槐耳清膏對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響

魯明騫 盧宏達(dá) 許新華 盧忠心 孔慶志 雷 章 徐冰清 郭 蓉

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430060)

槐耳清膏對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響

魯明騫1盧宏達(dá)2許新華1盧忠心2孔慶志2雷 章2徐冰清1郭 蓉1

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430060)

目的 探討槐耳清膏對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的影響。方法 制備不同濃度的槐耳清膏(0、3、6、9 mg/ml)和羥基喜樹(shù)堿100 μg/ml作用于A(yíng)549細(xì)胞，分別于24、36和48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 槐耳清膏與羥基喜樹(shù)堿均可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，槐耳清膏各濃度組與陰性對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，且這種抑制存在濃度和時(shí)間依賴(lài)性，槐耳清膏濃度在3.0 mg/ml 36 h后抑制作用最強(qiáng)，羥基喜樹(shù)堿組與之比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，各濃度槐耳清膏組在與A549細(xì)胞作用36 h后達(dá)到抑制高峰。結(jié)論 槐耳清膏在體外能抑制人肺腺癌細(xì)胞A549的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。

槐耳清膏；人肺腺癌A549細(xì)胞；增殖；凋亡

肺癌的治療以手術(shù)、放療、化療和靶向藥物為主，一旦復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，治療效果并不理想，目前中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌已成為非常重要的治療手段〔1，2〕。由于細(xì)胞增殖和凋亡失衡，導(dǎo)致細(xì)胞的凈增長(zhǎng)率提高，穩(wěn)態(tài)被破壞，此時(shí)便發(fā)生癌前病變和腫瘤〔3，4〕。因此，活化凋亡通路，促使腫瘤細(xì)胞凋亡，是研究腫瘤治療的熱點(diǎn)。槐耳是我國(guó)重要的藥用真菌類(lèi)抗腫瘤藥物之一，主要活性成分為槐耳蛋白多糖，可誘導(dǎo)肺癌、腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)患者機(jī)體免疫力，改善患者生活質(zhì)量，同時(shí)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移具有抑制作用〔5，6〕。本文研究槐耳清膏對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 藥品與試劑 槐耳清膏由江蘇啟東蓋天力藥業(yè)有限公司提供，稱(chēng)取槐耳清膏10 g，無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液100 ml溶解，過(guò)濾除菌，制備成濃度為3、6、9 mg/ml的槐耳清膏組。羥基喜樹(shù)堿由黃石飛云制藥有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：20130902)。

1.2 分組 實(shí)驗(yàn)分濃度為0、3、6、9 mg/ml的槐耳清膏組和100 μg/ml羥基喜樹(shù)堿組，其中0 mg/ml的槐耳清膏組為未加用任何藥物作為陰性對(duì)照組，100 μg/ml羥基喜樹(shù)堿組為陽(yáng)性對(duì)照組，分別作用于人肺腺癌A549細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞株 人肺腺癌A549細(xì)胞株由武漢市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室冷凍保存，用含10%胎牛血清、1%雙抗高糖DMEM常規(guī)培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，使細(xì)胞處于呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)待用。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 由呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的A549細(xì)胞與槐耳清膏各組共同培養(yǎng)24 h后，每6小時(shí)進(jìn)行觀(guān)察1次；對(duì)照組羥基喜樹(shù)堿100 μg/ml與呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的A549細(xì)胞共同孵育10～12 h后進(jìn)行測(cè)定。收集培養(yǎng)細(xì)胞，清洗固定，離心后加入100 μl磷酸二氫鈉/檸檬酸緩沖液室溫震蕩30 min，然后加入100 mg/L核糖核酸酶A(RNaseA)和25 mg/L碘化丙啶(PI)染色液1 ml，暗處4℃染色3 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

