冠心病患者血小板紫外光譜的變化

周 銘 唐海沁 符趙鑫 劉 銘

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心內(nèi)科，安徽 合肥 230000)

·心、腦血管及代謝性疾病·

冠心病患者血小板紫外光譜的變化

周 銘 唐海沁 符趙鑫 劉 銘

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心內(nèi)科，安徽 合肥 230000)

目的 觀察冠心病患者血小板紫外光譜的變化。方法 檢測對(duì)象分為冠心病組和對(duì)照組，冠心病組包括氯吡格雷組和阿司匹林組。提取血小板體外誘導(dǎo)聚集，采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描得到紫外光譜數(shù)據(jù)，應(yīng)用Origin8.0及SPSS13.0軟件分析。結(jié)果 血小板紫外光譜在204 nm和280 nm波長處可見吸收峰，血小板聚集后在204 nm波長處吸收峰顯著大于聚集前；冠心病組與正常組以及冠心病組內(nèi)氯吡格雷組和阿司匹林組血小板紫外光譜波峰出現(xiàn)位置差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 紫外光譜可用于臨床檢測血小板聚集，為其提供一種更為靈敏、準(zhǔn)確的測定方法。

血小板聚集；紫外光譜；冠心病

在冠心病發(fā)生和發(fā)展中，血小板的活化和聚集是重要環(huán)節(jié)，不僅能夠作為診斷冠心病的佐證，也可以用來預(yù)測冠心病的風(fēng)險(xiǎn)度〔1〕。臨床上，抗血小板治療作為冠心病治療的基石，在一級(jí)和二級(jí)預(yù)防都起著至關(guān)重要的作用。目前血小板聚集的檢測方法由于體內(nèi)血栓形成環(huán)境的復(fù)雜性只能粗糙和間接估計(jì)血小板聚集情況，不能充分反映血小板聚集的功能狀態(tài)〔2〕，尋求簡單、可行的反映血小板聚集程度的臨床檢測方法成為心血管研究內(nèi)容之一。紫外光譜能夠在一定程度上反映有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛〔3〕。本研究應(yīng)用光譜學(xué)原理將紫外光譜檢測應(yīng)用于老年冠心病患者血小板聚集的研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇60歲以上住院服用抗血小板藥時(shí)間1 w以上的冠心病患者20例，男14例，女6例，平均年齡(78±7)歲，根據(jù)服用藥物分為氯吡格雷組和阿司匹林組各10例，藥物劑量為氯吡格雷75 mg/d或阿司匹林100 mg/d；同時(shí)選擇10例健康青年志愿者作為對(duì)照組，男6例，女4例，平均年齡(24±1)歲。

1.2 儀器與試劑 雙光束紫外可見光分光光度計(jì)(北京譜析通用儀器有限公司 TU1901)；比色皿(1 mm光程)；超聲波清洗器；離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5415R)；10～1 000 μl加樣器(德國Eppendorf Research plus)，0.5～10 μl加樣器(Flnnplpeffe Y351084027)；真空采血管、EP管；二磷酸腺苷(ADP，美國Sigma公司A2754-100 mg)；花生四烯酸(AA，Sigma公司A9673-10 mg)；無水CaCl2(國產(chǎn)分析純)；生理鹽水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血小板制備 真空采血管取兩組患者2 ml的1∶9檸檬酸鈉抗凝血作為樣本，用移液器將2 ml血移入EP管后放入離心機(jī)離心，采用Alhaloo法二次離心得到血小板沉淀，二次離心時(shí)的乏血小板血漿上清(PPP)留200 μl備用：取3 μl于比色皿，再將剩余的PPP與血小板沉淀混勻，然后各取混懸液3 μl于另兩個(gè)比色皿內(nèi)。

1.3.2 血小板的誘導(dǎo)聚集 移液器吸取CaCl2及誘導(dǎo)劑加入含3 μl血小板懸液的比色皿內(nèi)，其中氯吡格雷組加誘導(dǎo)劑ADP、阿司匹林組加AA誘導(dǎo)聚集，并使得最終濃度CaCl210 mmol/L，AA 0.7 mmol/L，ADP 10 μmol/L〔4〕。一份是混勻并充分反應(yīng)后稀釋至4 ml；另一份則是待稀釋至4 ml后加入等量的誘導(dǎo)劑，比色皿內(nèi)PPP血小板稀釋后加入CaCl2及誘導(dǎo)劑，反應(yīng)時(shí)間控制在10 min內(nèi)。正常組加入誘導(dǎo)劑ADP并作同樣的處理誘導(dǎo)聚集。

1.3.3 紫外光譜檢測 稀釋后的血小板充分混勻后放入紫外分光光度計(jì)，設(shè)置紫外光譜掃描范圍200～400 nm，掃描間隔為0.2 nm?；€采用同等量的CaCl2及誘導(dǎo)劑稀釋至4 ml校準(zhǔn)，保證變量是加入的血小板并消除加入的誘導(dǎo)劑對(duì)紫外光譜的影響。檢測完后用超聲清洗比色皿，防止殘留物。實(shí)驗(yàn)過程從釆血至上機(jī)檢測在3 h〔5〕內(nèi)完成。UVWIN5.0軟件將紫外光譜檢測數(shù)據(jù)導(dǎo)出，采用Origin8.0軟件作圖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

血小板在紫外區(qū)204 nm、280 nm處出現(xiàn)吸收峰，在加用誘導(dǎo)劑后，氯吡格雷組和阿司匹林組，血小板紫外光譜在204 nm波長吸光度顯著改變且聚集后吸光度峰值大于聚集前(P<0.05)，見表1。正常組波峰位置出現(xiàn)也在204 nm波長處，與冠心病組比較紫外光譜未見差異。冠心病組與對(duì)照組性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.69)。

