缺氧誘導(dǎo)因子-2α和多藥耐藥基因1在乳腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性

李 娜 張哲瑩 趙二趁

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

缺氧誘導(dǎo)因子-2α和多藥耐藥基因1在乳腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性

李 娜 張哲瑩 趙二趁

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的 探討缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-2α和多藥耐藥基因(MDR)1在乳腺癌中的表達(dá)及相關(guān)性。方法 采用免疫組化和RT-PCR法檢測47例乳腺癌組織和30例癌旁正常乳腺組織中的HIF-2α和MDR1蛋白和mRNA的表達(dá)及其相關(guān)性。低氧培養(yǎng)建立乳腺癌MCF-7細(xì)胞缺氧模型，應(yīng)用熒光定量PCR和Western印跡分別檢測每組缺氧模型細(xì)胞中HIF-2α和MDR1蛋白和mRNA的表達(dá)及其相關(guān)性。 結(jié)果 在乳腺癌組織中HIF-2α蛋白的陽性表達(dá)率(76.7%)和MDR1蛋白的陽性表達(dá)率(80.0%)均顯著高于正常乳腺組織(P<0.05)；在乳腺癌組織中HIF-2α mRNA的表達(dá)水平(0.896±0.012)和MDR1 mRNA的表達(dá)水平(0.884±0.016)均顯著高于正常乳腺組織(P<0.05)；乳腺癌組織中HIF-2α及MDR1蛋白及mRNA的表達(dá)均呈正相關(guān)(P均<0.05)。在缺氧組，隨著缺氧時(shí)間的延長MCF-7細(xì)胞中MDR1的表達(dá)均逐漸增高，且MDR1的表達(dá)升高與HIF-2α的表達(dá)呈同步化改變。結(jié)論 缺氧可通過核轉(zhuǎn)錄因子HIF-2α上調(diào)乳腺癌細(xì)胞內(nèi)MDR1的表達(dá)，從而使乳腺癌細(xì)胞獲得多藥耐藥性。HIF-2α和MDR1將可能成為逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥的新的分子靶點(diǎn)。

乳腺癌；缺氧誘導(dǎo)因子-2α；多藥耐藥基因

化療耐藥是導(dǎo)致惡性腫瘤治療失敗的重要原因，也是困擾惡性腫瘤治療的難題之一。在乳腺癌的治療中也不可避免地會(huì)遇到化療耐藥的問題。因此尋求有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑及探索乳腺癌的耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制具有重要的研究價(jià)值。實(shí)體腫瘤微環(huán)境局部缺氧是普遍存在的一種現(xiàn)象〔1〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)是與細(xì)胞缺氧有關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，近年來與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系倍受關(guān)注，而關(guān)于腫瘤化療耐藥與HIF-2α的關(guān)系，國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。本研究分別以乳腺癌組織和細(xì)胞為研究對(duì)象，從mRNA及蛋白水平研究MDR1與HIF-2α的表達(dá)變化及相關(guān)性，進(jìn)而部分闡明乳腺癌多藥耐藥的形成機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)乳腺癌的化療耐藥提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院2008年10月至2011年10月手術(shù)切除且經(jīng)病理確診的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌標(biāo)本47例，均為女性，年齡33～82(中位57)歲。術(shù)前均未經(jīng)放、化療及內(nèi)分泌治療，其中伴腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。另取30例癌旁組織(距癌灶邊緣5 cm)作為對(duì)照，年齡32～76(中位54)歲。新鮮標(biāo)本由DEPC處理后凍存管分裝、液氮運(yùn)送并立即凍存于-80℃冰箱待用。病例均經(jīng)兩位以上病理醫(yī)師確診。

1.2 主要試劑及細(xì)胞系 HIF-2α兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；鼠抗人P-糖蛋白(P-gP)多克隆抗體購自深圳晶美生物公司，SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒、PCR試劑盒和TRIzol試劑等均購自美國Invitrogen公司；β-actin 抗體購自美國Santa Cruz公司，引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；MCF-7細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果判定 采用EnVisin兩步法，高溫高壓進(jìn)行抗原修復(fù)， 37℃孵育1 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。HIF-2α和P-gP陽性顯色均為棕黃色顆粒，HIF-2α主要位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，以核周胞質(zhì)中表達(dá)較強(qiáng)。P-gP主要位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，在10×40倍視野下隨機(jī)選取8～10個(gè)視野，計(jì)數(shù)棕黃色染色細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)，≥10%者為陽性，<10%者為陰性。

