白藜蘆醇緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛的效果及機制

王裕生 李 祺

(青海紅十字醫(yī)院疼痛科，青海 西寧 810001)

白藜蘆醇緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛的效果及機制

王裕生 李 祺

(青海紅十字醫(yī)院疼痛科，青海 西寧 810001)

目的 探討白藜蘆醇(Res)對大鼠神經(jīng)病理性疼痛(NP)癥狀及小膠質(zhì)細胞活化的影響。方法 選取200～260 g的雄性SD大鼠，采用左側(cè)L5/6 脊神經(jīng)結(jié)扎制備NP模型，將42只NP模型大鼠隨機分為模型組和Res組各21例，Res組在術(shù)后第4天經(jīng)鞘內(nèi)導管注射300 μg Res，10 μl/次，連續(xù)7 d。同時選取22只僅暴露脊神經(jīng)而不行結(jié)扎的正常大鼠作對照，模型組和對照組大鼠僅鞘內(nèi)注射10 μl生理鹽水。分別于術(shù)前(d0)、術(shù)后第4、7、14、21 天(d4、d7、d14、d21)測定各組大鼠的熱痛閾潛伏期(TWL)和機械痛閾值(MWT)，于d7、d14、d21取各組大鼠的L5脊髓并采用熒光免疫組化法檢測小膠質(zhì)細胞標記分子離子鈣結(jié)合接頭蛋白分子(Iba)-1和OX42的變化情況，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測各組脊髓的炎癥因子〔白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α〕水平。結(jié)果 3組大鼠d0 MWT和TML的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，且對照組d0、d4、d7、d14、d21 MWT和TML的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與對照組相比，模型組及Res組d4～d21的MWT和TML水平均降低，且d7時兩者水平均最低(P<0.05)；模型組及Res組d7～d21的Iba-1和OX42積分光密度(IOD)均高于對照組(P<0.05)，d21的脊髓IL-1β、IL-6和TNF-α水平亦高于對照組(P<0.05)； 除基線TWL和MWT外，Res組的以上時間點的各指標均優(yōu)于模型組(P<0.05)。結(jié)論 鞘內(nèi)注射Res可改善NP大鼠的疼痛及炎癥反應，可能與抑制小膠質(zhì)細胞活化有關(guān)。

白藜蘆醇；神經(jīng)病理性疼痛；小膠質(zhì)細胞活化

神經(jīng)性疼痛(NP)是臨床上的慢性綜合征之一，可發(fā)展為周圍或中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變〔1〕。NP的典型癥狀包括自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和機械性痛覺，目前迫切需要改善患者療效和耐受性的新療法〔2〕。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，小膠質(zhì)細胞是目前公認的參與周圍神經(jīng)損傷后NP的發(fā)生發(fā)展過程〔3〕。體內(nèi)研究證實，抑制過度活化的小膠質(zhì)細胞活動可減弱NP癥狀，以上表明脊髓小膠質(zhì)細胞可作為NP的潛在治療靶點〔4〕。白藜蘆醇(Res)是一種多酚化合物，具有抗氧化、抗自由基、抗炎等生物學活性〔5〕。Res可穿透血腦屏障，可防治外周和中樞神經(jīng)炎癥疾病〔6〕。本研究在制備NP模型大鼠的基礎(chǔ)上采用鞘內(nèi)置管注射Res，觀察其對癥狀及小膠質(zhì)細胞活化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Res購自美國Sigma公司，兔抗離子鈣結(jié)合接頭蛋白分子(Iba)-1單克隆抗體購自德國Wako公司，兔抗OX42單克隆抗體購自美國Wako公司，Alexa488或Alexa594標記的羊抗兔IgG購自美國Invitrogen公司，白細胞介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α酶免試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 動物與分組 選取200～260 g的雄性SD大鼠采用左側(cè)L5/6 脊神經(jīng)結(jié)扎制備NP模型，將42只NP模型大鼠隨機分為模型組和Res組各21例，Res組在術(shù)后第4天經(jīng)鞘內(nèi)導管注射300 μg Res，10 μl/次，連續(xù)7 d。同時選取22只僅暴露脊神經(jīng)而不行結(jié)扎的正常大鼠作對照，模型組和對照組大鼠僅鞘內(nèi)注射10 μl生理鹽水。本實驗所用大鼠購自上海斯萊克公司，飼養(yǎng)于SPF級實驗動物中心，明暗時間設(shè)定為12∶12，保持室溫20℃～22℃，濕度60%～70%。

