回醫(yī)扎里奴思方對(duì)痰熱腑實(shí)證腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)細(xì)胞間黏附分子1和血管間黏附分子1表達(dá)的影響

劉 超 劉敬霞 田文榮 劉抒雯 甘佳樂 顧玉寶 王 楓

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004)

回醫(yī)扎里奴思方對(duì)痰熱腑實(shí)證腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)細(xì)胞間黏附分子1和血管間黏附分子1表達(dá)的影響

劉 超 劉敬霞1田文榮 劉抒雯 甘佳樂 顧玉寶 王 楓

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004)

目的 探討扎里奴思方對(duì)痰熱腑實(shí)證腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1和血管間黏附分子(VCAM)-1表達(dá)的影響。方法 將60只雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、扎里奴思方組，每組15只；除假手術(shù)組外，其余各組均給予高脂喂養(yǎng)4 w后，予10%的自體糞便1 ml/100 g灌胃，1次/d，連續(xù)3 d，造成痰熱腑實(shí)證模型，再采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型；大鼠給藥劑量尼莫地平組10.8 mg/kg、扎里奴思方組1.54 g/ml，制備MCAO模型前3 d灌胃給藥。大鼠分別于缺血再灌注后1、3、7 d取腦，取材前進(jìn)行腦組織含水量測定，采用免疫組化法檢測缺血側(cè)海馬區(qū)ICAM-1、VCAM-1的表達(dá),RT-PCR檢測ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組腦組織含水量增高(P<0.01);ICAM-1、VCAM-1陽性細(xì)胞，ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達(dá)明顯增高(P<0.01)。與模型組比較，尼莫地平組和扎里奴思方組腦組織含水量降低；ICAM-1、VCAM-1陽性細(xì)胞數(shù)減少，ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)。與尼莫地平組比較，扎里奴思方7 d組腦組織含水量降低，ICAM-1、VCAM-1陽性細(xì)胞數(shù)減少，ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)論 扎里奴思方對(duì)痰熱腑實(shí)證腦缺血再灌注大鼠腦神經(jīng)元起保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制大鼠腦內(nèi)ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)有關(guān)。

扎里奴思方；腦缺血再灌注；痰熱腑實(shí)證；細(xì)胞間黏附分子1；血管間黏附分子1

腦梗死發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的快速級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其病理機(jī)制主要有氧自由基的產(chǎn)生、能量代謝障礙、鈣離子超載、炎性細(xì)胞浸潤等諸多環(huán)節(jié)〔1，2〕，其中炎癥反應(yīng)促進(jìn)了腦缺血損傷的發(fā)展，是腦和神經(jīng)損傷的主要病理機(jī)制之一〔3〕。細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1和血管間黏附分子(VCAM)-1屬于免疫球蛋白超家族，是重要的炎癥因子，在炎性細(xì)胞因子和細(xì)菌內(nèi)毒素的刺激下可在內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，介導(dǎo)白細(xì)胞的黏附和滲出，從而加劇腦缺血再灌注損傷〔4〕。腦缺血后ICAM-1和VCAM-1生成增多，促進(jìn)白細(xì)胞向腦梗死區(qū)浸潤，而再灌注會(huì)加劇白細(xì)胞往梗死區(qū)遷移，加重炎性反應(yīng)性損傷〔5〕?！痘鼗厮幏健分性锱挤骄哂蟹枷汩_竅、補(bǔ)腎益髓、化痰祛瘀之功，對(duì)缺血再灌注大鼠具有調(diào)控血腦屏障、抗腦缺血損傷和保護(hù)腦神經(jīng)元等作用〔6〕。本研究從腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織含水量、ICAM-1和VCAM-1表達(dá)等方面探討扎里奴思方對(duì)腦缺血后神經(jīng)元的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD雄性大鼠，SPF級(jí)，3～4月齡，體重(300±50)g，寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(寧)2014-0001。飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度(25±1)℃，濕度(50±10)%，自由覓食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

