放療聯(lián)合高強(qiáng)度聚焦超聲治療裸鼠胰腺癌的療效分析

胡 燁， 高 峰， 姚升宇， 陳旭明， 吳 晴， 王春剛*， 王理偉*

1. 上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院腫瘤科，上海 201620 2. 上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院病理科，上海 201620

·短篇論著·

放療聯(lián)合高強(qiáng)度聚焦超聲治療裸鼠胰腺癌的療效分析

胡 燁1， 高 峰2， 姚升宇1， 陳旭明1， 吳 晴1， 王春剛1*， 王理偉1*

1. 上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院腫瘤科，上海 201620 2. 上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院病理科，上海 201620

目的： 探討放療聯(lián)合高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)治療裸鼠胰腺癌的療效。方法： 將人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1接種于24只裸鼠并成功建立移植瘤模型，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組，HIFU組，放療組(10 Gy×3次)，HIFU+放療組。觀察腫瘤體積變化、治療急性損傷情況，再取腫瘤標(biāo)本用免疫組化方法檢測(cè)Ki-67、Caspase-3、STAT-3、HMGB-1的表達(dá)情況。結(jié)果： 空白對(duì)照組腫瘤體積明顯增大，HIFU組、放療組、放療聯(lián)合HIFU組腫瘤抑制率分別為36.32%、84.49%、70.49%，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。放療組與對(duì)照組無(wú)急性治療損傷，HIFU組與HIFU+放療組各有2例休克反應(yīng)及4例皮膚燙傷反應(yīng)。HMGB-1表達(dá)在HIFU組和HIFU+放療組明顯高于其他兩組(P<0.05)，放療組與空白對(duì)照組未見差異。Ki-67與STAT-3在各組均為高表達(dá)，Caspase-3在各組均低表達(dá)。結(jié)論： HIFU聯(lián)合放射治療胰腺癌裸鼠皮下瘤未顯示協(xié)同效應(yīng)，且不良反應(yīng)高于單獨(dú)放療。

高強(qiáng)度聚焦超聲；放射治療；胰腺癌；Caspase-3

胰腺癌惡性程度高，是國(guó)人主要致死腫瘤之一，起病隱匿，發(fā)現(xiàn)時(shí)大多屬于晚期，無(wú)法手術(shù)治療，預(yù)后較差，患者中位生存期一般不超過1年[1-3]。腫瘤立體定向放療(stereotactic body radiation therapy, SBRT)是一項(xiàng)新輔助治療技術(shù)，對(duì)腫瘤組織毀損率高，療效顯著，但胃腸道不良反應(yīng)顯著，制約了其臨床應(yīng)用[4]。高強(qiáng)度聚焦超聲(high intensity focused ultrasound, HIFU)是利用熱效應(yīng)及空化效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)消融治療病灶，對(duì)胰腺癌具有顯著優(yōu)勢(shì)[5]，但如果腫瘤較大或緊鄰正常器官則會(huì)遺漏部分腫瘤靶區(qū)，尤其是無(wú)法治療亞臨床病灶[6]。因此，本研究以裸鼠胰腺癌模型為基礎(chǔ)，嘗試HIFU聯(lián)合SBRT治療局部進(jìn)展期胰腺癌，觀察其臨床療效及不良反應(yīng)，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞培養(yǎng) S-P免疫組化試劑盒由本院病理科提供，Ki-67、Caspase-3、STAT-3等抗體購(gòu)自Abcam公司。培養(yǎng)經(jīng)過甄選的人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，將其接種于含有近10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37.0℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵化箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用0.9%氯化鈉溶液制成密度1×107/mL的細(xì)胞懸液備用。

1.2 裸鼠胰腺移植瘤的制備及分組 選用18～22 g(SPF級(jí))BALB/c nu-nu 4周齡健康雄性裸鼠24只(上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。將密度為1×107/mL的腫瘤細(xì)胞懸液接種于所有BALB/c nu-nu裸鼠的右下肢大腿外側(cè)皮下，并將其喂養(yǎng)至移植瘤平均直徑約1.0 cm。