1.3 鞘內(nèi)置管 經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，常規(guī)消毒后于大鼠腰5～6間隙縱行切開，逐層分離后暴露L5白色椎板并行部分棘突后，采用針尖(5號)刺破脊間膜，將L5～L6間隙將長為15 cm的PE-10導管向上置入約2 cm，最后經(jīng)皮下將導管外端遷至頸部皮膚后固定。將置管3 d后出現(xiàn)運動障礙的大鼠剔除。

1.4 NP模型制備 參照Kim 等〔7〕報道的左側(cè)L5/6 脊神經(jīng)結(jié)扎制備NP模型：經(jīng)50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，從L3～S4水平行背部正中切口后，分離左側(cè)L5和L6脊神經(jīng)并結(jié)扎，隨后采用3-0絲線連續(xù)縫合肌肉和皮膚切口。對照組大鼠脊髓神經(jīng)暴露，但不結(jié)扎。所有大鼠均給予連續(xù)5 d的青霉素腹腔注射(20萬U/d)。術(shù)后未出現(xiàn)虛弱和觸覺異常的大鼠符合后續(xù)試驗要求。

1.5 行為學檢測 分別于術(shù)前(d0)、術(shù)后第4、7、14、21天(d4、d7、d14、d21)進行行為學檢測，測定各組大鼠的機械痛閾值(MWT)和熱痛閾潛伏期(TWL)。

1.5.1 MWT MWT是評價機械性痛覺超敏的重要指標。采用 Von-Frey細絲檢測MWT。測試前讓大鼠在大小為20 cm×25 cm×15 cm的塑料盒中適應至少30 min，按照刺激力度依次增強的順序采用細絲刺激左后足跖面，每次持續(xù)4～6 s，以細絲稍彎曲作為完全受力的標準。當出現(xiàn)快速縮足時為陽性反應，依次增加和減少刺激強度，按照“up and down”的方法測定MWT。

1.5.2 TWL TWL是評價熱痛覺過敏的重要指標。測試前讓大鼠在透明塑料籠適應30 min。將從熱刺激器輻射出的熱束通過透明玻璃板聚集在后足跖面。記錄大鼠出現(xiàn)響應傷害性行為的潛伏期，如特征性提升或舔爪。為了避免損傷動物，本試驗中選擇了30 s的測試時間和30℃的觸發(fā)溫度。

1.6 熒光免疫組化法 Iba-1和OX42是公認的小膠質(zhì)細胞標志物，分別于d7、d14、d21將大鼠過量麻醉致死，經(jīng)升主動脈灌注4%多聚甲醛500 ml，迅速取L5脊髓節(jié)段，經(jīng)包埋劑處理后，以20 μm的厚度行橫向冰凍切片，直接轉(zhuǎn)移至預冷的顯微鏡載玻片，經(jīng)煮沸的檸檬酸緩沖液抗原修復和3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性后，采用1 μg/ml anti-iba-1或稀釋比例為1∶200的anti-OX42過夜孵育。經(jīng)相應二抗處理后采用Olympus BX60型熒光顯微鏡進行觀察，最后結(jié)果表示為積分光密度(IOD)：熒光IOD =面積×強度。

1.7 脊髓炎癥因子水平檢測 取制備好的L5脊髓節(jié)段的上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定試劑盒檢測IL-1β、IL-6和TNF-α水平。操作步驟嚴格遵循試劑盒說明書，在450 nm波長下采用ELx800型酶標儀檢測吸光度。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、單因素分析。

2 結(jié) 果

2.1 3組MWT比較 3組大鼠d0 MWT差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；對照組d0、d4、d7、d14、d21 MWT差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；且d7 MWT的水平最低；模型組及Res組d4～d21的MWT水平均低于對照組(P<0.05)，且Res組以上時間點的MWT水平均高于模型組(P<0.05)。見表1。

2.2 3組TML比較 3組大鼠d0 TML差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；對照組d0、d4、d7、d14、d21 TML差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組及Res組d4～d21 TML均低于d0(P<0.05)，且d7 TML最低；模型組及Res組d4～d21 TML均低于對照組(P<0.05)，且Res組以上時間點的TML均高于模型組(P<0.05)。見表2。