1.2.1 扎里奴思方 組成：海狗腎(膃肭臍)12 g、安息香(阿你松)3 g、水龍骨(伯思八牙)12 g、肉桂(薩底知)12 g、菟絲子(阿夫忒蒙)12 g、石菖蒲(哈咱卜咱里刺)12 g、小茴香(法理公)12 g、乳香(兀沙吉)12 g、當(dāng)歸(法忒刺撒里榮)12 g、沒藥(木里葉)12 g、懷牛膝(干祖伐)24 g、番紅花(撒法郎)12 g、蘆薈(拆不牙刺)12 g、牡丹皮12 g。由寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)院提供制備。

1.2.2 尼莫地平片 規(guī)格30 mg/片，山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)賽特有限責(zé)任公司。將尼莫地平研磨成細(xì)小的粉末狀，加入適量的生理鹽水混勻(1.08 mg/ml)灌胃。

1.2.3 高脂飼料〔7〕3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.12%丙硫氧嘧啶、2%吐溫-80、10%豬油、84.38%基礎(chǔ)飼料。

1.3 主要試劑和儀器 蒸餾水(寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；膽固醇(鄭州興昌化工產(chǎn)品有限公司，批號(hào)：67784)；1，2-丙二醇(重慶博洋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：57854)；吐溫-80(重慶博洋生物技術(shù)有限公司)；豬油(自己購買)；TaKaRa RNA PCR試劑盒(TaKaRa公司)；水合氯醛(上海山浦化工有限公司)；A4尼龍栓線(重慶博洋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2832-A4)；多聚甲醛(重慶博洋生物技術(shù)有限公司)；兔二抗及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑；電子天平(BT224S，Sartorius公司)。

1.4 分組與用藥 將60只雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組，模型組(痰熱腑實(shí)證腦缺血組)，尼莫地平組，扎里奴思方組，15只/組。除假手術(shù)組外，其他各組高脂飼料喂養(yǎng)4 w后給予10%自體糞便1 ml/100 g灌胃3 d，然后每組隨機(jī)抽選3只大鼠，腹主動(dòng)脈采血，檢測大鼠血脂，若血脂出現(xiàn)異常為痰熱腑實(shí)證模型造模成功。然后制備局灶性大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型。假手術(shù)組、模型組給予生理鹽水灌胃，藥物治療組分別用相應(yīng)藥物灌胃。大鼠用藥量根據(jù)生藥材含量按等效劑量換算關(guān)系，灌胃體積為1 ml/100 g，扎里奴思方為1.54 g/ml，尼莫地平10.8 mg/kg。大鼠術(shù)后每日用藥1次，術(shù)前12 h禁食不禁水。