1.4 RT-PCR 采用TRIzol裂解組織提取RNA，根據(jù)Invitrogen cDNA合成試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。本研究所用的引物序列如下：HIF-2α正義鏈：5′-tgaaaacgagtccgaagcc-3′，反義鏈：5′-gtggctgacttgaggttga-3′；MDR1 正義鏈：5′-accaagcggctccgataca-3′，反義鏈：5′-tcattggcgagcctggtagtc-3′；GAPDH正義鏈：5′-attcatc tctcctctccca-3′，反義鏈：5′-gttggtggttggtactgt-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為342，110和580 bp。取反應(yīng)產(chǎn)物5 μl用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上成像并測定分析。

1.5 缺氧模型的建立 將生長狀態(tài)良好的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱(2%O2，5%CO2，93%N2)中低氧培養(yǎng)。分別缺氧12 h，24 h，48 h，缺氧48 h/復(fù)氧3 h，根據(jù)缺氧時(shí)間設(shè)立4組，以常規(guī)培養(yǎng)(5%CO2，95%空氣)的MCF-7細(xì)胞作為對(duì)照。每組平行設(shè)置3瓶，重復(fù)3次。

1.6 熒光定量RT-PCR 按照Trizol 試劑說明書抽提細(xì)胞內(nèi)的總RNA及逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，總反應(yīng)體系為50 μl：10×PCR緩沖液 2.5 μl，Taq酶 0.25 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，35 pmol/L 5′和3′引物各1 μl，dNTP混合物0.5 μl，cDNA 模板2.5 μl，去離子水15.75 μl，sybrGreen 染料25 μl。反應(yīng)條件：94℃×5 min，94℃×1 min、50℃×1 min，72℃延伸5 min，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)Ct值通過公式2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量分析計(jì)算可得HIF-2α和MDR1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 Western 印跡 按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白，按BCA蛋白含量檢測試劑盒步驟制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蛋白濃度，蛋白上清經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含1%脫脂奶粉的TBST封閉30 min，加入Ⅰ抗于37℃孵育2 h；加入Ⅱ抗于室溫孵育37℃孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色。顯色結(jié)果用軟件Quantity One進(jìn)行灰度分析，并計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2、t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Spearman分析。

2 結(jié) 果

2.1 HIF-2α和P-gP蛋白在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達(dá) 在乳腺癌組織中HIF-2α蛋白的陽性表達(dá)率〔23例(76.7%)〕均顯著高于正常乳腺組織中的表達(dá)〔22例(46.8%)，χ2=6.722，P=0.010〕；在乳腺癌組織中的P-gP蛋白陽性表達(dá)率〔24例(80.0%)〕亦顯著高于正常乳腺組織中的表達(dá)〔27例(57.4%)，χ2=4.165，P=0.041〕，見圖1。

圖1 HIF-2α和P-gP蛋白在不同組織中的表達(dá)(DAB，×200)

2.2 乳腺癌組織中HIF-2α和P-gP蛋白表達(dá)的相關(guān)性 乳腺癌組織中HIF-2α蛋白和P-gP蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=7.873，P=0.005)。

2.3 HIF-2α和MDR1 mRNA在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達(dá) 在乳腺癌組織中HIF-2α mRNA的表達(dá)水平(0.896±0.012)顯著高于其在正常乳腺組織中的表達(dá)(0.664±0.006，t=9.578，P=0.001)；在乳腺癌組織中MDR1 mRNA的表達(dá)水平(0.884±0.016)亦顯著高于在正常乳腺組織中的表達(dá)(0.626±0.007，t=9.692，P=0.001)，見圖2。

圖2 RT-PCR檢測HIF-2α和MDR1 mRNA的表達(dá)

2.4 乳腺癌組織中HIF-2α和MDR1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 乳腺癌組織中HIF-2α mRNA和MDR1 mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(r=5.487，P=0.019)。