除陰性對(duì)照組細(xì)胞無(wú)變化外，槐耳清膏各濃度組與A549細(xì)胞作用24 h后均發(fā)生細(xì)胞凋亡，羥基喜樹(shù)堿組作用10～12 h后也可見(jiàn)到細(xì)胞凋亡發(fā)生(P<0.05)。與陰性對(duì)照組比較，槐耳清膏3，6，9 mg/ml組對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞抑制率逐漸下降，證明槐耳清膏濃度在3 mg/ml時(shí)抑制率最強(qiáng)。從作用時(shí)間分析發(fā)現(xiàn)，槐耳清膏在與A549細(xì)胞作用24～36 h時(shí)抑制作用逐漸增強(qiáng)，而在作用36～48 h后其抑制率呈逐漸減弱趨勢(shì)，證明36 h是槐耳清膏作用最強(qiáng)的時(shí)刻。3 mg/ml槐耳清膏作用36 h時(shí)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡率與羥基喜樹(shù)堿組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組A549細(xì)胞凋亡率的比較

3 討 論

凋亡在細(xì)胞的增殖與分化，疾病的發(fā)生與發(fā)展中具有重要的生物學(xué)意義，但其機(jī)制尚不完全明確，凋亡的紊亂可能與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)。而腫瘤的發(fā)生與發(fā)展不僅與腫瘤細(xì)胞增殖、分化相關(guān)，還與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，因此，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡可能是消除腫瘤的關(guān)鍵因素之一〔7〕。

槐耳是我國(guó)重要的藥用真菌類(lèi)抗腫瘤藥物之一，分布于河北、山東、陜西等地，因野生資源較稀缺，故近年來(lái)江蘇等地多采用固體發(fā)酵法培養(yǎng)槐栓菌以供藥用，其水解產(chǎn)物含6種單糖以及18種氨基酸組成，主要藥理作用有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞的遷移和侵襲，提高免疫功能，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥等〔8〕。崔洋等〔9〕在研究槐耳清膏對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，在24 h和48 h槐耳組細(xì)胞活力均升高，72 h細(xì)胞活力降低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有相似性。周進(jìn)等〔10〕在研究槐耳清膏誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞Panc-1凋亡中，發(fā)現(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)相同劑量槐耳清膏可提高胰腺癌細(xì)胞Panc-1細(xì)胞凋亡基因caspase-3的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)槐耳清膏可以使乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的周期阻滯在G2期，使細(xì)胞增殖受到抑制，并通過(guò)bax-/bcl-2途徑來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔11〕。吳志慧等〔12〕在對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，槐耳清膏組胃癌細(xì)胞survivin mRNA表達(dá)水平受到不同程度抑制，且隨槐耳清膏濃度增加，抑制作用增強(qiáng)。本文結(jié)果表明槐耳清膏能明顯抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且呈一定的劑量及時(shí)間依賴(lài)性，槐耳清膏濃度在3 mg/ml作用36 h后其抑制率最強(qiáng)，但其機(jī)制仍需深入研究。

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2 王 震，李亞榮，郝 杰，等.重樓皂苷對(duì)耐鉑人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞增殖的抑制作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013；33(1)：145-7.

3 顧曄斌，郭立杰，蔡 駿.大黃素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO、HT-29、Caco-2體外增殖的抑制作用〔J〕.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2012；18(5)：518-9.

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8 張芷旋，范 羽，周清華，等.槐耳清膏對(duì)人高轉(zhuǎn)移大細(xì)胞肺癌細(xì)胞L9981血管生成相關(guān)基因表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)肺癌雜志，2006;9(2)：137-42.

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12 吳志慧，蔣建偉，曹明溶，等.槐耳清膏誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)：2009;29(4)：370-3.

〔2016-01-06修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

湖北省科技廳自然基金面上項(xiàng)目(No.2014CFB675)；湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No.D20141205)；湖北省衛(wèi)計(jì)委科研基金(No.WJ2015MB176)

孔慶志(1953-)，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤中西醫(yī)結(jié)合臨床及基礎(chǔ)研究。

魯明騫(1973-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤中西醫(yī)結(jié)合臨床及基礎(chǔ)研究。

R287

A

1005-9202(2017)11-2620-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.008

1 三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所 宜昌市中心人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 2 武漢市中心醫(yī)院 武漢市腫瘤研究所