超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中三種頭孢菌素類抗生素的研究

王建鳳，石佳麗，劉艷，杜振霞，賈麗，馮月超，范筱京，張經(jīng)華

(1.北京化工大學(xué)，北京 100029；2.北京市理化分析測(cè)試中心，北京市食品安全分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心，北京 100089；3.北京聯(lián)合大學(xué)旅游學(xué)院，北京 100101)

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中三種頭孢菌素類抗生素的研究

王建鳳1,2，石佳麗2,3，劉艷2，杜振霞1，賈麗2，馮月超2，范筱京2，張經(jīng)華2

(1.北京化工大學(xué)，北京 100029；2.北京市理化分析測(cè)試中心，北京市食品安全分析測(cè)試工程技術(shù)研究中心，北京 100089；3.北京聯(lián)合大學(xué)旅游學(xué)院，北京 100101)

本試驗(yàn)建立了固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（SPE-UPLC-MS/MS）同時(shí)檢測(cè)牛奶中3種頭孢菌素類抗生素含量的方法，同時(shí)對(duì)三種物質(zhì)斷裂機(jī)理進(jìn)行考察。樣品用0．5mol/L的磷酸二氫鉀緩沖溶液提取，MCX固相萃取柱進(jìn)行凈化，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測(cè)定，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式進(jìn)行定性和定量分析。3種頭孢菌素類抗生素的檢出限（S/N=3）范圍為0．1～0．5μg/kg，定量限（S/N=10）范圍為0．25～1μg/kg，樣品加標(biāo)回收率范圍為90%～117%。

MCX固相萃??；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；頭孢菌素類抗生素；牛奶

頭孢菌素類抗生素是分子中含有頭孢烯的半合成抗生素，又稱先鋒霉素類抗生素，其作用方式是殺菌性的，對(duì)各種細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生菌也具有優(yōu)異的抗菌活性，其臨床治療效率高、抗菌譜廣、殺菌力強(qiáng)，相比青霉素更具耐酸及耐青霉素酶、過敏反應(yīng)少、毒性低等特性[1]，因此在獸醫(yī)臨床及禽畜飼養(yǎng)中得到廣泛的應(yīng)用。針對(duì)畜禽在飼養(yǎng)過程中易濫用頭孢菌素類抗生素引起的殘留，可能會(huì)導(dǎo)致消費(fèi)者在食用后帶來的健康損害、抗藥及過敏的風(fēng)險(xiǎn)問題[2]，動(dòng)物源性食品中抗生素殘留問題必須引起高度重視。

目前，針對(duì)頭孢菌素類抗生素的檢測(cè)，鐘長(zhǎng)鳴等[3]運(yùn)用液相色譜法測(cè)定片、膠囊、顆粒中的頭孢羥氨芐，為藥典中頭孢羥氨芐的測(cè)定提供了參考；夏登寧等[4]運(yùn)用液相色譜法測(cè)定血漿中的頭孢氨芐，采用流動(dòng)相為pH3.0的0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液：乙腈：甲醇(76∶16∶8)，色譜行為良好；何文亮等[5]運(yùn)用表面活性劑增敏熒光分光光度法測(cè)定牛奶中頭孢拉定，利用頭孢拉定在堿性條件下降解產(chǎn)物熒光強(qiáng)度被表面活性劑增敏特性，運(yùn)用熒光分光光度法對(duì)牛奶中的頭孢拉定進(jìn)行測(cè)定；郭丹等[6]運(yùn)用高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定注射用頭孢拉定的含量，該方法準(zhǔn)確快速，可為頭孢拉定的質(zhì)量控制提供參考；何東旭等[7]運(yùn)用高效毛細(xì)管電泳同時(shí)測(cè)定了頭孢噻肟與頭孢羥氨芐，方法精密度高。報(bào)道較多的是液相色譜法[1,3,4]、熒光分光光度法[5]、毛細(xì)管電泳法[6,7]等，但這些方法的靈敏度均較低。

為了進(jìn)一步提高頭孢菌素類抗生素檢測(cè)技術(shù)的靈敏度和定性、定量準(zhǔn)確度，以液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）為代表的高靈敏度質(zhì)譜技術(shù)的開發(fā)成為抗生素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)[8～11]。Nasi Li等[9]建立了同時(shí)檢測(cè)牛奶中2種頭孢菌素類的UPLC-MS/MS的分析方法；張奧博[10]建立了牛奶中3種頭孢菌素類物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)的UPLC-MS/MS的分析方法。Xiao-Lin Hou等[11]建立了牛奶中頭孢拉定和頭孢噻吩的UPLC-MS/MS的分析方法，并運(yùn)用固相萃取進(jìn)行凈化；王建鳳等[12]運(yùn)用HLB固相萃取柱，建立了牛奶中6種頭孢菌素類的分析方法。