2.5 MCF-7細(xì)胞株常氧與缺氧條件下HIF-2α和MDR1 mRNA的表達(dá)情況 隨著缺氧時(shí)間的延長，HIF-2α和MDR1的表達(dá)呈逐漸升高趨勢(P<0.05)；復(fù)氧后它們的表達(dá)又不同程度地減弱(P<0.05)。由此可見，HIF-2α和MDR1的表達(dá)之間呈現(xiàn)同步改變。見表1。

表1 在不同缺氧時(shí)間點(diǎn)HIF-2α和MDR1 mRNA的 相對(duì)表達(dá)差異

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與前一缺氧時(shí)間點(diǎn)比較：2)P<0.05；與復(fù)氧3 h組比較：3)P<0.05，下表同

2.6 MCF-7細(xì)胞株常氧與缺氧條件下HIF-2α和P-gP蛋白的表達(dá)情況 Western印跡結(jié)果顯示，隨著缺氧時(shí)間的延長，HIF-2α和P-gP蛋白的相對(duì)表達(dá)量也逐漸增高；但在恢復(fù)供氧僅3 h后HIF-2α和P-gP蛋白的表達(dá)即開始下降。P-gP蛋白的表達(dá)增高與HIF-2α的表達(dá)呈同步改變，見表2。

表2 在不同缺氧時(shí)間點(diǎn)HIF-2α和P-gP 蛋白的相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

絕大多數(shù)實(shí)體腫瘤包括乳腺癌在內(nèi)存在缺氧微環(huán)境。在缺氧微環(huán)境中腫瘤的新生血管生成、能量代謝、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因的表達(dá)受到缺氧誘導(dǎo)因子的調(diào)節(jié)〔2，3〕。缺氧也同時(shí)加劇了腫瘤細(xì)胞的基因不穩(wěn)定性，一些腫瘤生存因子被激活，造成了腫瘤細(xì)胞的化療耐受，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響了患者的預(yù)后〔4〕。因此，腫瘤的缺氧微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后之間關(guān)系密切，這一領(lǐng)域也將成為尋找腫瘤新治療方法的研究熱點(diǎn)。

MDR是腫瘤患者進(jìn)行有效化療的主要障礙之一，也是腫瘤患者化療急需解決的難題。MDR1編碼的P-gP過度表達(dá)是產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制，其可將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的抗癌藥物主動(dòng)泵出細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)的藥物積聚被減少，使大多數(shù)實(shí)體腫瘤，如結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等產(chǎn)生耐藥〔5〕。

HIF-2α是調(diào)節(jié)腫瘤血管形成、增殖凋亡、糖代謝及化療耐藥等多種相關(guān)基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，與HIF-1α具有48%的結(jié)構(gòu)同源性，受氧水平調(diào)節(jié)〔6〕；低氧微環(huán)境導(dǎo)致腫瘤對(duì)化療藥物耐藥的機(jī)制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中HIF-2α和P-gP蛋白及mRNA的表達(dá)均顯著高于正常乳腺組織，且二者表達(dá)正相關(guān)。吳倩等〔7〕研究結(jié)果顯示，靶向HIF-2α的siRNA表達(dá)載體能夠有效阻遏HIF-2α基因的表達(dá)，抑制P-gP蛋白的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)順鉑的化療耐藥性。Chen等〔8〕在對(duì)結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制HIF-1α 通過下調(diào)MDR1/P-gP表達(dá)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。由此可見，HIFs可能通過上調(diào)P-gP表達(dá)，在包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤化療耐藥機(jī)制及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，其確切機(jī)制尚不完全清楚，有待于深入研究。