表1 鞘內(nèi)注射Res對NP大鼠MWT的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

表2 鞘內(nèi)注射Res對NP大鼠TML的影響

2.3 3組小膠質(zhì)細胞Iba-1、OX42表達比較 對照組d7、d14、d21時小膠質(zhì)細胞Iba-1、OX42 IOD差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；模型組及Res組d7～d21 Iba-1、OX42 IOD、水平均高于對照組(P<0.05)，且Res組均低于模型組(P<0.05)。見表3。

2.4 3組脊髓炎癥因子水平比較 模型組及Res組d21時脊髓IL-1β、IL-6和TNF-α水平均高于對照組(P<0.05)，且Res組均低于模型組(P<0.05)。見表4。

表3 鞘內(nèi)注射Res對NP大鼠小膠質(zhì)細胞Iba-1、OX42的IOD的影響

表4 鞘內(nèi)注射Res對NP大鼠脊髓炎癥因子 水平的影響

3 討 論

脊神經(jīng)結(jié)扎模型已被廣泛用于研究NP的發(fā)病機制及治療策略〔8〕。本研究結(jié)果表明術(shù)后大鼠出現(xiàn)了明顯的機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏，提示NP模型制備成功。且本研究一直持續(xù)至術(shù)后21 d，可較好地模擬NP的發(fā)生發(fā)展過程。本研究結(jié)果表明Res可改善NP大鼠的疼痛癥狀，但仍未能達到正常水平，可能與本研究的劑量較少或觀察時間較短有關(guān)。與本研究一致，王依慰等〔8〕發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射Res可緩解NP癥狀，但其僅分析了Res對MWT的影響。此外，小膠質(zhì)細胞參與NP炎癥反應的啟動和維持〔9〕。本研究結(jié)果表明NP大鼠出現(xiàn)了顯著的小膠質(zhì)細胞激活，且Res可抑制其激活。NP過程中，外周和中樞炎癥反應可導致外周和中樞性致敏作用〔10〕。本研究結(jié)果提示鞘內(nèi)注射Res可改善NP大鼠的疼痛及炎癥反應，可能與抑制小膠質(zhì)細胞活化有關(guān)，提示Res在臨床NP輔助治療上有較好的應用前景。

1 Yin D，Liu YY，Wang TX，etal.Paeoniflorin exerts analgesic and hypnotic effects via adenosine A1 receptors in a mouse neuropathic pain model 〔J〕.Psychopharmacology (Berl)，2016；233(2)：281-93.

2 Mendlik MT，Uritsky TJ.Treatment of neuropathic pain〔J〕.Curr Treat Options Neurol，2015；17(12)：50.

3 Ikeda H，Kiritoshi T，Murase K.Contribution of microglia and astrocytes to the central sensitization，inflammatory and neuropathic pain in the juvenile rat 〔J〕.Mol Pain，2012；8：43.

4 Liu W，Tang Y，F(xiàn)eng J.Cross talk between activation of microglia and astrocytes in pathological conditions in the central nervous system 〔J〕.Life Sci，2011；89(5-6)：141-6.

5 張春霞，陳 剛，李 娟，等.白藜蘆醇的延緩衰老作用及應用前景〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(23)：6915-8.

6 王 鵬，丁 慧，陳 穎，等.白藜蘆醇對急性痛風性關(guān)節(jié)炎大鼠趨化因子CCR5、CXCL10的影響〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2013；29(11)：986-90.

7 Kim SH，Chung JM.An experimental model for peripheral neuropathy pro duced by segmental spinal nerve ligation in the rat 〔J〕.Pain，1992；50(3)：355-63.

8 王依慰，劉清珍，陳春龍，等.白藜蘆醇通過降低 NF-κB p65乙?；徑獯笫笊窠?jīng)病理性疼痛〔J〕.中國藥理學通報，2016；32(1)：89-93.

9 Mei XP，Zhang H，Wang W，etal.Inhibition of spinal astrocytic c-Jun N-terminal kinase (JNK) activation correlates with the analgesic effects of ketamine in neuropathic pain〔J〕.J Neuroinflammation，2011；8(1)：6.

10 陸明佳，朱 沂，孫 娟，等.小膠質(zhì)細胞介導帕金森病模型小鼠的炎癥損傷〔J〕.中國組織工程研究與臨床康復，2011；15(11)：1945-8.

〔2017-01-13修回〕

(編輯 滕欣航)

王裕生(1973-)，男，主治醫(yī)師，主要從事臨床疼痛研究。

R74

A

1005-9202(2017)11-2650-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.021

1 南京醫(yī)科大學附屬南京市婦幼保健院醫(yī)學研究中心