1.5 局灶性腦缺血再灌注模型制作 參照Longa等〔8〕報(bào)道的線栓法制備MCAO模型。體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(300 mg/kg，灌胃)麻醉大鼠，置于試驗(yàn)臺(tái)仰臥位固定，常規(guī)去毛消毒，取頸前正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈；結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端；于頸外動(dòng)脈近頸總動(dòng)脈分叉處用眼科剪剪一小口，將線栓穿入頸內(nèi)動(dòng)脈并向前推，線栓插入深度約(18.0±0.5)mm；插線成功后留出線栓約1 cm，結(jié)扎頸外動(dòng)脈剪口處，縫合皮膚。術(shù)后2 h拔出線栓進(jìn)行再灌注處理。假手術(shù)組只分離血管，不結(jié)扎，不插線栓。手術(shù)過程中保持大鼠肛溫(37.0±0.5)℃，保持室溫(26±1)℃。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 腦組織含水量測定 各組大鼠斷頭取左側(cè)缺血腦組織。首先電子天平稱濕重，然后將腦組織放入恒溫烤箱內(nèi)烘干至恒重，稱取干重。根據(jù)Elliot公式計(jì)算，腦含水量%=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.6.2 免疫組織化學(xué)法檢測ICAM-1和VCAM-1表達(dá) 采用鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(SABC)免疫組織化學(xué)染色法檢測ICAM-1和VCAM-1在缺血海馬區(qū)的蛋白表達(dá)情況。按照試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟操作：各組大鼠按規(guī)定時(shí)間灌注后取腦，石蠟包埋脫水，3%H2O2室溫10 min以滅活內(nèi)源性酶；微波爐加熱至沸騰，熱修復(fù)抗原；滴加封閉液，室溫30 min；滴加1∶100工作濃度的一抗，4℃過夜；滴加二抗，37℃孵育30 min；滴加SABC，37℃孵育30 min；DAB顯色；沖洗；復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。位于胞質(zhì)或胞核內(nèi)棕黃色或黃褐色顆粒為陽性表達(dá)。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：在400倍光學(xué)顯微鏡下每張切片采用盲法隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.6.3 RT-PCR法檢測腦組織ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA 腦組織進(jìn)行勻漿，加氯仿，離心，吸取上清液，加入異丙醇，離心，移去上清液，加入75%乙醇，清洗沉淀，離心，去除上清液，干燥RNA沉淀2～3 min，溶解RNA沉淀。使用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測定A260/A280的比值，比值在1.9～2.1，計(jì)算總RNA 含量，取1 μg用于反轉(zhuǎn)錄。選用β-actin基因作內(nèi)參照，按照2-△△Ct相對(duì)定量公式計(jì)算ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA的含量。各引物序列、產(chǎn)物長度見表1。取細(xì)胞總RNA 2 μl，加雙蒸水2 ml，于分光光度計(jì)260 nm和280 nm處測吸光度(A)，A260/A280在1.9～2.1方可使用。反應(yīng)條件，β-actin：94℃ 30 s，53.9℃ 45 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；ICAM-1：94℃ 30 s，53.9℃ 45 s，70℃ 50 s，34個(gè)循環(huán)；VCAM-1：94℃ 30 s，54℃ 45 s，72℃ 52 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，計(jì)量資料在比較前進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，若符合正態(tài)性及方差齊性，則采用單因素方差分析，多組間兩兩比較用最小顯著差法(LSD-t)；若不符合正態(tài)性及方差齊性，則采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 腦組織含水量 模型組與假手術(shù)組比較各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織含水量明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，藥物組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量降低(P<0.01)；與尼莫地平組比較，扎里奴思方7 d組腦組織含水量降低(P<0.05)；與1 d組比較，尼莫地平7 d組和扎里奴思方7 d組腦組織含水量均降低(P<0.05，P<0.01)；與3 d組比較，扎里奴思方7 d組腦組織含水量降低(P<0.05)。見表2。

2.2 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)ICAM-1、VCAM-1的表達(dá) 模型組各時(shí)間點(diǎn)ICAM-1、VCAM-1陽性細(xì)胞表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05,P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平組和扎里奴思方組ICAM-1、VCAM-1陽性細(xì)胞表達(dá)降低(P<0.05,P<0.01)；與尼莫地平組比較，扎里奴思方7 d組ICAM-1、VCAM-1陽性細(xì)胞表達(dá)降低(P<0.05)。見圖1，圖2，表3，表4。

2.3 對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織ICAM-1 mRNA和VCAM-1 mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平組和扎里奴思方組ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA

表2 各組大鼠腦組織含水量比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與尼莫地平組比較：3)P<0.05；與1 d組比較：4)P<0.05；與3 d組比較：5)P<0.01；下表同

圖1 各組大鼠腦缺血再灌注后海馬區(qū)ICAM-1 陽性細(xì)胞變化(×400)

表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與尼莫地平組比較，扎里奴思方7 d組ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。同組別不同時(shí)間點(diǎn)比較，尼莫地平7 d組ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA表達(dá)較1 d組降低(P<0.05)，扎里奴思方7 d組ICAM-1

表3 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)ICAM-1陽性數(shù) 細(xì)胞比較，個(gè)/視野)

表4 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)VCAM-1陽性 細(xì)胞數(shù)比較，個(gè)/視野)

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注后海馬區(qū)VCAM-1 陽性細(xì)胞變化(×400)