本試驗(yàn)針對(duì)3種堿性頭孢菌素類抗生素，考察了其斷裂機(jī)理，同時(shí)由于MCX對(duì)于凈化和富集堿性化合物效果較好，運(yùn)用MCX固相萃取柱，建立了牛奶中3種堿性頭孢菌素類抗生素的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)中。

1 材料與方法

1．1 儀器與試劑

UPLC XEVO-TQ MS型超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters公司）；Acquity UPLC BEH C18色譜柱（1.7μm，2.1＊50mm，Waters公司）；CR22G高速冷凍離心機(jī)（Hitachi公司）；Vortex-Genie 2渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；N-EVAP112氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；OASIS MCX固相萃取柱（6cc，500mg，Waters公司）。

乙酸銨（色譜純，北京百靈威科技有限公司）；甲醇（色譜純，Optima公司）；甲酸（色譜純，Alfa Aesar公司）；氫氧化鈉（分析純，西隴化工股份有限公司）；鹽酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸氫二鉀（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氨水（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸鋅（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水。

0.05 mol/LPBS：稱取11.4g磷酸氫二鉀溶解于1L超純水中，使用時(shí)用1mol/L NaOH和6mol/L HCl調(diào)節(jié)至合適的pH值；2%甲酸（V/V）：準(zhǔn)確量取2mL甲酸，與98mL超純水混合均勻；2%氨水-甲醇（V/V）：準(zhǔn)確量取2mL氨水，與98mL甲醇混合均勻；0.5mmol/L乙酸銨水溶液（A）：稱取0.193g乙酸銨溶解于0.5L超純水中，過0.45μm濾膜，用甲酸調(diào)pH值至5。183g/L乙酸鋅水溶液：稱取219g乙酸鋅于燒杯中，加少量水超聲溶解，待溶解后轉(zhuǎn)移至1L的容量瓶中，多次洗滌燒杯，合并洗滌液于容量瓶中，再加入32mL乙酸，用水定容至刻度。

頭孢類標(biāo)準(zhǔn)品的1 000mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于4℃。用甲醇-水（5∶95，V/V）稀釋，得1mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1．2 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：B E H C 1 8色譜柱（1.7μm，2.1＊50mm）；流動(dòng)相：0.5mmol/L乙酸銨水溶液（A，pH=5）和甲醇（B）；流速：0.2mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：5μL。梯度洗脫程序：0～2min，5%～10%B；2～5min，10%～25%B；5～7min，25%～35%B；7～9min，35%～95%B；9～11.5min，95%～5%B。

質(zhì)譜條件：采用MRM模式，ESI（+）分析。MRM參數(shù)見表1。

表1 3種頭孢菌素類抗生素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)

1．3 樣品處理

1.3.1 樣品提取

準(zhǔn)確稱取2g牛奶樣品于塑料離心管中，加入6mLPBS，渦旋混勻20s，再加入6mL乙酸鋅溶液，渦旋混勻20s后離心10min，取上清液，待凈化。

1.3.2 樣品凈化

將固相萃取柱依次用12mL甲醇、6mLPBS活化。樣品以3mL/min的流速過柱。依次用3mLPBS、6mL2%甲酸、6mL甲醇淋洗柱，抽干，并用6mL2%氨水-甲醇洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液，于40℃氮吹至近干，用甲醇-水（5∶95，V/V）溶液定容至1mL，過0.22μm濾膜后待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜條件和質(zhì)譜條件

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化及其斷裂機(jī)理研究

為得到待測(cè)頭孢菌素類抗生素的最佳質(zhì)譜條件，用甲醇-水（5∶95，V/V）溶液分別配制3種頭孢菌素類抗生素的1mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，直接進(jìn)行質(zhì)譜分析，一級(jí)質(zhì)譜全掃描確定其準(zhǔn)分子離子峰，3種待測(cè)物質(zhì)均在ESI+模式下獲得準(zhǔn)分子離子峰。以準(zhǔn)分子離子峰為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，選擇相對(duì)豐度較高的兩個(gè)碎片離子作為定量和定性離子，分別優(yōu)化各個(gè)離子對(duì)的錐孔電壓和碰撞能量，其最優(yōu)條件見表1。

三種物質(zhì)的主要斷裂形式均為β-內(nèi)酰胺鍵斷裂，頭孢氨芐和頭孢拉定均有158的碎片離子，該碎片離子為β-內(nèi)酰胺鍵直接斷裂，而頭孢羥氨芐的114碎片離子則為β-內(nèi)酰胺鍵直接斷裂后的碎片離子又失去羧基官能團(tuán)而產(chǎn)生。