選取其中24只成功種植胰腺移植瘤裸鼠，隨機(jī)分為4組，分別接受不同的治療措施：?jiǎn)渭僅IFU組：?jiǎn)涡蠬IFU 1次；單純放療組：外照射每次10 Gy，1次/d，共照射3次；HIFU+放療組：先行HIFU 1次，后行外照射(每次10 Gy，1次/d，共照射3次)；空白對(duì)照組：不作任何干預(yù)。

1.3 治療方法 采用1%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉。用Varian Clinaci X直線加速器6 MV-X線。將裸鼠用自制固定架固定，在瘤體上放1 cm組織等效填充物，源皮距(SSD)為100 cm。照射野寬度均為2.0～2.5 cm。HIFU應(yīng)用HIFUNIT9000P型高強(qiáng)度超聲聚焦儀，B超引導(dǎo)探頭頻率為3.5 MHz，治療超聲頻率1.5 MHz，電功率為1.02 kW，焦距140 mm，焦點(diǎn)最大聲強(qiáng)10 000 W/cm，焦域大小為1.2 mm×1.2 mm×8 mm。HIFU+放療組治療間隔時(shí)間不超過2周。

1.4 治療效果觀察 各組裸鼠在治療后置于動(dòng)物室中飼養(yǎng)。觀察其一般生活狀態(tài)：精神、體質(zhì)量、飲食、飲水情況、活動(dòng)能力、大便狀況等。再觀察裸鼠移植腫瘤周圍皮膚反應(yīng)、潰瘍、壞死情況。定期使用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠體移植瘤的最大直徑(b)及橫徑(a)，計(jì)算腫瘤體積(T)。腫瘤體積計(jì)算公式：T=a2×b/2。比較各組裸鼠的體質(zhì)量平均值，并且評(píng)價(jià)營(yíng)養(yǎng)差異。根據(jù)每組裸鼠移植瘤的平均體積變化數(shù)值來繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，分析腫瘤生長(zhǎng)延緩情況。計(jì)算體積抑瘤率，公式如下：體積抑瘤率=[(對(duì)照組平均體積-實(shí)驗(yàn)組平均體積)/對(duì)照組平均體積]×100%。

1.5 免疫組化測(cè)定Ki-67、Caspase-3、STAT-3的表達(dá) 完成照射后2周殺死裸鼠，取出腫瘤組織，按常規(guī)S-P法進(jìn)行。組織按4 μm厚切片，黏附載玻片上，60℃烤片機(jī)烘烤12 h，隨后二甲苯10 min脫蠟，PBS沖洗3次(3 min/次)，微波修復(fù)，將所有切片冷卻至室溫。再用3%H2O2來阻斷其內(nèi)源性過氧化物酶，用PBS緩沖液沖洗3次(5 min/次)。按說明書添加一抗、二抗，再用PBS緩沖液沖洗。DAB試劑顯色，蘇木精試劑復(fù)染5 min、并用鹽酸乙醇分化3 s，再脫水，并封片。根據(jù)免疫組化抗原抗體特異性結(jié)合的原理，將免疫復(fù)合物沉積的部位以及免疫反應(yīng)的強(qiáng)度在光鏡下進(jìn)行觀察、隨機(jī)選取視野攝影。結(jié)果分析采用半定量法：即用“-”、“+”、“”和“”來表示染色結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：隨機(jī)選取10個(gè)視野(高倍或低倍)，陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞總數(shù)的10%以下為“-”，25%以下為“+”，25%～60%為“”，>60%為“”。

2 結(jié) 果

2.1 裸鼠成瘤情況及移植瘤體積的對(duì)比 細(xì)胞懸液接種后3周左右可見裸鼠皮下小結(jié)節(jié)形成(肉眼可見判定為成瘤)，成瘤率100%。7周后腫瘤直徑達(dá)1 cm，開始治療。治療后，與空白對(duì)照組相比，各組移植瘤均明顯縮小(圖1)。治療后第3周，單純放療組、HIFU聯(lián)合放療組、單純HIFU組裸鼠移植瘤瘤體逐漸增加，療效依次遞減(P<0.000 1，表1)。