mRNA表達(dá)較1 d組降低(P<0.05)。見表5，表6。

表5 各組大鼠腦組織ICAM-1 mRNA表達(dá)相對(duì)含量的 比較

表6 各組大鼠腦組織VCAM-1 mRNA表達(dá)相對(duì)含量的 比較

3 討 論

《回回藥方》論扎里奴思方“可開竅，凈其渾身厚濁風(fēng)痰，治療痰盛弱病”，具有芳香開竅、化痰祛瘀、補(bǔ)腎益髓之功，是回族醫(yī)學(xué)治療缺血性腦病的常用方劑之一〔9〕。腦血管疾病的發(fā)病率逐年升高，缺血性腦血管病約占全部腦血管病的70%〔10〕。細(xì)胞黏附分子是一類能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)相互黏附的膜表面糖蛋白，在炎癥和免疫反應(yīng)等過程中起著重要的作用。在正常情況下，ICAM-1和VCAM-1很少表達(dá)或不表達(dá)，當(dāng)發(fā)生腦缺血再灌注損傷時(shí)病變組織局部釋放炎性因子，促使ICAM-1和VCAM-1表達(dá)明顯升高，細(xì)胞間黏附性增加，造成白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞大量牢固黏附；白細(xì)胞可阻塞血管腔，減少血流量，進(jìn)到血管外的白細(xì)胞可釋放自由基、蛋白水解酶及其他毒性物質(zhì)，從而加重缺血區(qū)組織損傷〔11〕。ICAM-1可介導(dǎo)白細(xì)胞的黏附和聚集，增強(qiáng)炎性因子間的瀑布反應(yīng)，加重炎性損傷的程度，最終引起梗死灶面積增大〔12〕。VCAM-1參與介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)之間黏附，其介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，穿越血腦屏障，是造成腦缺血再灌注損傷的一種重要黏附分子。Cheng等〔13〕發(fā)現(xiàn)抑制VCAM-1的表達(dá)能縮小缺血半暗帶的范圍，減輕腦缺血再灌注損傷。因此，炎癥反應(yīng)在缺血性損傷的病理機(jī)制中起到重要作用，參與了腦梗死的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后，所以下調(diào)炎性因子、阻止炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用〔14〕。

綜上，扎里奴思方對(duì)痰熱腑實(shí)證腦缺血再灌注大鼠腦神經(jīng)元的保護(hù)作用可能與抑制腦內(nèi)ICAM-1和VCAM-1表達(dá)有關(guān)。

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〔2016-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

The effects of Hui Medicine Zhali Nusi Fang on the expressions of ICAM1 and VCAM1 in the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats after cerebral ischemia-reperfusion

LIU Chao,LIU Jing-Xia,TIAN Wen-Rong,etal.

Ningxia Medical University,Yinchuan 750004, Ningxia, China

Objective To investigate the effects of Hui Medicine Zhali Nusi Fang on expressions of ICAM1 and VCAM1 in the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats after cerebral ischemia-reperfusion.Methods Sixty male SD rats were randomly divided into sham model,Nimodipine and Zhalinusi Fang groups(n=15).Except sham group,the other groups were fed with high fat diet for four weeks.Next,rat stools were administered intragastrically once a day for three days to make the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome,then focal cerebral ischemia models were established by middle cerebral artery occlusion with nylon thread.Rats were given with nimodipine(NMDP)(10.8 mg/kg),Zhali Nusi Fang(1.54 g/0.1 kg) by ig before the model preparation.The material at 1,3,7 days were obtained respectively, to determine brain water content before bringing out the rat brain.The expressions of ICAM1 and VCAM1 were observed by immunohistochemistry and RT-PCR methods.Results Compared with that of sham group,brain water content of model group rats was increased(P<0.01),the expressions of ICAM1,ICAM1 mRNA and VCAM1,VCAM1 proteins were upregulated(P<0.01).Compared with those of model groups,brain water content of ZLNSF and NMDP groups were reduced,the expressions of ICAM1,VCAM1 proteins and ICAM1,VCAM1 mRNA were decreased(P<0.01).Compared with those of NMDP group,the expressions of ICAM1,VCAM1 proteins and ICAM1,VCAM1 mRNA were decreased(P<0.05),especially the seven-day group(P<0.05).Conclusions Zhali Nusi Fang has protective effects against the heat-phlegm and sthenic-fu syndrome rats after cerebral ischemia-reperfusion,which might be related with inhibiting the expression of ICAM1 and VCAM1.

Zhali Nusi fang;Cerebral ischemia-reperfusion;Heat-phlegm andsthenic-fu syndrome;sICAM1;sVCAM1

國家十二五科技支撐項(xiàng)目(SQ2013SF12E02181)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260569)

劉敬霞(1970-)，女，博士，博士后，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治老年病研究。

劉 超(1991-)，男，在讀碩士，主要從事中醫(yī)藥防治老年病研究。

R74

A

1005-9202(2017)11-2606-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.003

1 寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室