圖1 3種物質(zhì)的相同斷裂機(jī)理示意圖

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

以C18為色譜柱，甲醇-乙酸銨水溶液和乙腈-乙酸銨水溶液兩個(gè)體系分別作為流動(dòng)相，考察3種頭孢菌素類抗生素在不同流動(dòng)相體系中的響應(yīng)，結(jié)果如圖2所示，以甲醇-乙酸銨水溶液為流動(dòng)相的靈敏度高于乙腈-乙酸銨水溶液，因此試驗(yàn)時(shí)選用甲醇-乙酸銨水溶液體系作為流動(dòng)相。在該體系中，pH對(duì)頭孢拉定的影響不大；與該體系pH為5時(shí)作比較，當(dāng)pH為3時(shí)，頭孢羥氨芐有明顯增加，然而頭孢氨芐響應(yīng)降低41.45%，當(dāng)pH為4時(shí)，頭孢羥氨芐響應(yīng)下降32.97%，綜合考慮，選擇甲醇-乙酸銨水溶液體系為流動(dòng)相，并用甲酸調(diào)節(jié)pH為5，其色譜圖如圖3。

圖2 流動(dòng)相選擇優(yōu)化圖

圖3 3種物質(zhì)的色譜圖

2．2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性

頭孢菌素類抗生素中含有的β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在酸、堿條件下會(huì)發(fā)生降解，中性條件下可能發(fā)生水解或分子重排[9]。為保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，考察了放置溫度以及放置2d的標(biāo)準(zhǔn)溶液與新配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)強(qiáng)度比值。

2.2.1 放置溫度對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性的影響

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于室溫（25℃）和冷藏（4℃）條件下放置1d，比較不同條件下放置標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性差異。結(jié)果如圖4所示，25℃和4℃下各標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積分別相差1.32%、3.28%、6.44%，相差不大，因此該標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫下放置1d和冷藏放置1d對(duì)試驗(yàn)結(jié)果基本無影響。

圖4 25℃和4℃條件下放置1d標(biāo)準(zhǔn)溶液的穩(wěn)定性

2.2.2 放置時(shí)間對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性的影響

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液于4℃冷藏放置2d后與現(xiàn)配制的相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，測(cè)其穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5所示：各標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積相差分別為4.31%、8.32%、2.82%，相差不大，因此4℃冷藏放置2d的標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性與現(xiàn)配的標(biāo)準(zhǔn)溶液相差不大。一般情況下，標(biāo)準(zhǔn)溶液均采用現(xiàn)用現(xiàn)配，然而特殊情況下，基于穩(wěn)定性的測(cè)試，可以考慮使用冷藏條件下放置2d的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

圖5 冷藏放置2d和現(xiàn)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性

2．3 濾膜的影響

735 Human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosomes promotes fracture healing in rats

運(yùn)用超高效液相色譜柱進(jìn)行分析的樣品，通常需要運(yùn)用濾膜進(jìn)行過濾，然而部分化合物容易被濾膜所吸附，因此將配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別過膜和不過膜，比較過膜是否對(duì)待測(cè)化合物吸附，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。通過比較標(biāo)準(zhǔn)溶液過膜和不過膜后的試驗(yàn)結(jié)果，峰面積相差分別為1.96%、8.59%、13.92%，均在誤差范圍內(nèi)，因此認(rèn)為濾膜對(duì)待測(cè)化合物吸附作用不明顯。

圖6 濾膜對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的影響

2．4 提取液的優(yōu)化

由于頭孢菌素類抗生素的結(jié)構(gòu)中都同時(shí)含有酸性和堿性基團(tuán)，化合物結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，性質(zhì)差別比較大，通常均易溶于水，受pH值的影響也比較大，在樣品提取操作中，使用1mol/L的NaOH和6mol/L的HCl調(diào)節(jié)PBS的pH值，使用pH為6.5的PBS提取[12]。

由于提取液的體積對(duì)提取效率起著至關(guān)重要的作用，因此對(duì)提取液PBS的體積進(jìn)行優(yōu)化。分別選擇6mL、8mL、10mL進(jìn)行試驗(yàn)，觀察試驗(yàn)結(jié)果。如圖7所示，隨著提取液體積的增加，回收率基本穩(wěn)定不變，因此選擇提取液的體積為6mL。

圖7 提取液體積對(duì)回收率的影響

2．5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限、定量限、回收率、精密度

2.5.1 檢出限和定量限

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

配制一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述分析條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，各物質(zhì)在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，3種物質(zhì)線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.995。

2.5.3 回收率和精密度

在空白的牛奶基質(zhì)中添加高、中、低三個(gè)水平混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收率試驗(yàn)，按照2.3.1和2.3.2的方法進(jìn)行樣品制備，測(cè)定方法回收率和精密度列于表2，回收率的結(jié)果均介于90%～117%，精密度（RSD）小于14%。

2.5.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

將本方法用于市售牛奶樣品的檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果表明，均未檢出上述3種頭孢菌素類抗生素。