2.2 各組裸鼠治療不良反應(yīng) HIFU常見的并發(fā)癥是皮膚損傷，緣于皮膚不同層次間的超聲反射差異。HIFU組和HIFU+放療組各有4例裸鼠照射部位出現(xiàn)潰瘍，而單純放療組及空白對(duì)照組沒有明顯皮膚損傷發(fā)生。HIFU組和HIFU+放療組各有2例出現(xiàn)治療后休克，表現(xiàn)為四肢厥冷、無(wú)力，意識(shí)減弱，而其他兩組沒有休克發(fā)生。

2.3 免疫組化染色結(jié)果 結(jié)果(圖2)表明：空白對(duì)照組、HIFU組裸鼠肢體皮下胰腺癌移植瘤Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率分別為60%、90%，放療及HIFU+放療組陽(yáng)性表達(dá)率均為80%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)；空白對(duì)照組和單純放療組HMGB-1陽(yáng)性表達(dá)率為40%，HIFU組及HIFU+放療組陽(yáng)性表達(dá)率均為90%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；各組間STAT-3表達(dá)水平相同，均為40%；各組間Caspase-3表達(dá)水平相同，均為10%。

圖1 裸鼠肢體皮下胰腺癌移植瘤H-E染色

組 別治療前腫瘤體積V/mm3治療后腫瘤體積V/mm3體積抑制率(%)P值HIFU組515.50±22.96507.78±16.5036.32<0.0001放療組513.46±10.34123.72±6.7784.49<0.0001HIFU+放療組513.17±11.43235.37±31.7170.49<0.0001空白對(duì)照組510.48±9.42797.47±20.93

圖2 裸鼠肢體皮下胰腺癌移植瘤免疫組化染色

A:空白對(duì)照組Ki-67表達(dá)；B:HIFU組Ki-67表達(dá)；C:HIFU+放療組 Ki-67表達(dá)；D:放療組Ki-67表達(dá)；E:空白對(duì)照組HMGB-1表達(dá)；F:HIFU組HMGB-1表達(dá)；G: HIFU+放療組HMGB-1表達(dá)；H: 放療組HMGB-1表達(dá);I: 空白對(duì)照組STAT-3表達(dá)；J: HIFU組STAT-3表達(dá)；K: HIFU+放療組STAT3表達(dá)；L: 放療組STAT3表達(dá);M: 空白對(duì)照組Caspase-3表達(dá)；N: HIFU組Caspase-3表達(dá)；O: HIFU+放療組Caspase-3表達(dá);P: 放療組Caspase-3表達(dá). Original magnification:×400(A,C～H,J～P),×200(B，I)

3 討 論

HIFU治療胰腺癌的機(jī)制是利用其特殊物理性質(zhì)，包括高溫效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)反應(yīng)時(shí)致腫瘤組織變性、凝固、壞死，從而使組織細(xì)胞破裂。聚焦超聲產(chǎn)生的熱量對(duì)腫瘤組織產(chǎn)生高溫固化的作用。HIFU的能量對(duì)直徑大于200 μm血管不會(huì)有大的不良影響，僅對(duì)直徑小于200 μm的滋養(yǎng)血管產(chǎn)生治療作用，使之發(fā)生閉塞。

裸鼠異位種植胰腺癌模型是簡(jiǎn)潔有效的實(shí)驗(yàn)方法，本研究以此模擬局部進(jìn)展期胰腺癌。前期HIFU治療裸鼠胰腺癌的療效得到證實(shí)，但目前缺乏針對(duì)較小胰腺癌腫瘤的相關(guān)數(shù)據(jù)。本研究在兩個(gè)方面有所變化：治療時(shí)瘤體長(zhǎng)徑約1.0 cm；臨床中HIFU靶區(qū)躲避正常組織，在本實(shí)驗(yàn)中為模擬這種治療方式，治療靶區(qū)盡量保護(hù)皮膚和周圍組織，因此未包及整體腫瘤。這種設(shè)計(jì)的前提是HIFU和放療的殺傷機(jī)制具有空間互補(bǔ)作用，即HIFU針對(duì)中心區(qū)域腫瘤細(xì)胞，而放療殺傷腫瘤周邊富氧細(xì)胞。