本研究表明在缺氧環(huán)境中，隨著缺氧時(shí)間的延長，人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的HIF-2α和多藥耐藥相關(guān)基因MDR1的蛋白和mRNA水平的表達(dá)量均逐漸增高，但二基因的表達(dá)在恢復(fù)供氧僅3 h后即開始下降。這些現(xiàn)象提示乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)MDR1基因可受周圍環(huán)境缺氧的誘導(dǎo)，而MDR1的表達(dá)直接參與了乳腺癌多藥耐藥表型的形成已被證實(shí)，因而我們可得出結(jié)論：乳腺癌生長局部微環(huán)境的缺氧可誘導(dǎo)其MDR的產(chǎn)生，乳腺癌在其生長微環(huán)境因素的影響下，由于細(xì)胞內(nèi)MDR相關(guān)基因的表達(dá)升高而獲得了MDR的表型。另外在本研究中多藥耐藥相關(guān)基因MDR1的表達(dá)增高與HIF-2α的表達(dá)亦呈同步性變化，這提示細(xì)胞內(nèi)多藥耐藥相關(guān)基因表達(dá)受核轉(zhuǎn)錄因子HIF-2α的調(diào)控。以上結(jié)果表明，在缺氧環(huán)境中核轉(zhuǎn)錄因子HIF-2α可受缺氧這一物理因素的影響來調(diào)控MDR基因的表達(dá)，從而使乳腺癌表現(xiàn)出了化療耐藥的特性。Rognon等〔9〕已證實(shí)MDR1基因是缺氧反應(yīng)性基因，在該基因啟動(dòng)子上存在著缺氧反應(yīng)原件(HRE)，進(jìn)一步從基因水平上為此結(jié)論提供了確鑿的證據(jù)。

綜上，乳腺癌產(chǎn)生MDR的重要原因之一是受其生長的缺氧微環(huán)境所誘導(dǎo)。缺氧可通過核轉(zhuǎn)錄因子HIF-2α來調(diào)控乳腺癌細(xì)胞內(nèi)MDR1基因的表達(dá)，從而使乳腺癌出現(xiàn)以基因水平改變?yōu)榛A(chǔ)的獲得性耐藥。同時(shí)這也提示HIF-2α和多藥耐藥基因?qū)⒖赡艹蔀榕R床上逆轉(zhuǎn)乳腺癌化療耐藥的新的分子靶點(diǎn)；設(shè)計(jì)可特異性阻斷其表達(dá)的小分子，并與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用，將有望成為實(shí)現(xiàn)乳腺癌有效化療的重要手段。

1 Hu Y,Wang J,Tao H,etal.Association analysis between MDR1 genetic variant and breast cancer risk factors in Chinese Han population〔J〕.Med Oncol,2013；30(3):683.

2 He C,Sun XP,Qiao H,etal.Downregulating hypoxia-inducible factor-2α improves the efficacy of doxorubicin in the treatment of hepatocellular carcinoma〔J〕.Cancer Sci,2012；103(3):528-34.

3 Christiaansen CE,Sun Y,Hsu YC,etal.Alterations in expression of HIF-1α,HIF-2α,and VEGF by idiopathic overactive bladder urothelial cells during stretch suggest role for hypoxia〔J〕.Urology,2011；77(5):1266.e7-11.

4 Zhao D,Zhai B,He C,etal.Upregulation of HIF-2α induced by sorafenib contributes to the resistance by activating the TGF-α/EGFR pathway in hepatocellular carcinoma cells〔J〕.Cell Signal,2014；26(5):1030-9.

5 Huang F,Wu XN,Chen J,etal.Resveratrol reverses multidrug resistance in human breast cancer doxorubicin-resistant cells〔J〕.Exp Ther Med,2014；7(6):1611-6.

6 Rundqvist H,Johnson RS.Tumour oxygenation:implications for breast cancer prognosis〔J〕.J Intern Med,2013；274(2):105-12.

7 吳 倩，袁 凱，錢 成，等.HIF-2α基因與人肺腺癌A549細(xì)胞株對(duì)順鉑耐藥性的關(guān)系〔J〕.中國臨床醫(yī)學(xué),2013；20(6):772-5.

8 Chen J,Ding Z,Peng Y,etal.HIF-1α inhibition reverses multidrug resistance in colon cancer cells via downregulation of MDR1/P-Glycoprotein〔J〕.PLoS One,2014;9(6):e98882.

9 Rognon B,Kozovska Z,Coste AT,etal.Identification of promoter elements responsible for the regulation of MDR1 from Candida albicans,a major facilitator transporter involved in azole resistance〔J〕.Microbiology,2006;152(Pt 12):3701-22.

〔2016-04-01修回〕

(編輯 曹夢園)

河南省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(162300410220)；河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(16A310002)；河南省高校青年骨干教師資助項(xiàng)目(2012GGJS-136)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院聯(lián)合培育基金資助項(xiàng)目(2014QN113)

李 娜(1977-)，女，博士，副教授，主要從事惡性腫瘤分子病理學(xué)研究。

R73-37

A

1005-9202(2017)11-2638-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.016