表2 3種頭孢菌素類抗生素在牛奶基質(zhì)中的檢出限、定量限、添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

本研究采用UPLC-MS/MS測(cè)定牛奶中的3種頭孢菌素類抗生素藥物殘留，并對(duì)其斷裂機(jī)理進(jìn)行研究。采用pH為6.5的PBS作為提取液，經(jīng)MCX固相萃取柱凈化，運(yùn)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量。目前歐盟EC 2002/657/EC[13]規(guī)定頭孢氨芐在牛奶中的最大殘留限量為100μg/kg，因此該方法能夠滿足牛奶樣品中頭孢菌素類抗生素的分析要求。

[1] 蔡玉娥,蔡亞岐,牟世芬,等． 高效液相色譜-紫外光度法檢測(cè)尿液和牛奶中多種頭孢類抗生素[J]．分析化學(xué),2006,6(6):745-748．

[2] Beconi-Barker MG． et al． Determination of ceftiofur and its desfuroylceftiofur-related metabolites in swine tissues by highperformance liquid chromatography[J]． Journal of Chromatography B: Biome Appl,1995,673(2):231-244．

[3] 鐘長(zhǎng)鳴,劉緒平,龔瑋,等． HPLC法測(cè)定頭孢羥氨芐及其有關(guān)物質(zhì)含量[J]．中國(guó)抗生素雜志,2004,29(11): 648-649．

[4] 夏登寧,夏艷姣,尹佳,等． HPLC同時(shí)測(cè)定血漿中頭孢氨芐和甲氧芐啶的濃度[J]．中國(guó)抗生素雜志,2008,33(11):682-684．

[5] 何文亮,羅濤,周璇,等． 表面活性劑增敏熒光分光光度法測(cè)定牛奶中頭孢拉定[J]．分析試驗(yàn)室,2014,33(1):92-95

[6] 郭丹,陳娜娜,晏媛,等． 高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定注射用頭孢拉定的含量[J]． 中國(guó)藥房,2005,16(2):135-136

[7] 何東旭,孟歡歡,陳玎玎,等． 高效毛細(xì)管電泳同時(shí)測(cè)定頭孢噻肟與頭孢羥氨芐[J]． 畜牧獸醫(yī)雜志,2008,27(6):5-7．

[8] 孫艷俠．高效液相色譜在乳品抗生素殘留檢測(cè)中的應(yīng)用[J]． 山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010,38(3):10-13．

[9] Nasi Li, Feng Feng, Bingcheng Yang, et al． Simultaneous determination of β-lactam antibiotics and β-lactamase inhibitors in bovine milk by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]． Journal of Chromatography B, 2014, 945-946: 110-114．

[10] 張奧博．芐星頭孢匹林和頭孢洛寧在牛奶中殘留檢測(cè)方法及其乳房灌注劑棄奶期研究[D]．揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué), 2013．

[11] Xiao-Lin Hou, Yin-Liang Wu, Yan Lv, et al． Development and validation of an ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for determination of 10 cephalosporins and desacetylcefapirin in milk[J]． Journal of Chromatography B, 2013, 931: 6-11．

[12] 王建鳳,劉艷,楊一帆,等． 固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中6種頭孢菌素類抗生素[J]． 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2015,6(9): 3380-3386．

[13] European Commission Decision 2002/657/ EC[S]．

Simultaneous Determination of Cefadroxil, Cephalexin and Cefradine in Milk by Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

WANG Jian-feng1,2, SHI Jia-li3, LIU Yan2, DU Zhen-xia1, JIA Li2, FENG Yue-chao2, FAN Xiao-jing2,ZHANG Jing-hua2
(1.Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029; 2.Beijing Engineering Research Center of Food Safety Analysis, Beijing Centre for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089; 3.College of Tourism, Beijing Union University, Beijing 100101)

To developed a method for the detection of 3 kinds of cephalosporins in milk by solid phase extraction coupled with ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPE-UPLC-MS/MS). The same fracture mechanism of the three cephalosporins was investgated. The samples were extracted with 0.05 mol/L phosphate buffer solution, cleaned up by MCX solid phase extraction column, and then analyzed by UPLC-MS/MS with multiple reaction monitoring (MRM) mode. The LODs and LOQs of 3 kinds of cephalosporins were in the range of 0.1～0.5 μg/kg and 0.25～1μg/kg, respectively, with the mean recoveries varied from 90% to 117%.

MCX; UPLC-MS/MS; Cephalosporins; Milk

TS251.1

A

1004-4264（2017）05-0040-05

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.05.011

2016-10-24

北京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Z141100002614020）。

王建鳳，助理研究員，主要研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)技術(shù)。

杜振霞，教授，主要研究方向?yàn)槭称芳安牧蠙z測(cè)技術(shù)。