07，該變化趨勢與文獻［15］中小鼠卵母細胞體積變化的模擬結(jié)果一致，說明低溫保護劑去除過程對細胞的滲透損傷要比添加過程大。另外，分步法添加與去除冷凍保護劑也會增加細胞的丟失率，導(dǎo)致實驗的重復(fù)性差［16］。線性法加載與去除冷凍保護劑時，卵母細胞的體積也會出現(xiàn)先縮小后膨脹的變化趨勢，但其變化明顯小于分步法，最小收縮歸一化體積和最大膨脹歸一化體積分別為0.95±0.03、1.07 ±0.03，因而微流控線性法能夠顯著減小卵母細胞的滲透損傷。

圖3 微流控線性法與分步法添加與去除保護劑時豬MII期卵母細胞的體積變化Fig.3 Experimental MII porcine oocyte volumetric responses as CPAs were loaded and unloaded with the step?wise method and the microfluidic linear method

2.2 微流控線性法與分步法添加與去除低溫保護劑對卵母細胞存活率與發(fā)育率的影響

表1所示為微流控線性法和分步法添加與去除低溫保護劑后卵母細胞存活率與發(fā)育率的結(jié)果。由表1可知，分步法處理后細胞的存活率、卵裂率、囊胚率分別為79.4%、43.6%、9.7%。線性法處理后細胞的存活率與發(fā)育率都顯著高于分步法，其中存活率、卵裂率、囊胚率依次提高了 15.9%、20.8%、9.7%，與對照組之間無顯著性差異。這說明微流體裝置用于卵母細胞低溫保護劑添加與去除是有效的，能夠顯著減小細胞的滲透損傷，從而進一步提高細胞的存活率與發(fā)育潛能。Y.S.Song等［17］將微流體裝置用于肝細胞低溫保存的保護劑加載與去除過程，處理后細胞的存活率比一步法高25%，比兩步法高10%，同時還指出微流體裝置更適合應(yīng)用于一些滲透敏感性的細胞，比如卵母細胞和胚胎干細胞。然而，對于微流體裝置也存在不同的結(jié)論，N.Guan等［18］采用微流控裝置連續(xù)加載并去除肝臟切片的冷凍保護劑，結(jié)果表明：連續(xù)法能夠顯著減小滲透壓的變化速率，但是與分步法相比，其并不能改善肝臟切片的存活率。兩者結(jié)論差異的原因可能是所用微流控裝置結(jié)構(gòu)和操作方法不同，另外，組織和細胞對保護劑的滲透特性也存在較大差異。

表1 微流控線性法和分步法添加與去除保護劑對豬MII期卵母細胞存活率與發(fā)育率的影響Tab.1 Effects of loading and unloading CPA with the step?wise method and the microfluidic linear method on the survival rate and developmental rate of MII porcine oocytes

注：a，b表示不同字母表示組之間有顯著性差異，P ＜0.05。

3 結(jié)論

為了綜合評價保護劑添加和去除聯(lián)合過程對細胞的損傷程度，本文設(shè)計制作了一個適合卵母細胞低溫保護劑連續(xù)添加與去除的微流體裝置，研究了微流控線性法添加與去除低溫保護劑時，卵母細胞的體積變化及對卵母細胞存活率與發(fā)育率的影響，并與傳統(tǒng)的分步法進行了比較，主要結(jié)論如下：

1）采用微流控線性法加載與去除低溫保護劑時，豬MII期卵母細胞的體積變化明顯小于分步法，其中最小收縮歸一化體積和最大膨脹歸一化體積分別為0.95±0.03、1.07±0.03，說明線性法能夠顯著減小對卵母細胞的滲透損傷。

2）微流控線性法處理后細胞的存活率、卵裂率、囊胚率分別為95.3%、64.4%、19.4%，都顯著高于傳統(tǒng)的分步法（79.4%、43.6%、9.7%）（P＜0.05）。

本文受上海市國家重點實驗室（1N15301101）項目資助。（The project was supported by the National Key Laboratory of Shanghai（No.1N15301101）.）

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Osmotic Injury to Porcine Oocytes during Cryoprotective Agents Addition and Removal Processes

Yang Yun1Zhou Xinli1Dai Jianjun2Zhang Defu2Yi Xingyue1Teng Yun1Tao Leren1
（1.Institute of Biothermal Technology，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai，200093，China；2.Animal and Veterinary Research Institute，SAAS，Shanghai，201106，China）

Oocyte cryopreservation has become a practical tool in assisted reproductive technology and fertility preservation.Cryoprotective agents（CPAs）addition and removal are essential steps during oocytes cryopreservation，however，the processes of CPAs addition and removal may cause fatal osmotic and toxic injuries to oocytes.In order to study the injuries of porcine MII-stage oocytes during CPAs addition and removal combined processes and minimize osmotic and toxic injuries to oocytes，primarily，a microfluidic device for continuous loading and unloading of CPAs was designed and fabricated in this study.CPAs were loaded and unloaded with the microfluidic linear method and the conventional step-wise method，respectively.Then，the cell volume changes and the effects on the survival rate and developmental potential of oocytes were investigated.The results showed that the oocyte volume changes with the microfluidic device were obviously less than step-wise method.The survival，cleavage and blastocyst rate of oocytes were 95.3%，64.4%，and 19.4%，respectively，which were significantly higher than the traditional step-wise method（79.4%，43.6%，and 9.7%）（P＜0.05）.In conclusion，microfluidic device can be used efficiently to load and unload of CPAs，and significantly reduce the osmotic shock to oocytes，which may open up a new path for oocyte cryopreservation.

cryopreservation；cryoprotective agents（CPAs）；osmotic injury；oocyte

TB61＋1；R318.52；Q27

：A

0253－4339（2017）03－0114－05

10.3969／j.issn.0253－4339.2017.03.114

周新麗，女，副教授，上海理工大學(xué)生物熱科學(xué)研究所，（021）55270218，E-mail：zjulily＠163.com。研究方向：生物材料的低溫保存?，F(xiàn)在進行的項目有：國家自然科學(xué)基金項目（51376132）——卵母細胞微流體低溫保存過程的理論與實驗研究。

國家自然科學(xué)基金（51376132）資助項目。（The project was supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 51376132）.）

2016年7月28日

About the corresponding author

Zhou Xinli，female，associate professor，Institute of Biothermal Technology，University of Shanghai for Science and Technology，＋86 21-55270218，E-mail：zjulily＠163.com.Research fields：cryopreservation of biomaterials.The author takes on project supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 51376132）：theoretical and experimental research on oocyte cryopreservation in microfluidic device.