表1 血小板紫外光譜204 nm波長處吸光值

3 討 論

血小板具有細(xì)胞膜系統(tǒng)和細(xì)胞骨架蛋白，特殊的儲(chǔ)存顆粒和線粒體、溶酶體等細(xì)胞器，而冠心病患者中，血小板的活化標(biāo)志物CD62p、血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅱa受體(PAC)-1等表達(dá)率明顯高于正常，平均體積和分布寬度也會(huì)顯著增高〔6〕，可以看出血小板反應(yīng)紫外光譜是各種物質(zhì)的綜合光譜。以往人單個(gè)血小板拉曼光譜的研究其振動(dòng)峰主要顯示的是蛋白質(zhì)和脂肪的混合峰，也有718 cm-1處磷脂分子C-N鍵938 cm-1處脂肪鏈C-C骨架的振動(dòng)峰〔7〕。我們的結(jié)果表明血小板在204 nm和280 nm波長處具有紫外吸收峰，其位置反映的是分別是羧基和蛋白質(zhì)中的共軛苯環(huán)體系，其中204 nm波長處血小板聚集前后的紫外光譜有著顯著變化。檢索相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)血小板在近紅外光波長420 nm-1有吸收峰〔8〕，并隨著血小板濃度改變而變化，尚未發(fā)現(xiàn)紫外光譜應(yīng)用于血小板研究的報(bào)道，本研究結(jié)果為臨床檢測血小板聚集程度提供新的參考方法，可依據(jù)聚集前后血小板特定波長處紫外吸收峰值的變化占聚集前吸光度的比值來反映血小板聚集率。

血小板在204 nm波長處的改變與血小板的聚集密切相關(guān)。在聚集過程中血小板活化膜糖蛋白(GP)會(huì)重新分布，膜GPⅡb/Ⅲa分子上的纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn)暴露，最終與纖維蛋白原的α鏈中的RGD肽序和γ鏈C端十二肽結(jié)合，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)使相鄰的血小板聚集〔9〕。GP的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移以及GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原氨基酸殘基的結(jié)合等聚集過程中發(fā)生的反應(yīng)，不僅有化合鍵的形成而且伴隨著氨基酸羧基的變化，引起聚集后反應(yīng)羧基204 nm波長處吸收峰值增大。在重復(fù)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)由于取樣誤差聚集后的血小板量略小于聚集前時(shí)(以280 nm處吸收峰值為標(biāo)準(zhǔn))，仍可得這一結(jié)果。而且，實(shí)驗(yàn)中充分稀釋的誘導(dǎo)劑與血小板混合幾乎不會(huì)引起血小板的聚集〔10〕，依此來模擬聚集前的血小板，確保其紫外光譜與聚集后具有可比性，同時(shí)也加入了乏血小板的比較，能對(duì)比觀察消除血漿成分對(duì)血小板光譜的影響，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確。目前，檢測血小板聚集功能，臨床上應(yīng)用最為廣泛的是光比濁法，利用血小板聚集儀測定血小板聚集前后血漿透光率變化來間接反映血小板聚集率，但有不足：高脂血癥等其他影響血清透明度的因素會(huì)影響血小板吸光度；只能檢測較大的血小板聚集物，敏感性不高，因而比濁法不能夠準(zhǔn)確反映血小板的聚集功能〔11〕。散射性粒子檢測法利用40 μm波長為675 nm的激光束透射到聚集顆粒發(fā)生反射，能夠很靈敏地檢測到血小板顆粒的大小及數(shù)量，但聚集顆粒不能全面反映凝血功能。血小板功能分析儀對(duì)纖維蛋白原缺陷性疾病診斷靈敏度低〔12〕，而剪切誘導(dǎo)法受溫度和血小板數(shù)目影響較大，電阻抗法因電極的放置則要求難以滿足臨床需要且靈敏度低，應(yīng)用較少〔13〕。血栓彈力圖作為一種新型的床旁血小板聚集率檢測方法，運(yùn)用血液凝固牽拉的原理，能夠直接使用全血檢測全面地分析血液凝固及溶解過程〔14〕，但檢測費(fèi)用較高。紫外光譜檢測法有著很高的靈敏度，在無紫外吸收的溶劑中可達(dá)0.005%，實(shí)驗(yàn)中也可以觀察到3 μl血小板血漿在204 nm處即有明顯吸收峰，而且多次實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高，因而能夠更準(zhǔn)確地反映血小板的聚集功能〔15〕。本研究顯示紫外光譜主要揭示的是共軛體系等官能團(tuán)間的關(guān)系，具有一定的局限性。實(shí)際上，氯吡格雷代謝產(chǎn)物與P2Y12受體會(huì)形成二硫鍵〔16〕，纖維蛋白原分子的α、β和γ鏈也是通過29對(duì)二硫鍵連接，阿司匹林會(huì)抑制AA環(huán)氧化酶使絲氨酸乙?；?7〕。紅外光譜利用分子振動(dòng)能夠產(chǎn)生許多窄帶吸收，相比下能夠更多地反映官能團(tuán)的種類及包含結(jié)構(gòu)。Tablin等〔18〕發(fā)現(xiàn)了寒冷刺激的活化血小板膜-CH2區(qū)具有不同紅外吸收，而冠心病患者血小板也處于活化狀態(tài)，比較冠心病與正常人血小板紅外光譜-CH2區(qū)的振動(dòng)變化，對(duì)于冠心病的診斷具有重要意義。

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〔2015-09-12修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(12010402116)

唐海沁(1956-)，男，碩士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事冠心病血小板功能的研究。

周 銘(1989-)，男，碩士，主要從事冠心病血小板功能的研究。

R318.51

A

1005-9202(2017)11-2661-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.026