本研究通過胰腺癌PANC-1細(xì)胞株建立胰腺癌的裸鼠模型，治療順序是先HIFU后放療，提出聯(lián)合治療效果最佳的假設(shè)。但結(jié)果并未證實(shí)二者具有協(xié)同作用，療效為放療>HIFU+放療> HIFU。相關(guān)分子的檢測(cè)情況為機(jī)制探討提供部分線索。治療后Ki-67各組均處于較高水平，以HIFU組最為顯著，說明腫瘤再增殖更為活躍。這說明HIFU治療啟動(dòng)了瘤體邊緣活躍腫瘤細(xì)胞的增殖，盡管腫瘤中心治療后出現(xiàn)大片壞死，但治療后腫瘤組織仍然具有增殖潛能，此時(shí)加用放療也不能明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)。

STAT-3是信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)蛋白家族成員，是一類由細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等多肽類配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。本研究發(fā)現(xiàn)各治療組與對(duì)照組表達(dá)沒有顯著差異，但都處于較高水平，說明經(jīng)過再增殖，各組腫瘤生長(zhǎng)速度趨于一致。HMGB-1促進(jìn)細(xì)胞的遷移，其HMGB-1高表達(dá)與胰腺癌不良預(yù)后顯著相關(guān)。在應(yīng)激條件下，HMGB-1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)位至胞質(zhì)，啟動(dòng)自噬，維持細(xì)胞存活。本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB-1在HIFU+放療組表達(dá)顯著升高，可能的解釋是HIFU誘導(dǎo)的自噬促進(jìn)了腫瘤的存活，并使其保持一定水平的增殖[7-8]。

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常情況下以酶原的形式存在于胞質(zhì)中，在凋亡的早期階段，它被激活，裂解相應(yīng)的胞質(zhì)胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，Caspase-3的活性明顯下降。在藥物治療胰腺癌的實(shí)驗(yàn)中上述機(jī)制得以體現(xiàn)[9]。本研究中，癌組織生長(zhǎng)4周以上，各治療組與對(duì)照組Caspase-3表達(dá)沒有顯著差異，說明經(jīng)過再增殖，各組腫瘤生長(zhǎng)速度趨于一致。

在不良反應(yīng)方面，包含HIFU的兩個(gè)組反應(yīng)較大，包括局部損傷和全身反應(yīng)，治療前需要高質(zhì)量麻醉，以防止裸鼠在治療刺激情況下蘇醒。盡管如此，仍有數(shù)只裸鼠還是進(jìn)行了二次麻醉。

綜上所述，本研究通過HIFU聯(lián)合放療治療胰腺癌的細(xì)胞裸鼠模型，發(fā)現(xiàn)HIFU序貫放療的聯(lián)合治療模式療效并不優(yōu)于單獨(dú)放療，且不良反應(yīng)較高，其臨床應(yīng)用尚需進(jìn)一步探索。

[ 1 ] CHEN W, ZHENG R, BAADE P D,et al. Cancer statistics in China, 2015[J].CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[ 2 ] 齊瑞雪,喬田奎,高彩霞.三維適形放射治療聯(lián)合吉西他濱與替加氟化學(xué)治療對(duì)局部晚期胰腺癌的療效[J].中國(guó)臨床醫(yī)學(xué),2013,20(5): 653-654.

[ 3 ] TEMPERO M A, MALAFA M P, BEHRMAN S W,et al.Pancreatic adenocarcinoma, version 2.2014: featured updates to the NCCN guidelines[J].J Natl Compr Canc Netw,2014,12(8):1083-1093.

[ 4 ] MELLON E A, HOFFE S E, SPRINGETT G M, et al.Long-term outcomes of induction chemotherapy and neoadjuvant stereotactic body radiotherapy for borderline resectable and locally advanced pancreatic adenocarcinoma[J].Acta Oncol,2015,54(7):979-985.

[ 5 ] LI P Z, ZHU S H, HE W, et al. High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2012,11(6):655-660.

[ 6 ] SUNG H Y, JUNG S E, CHO S H, et al.Long-term outcome of high-intensity focused ultrasound in advanced pancreatic cancer[J].Pancreas,2011,40(7):1080-1086.

[ 7 ] XU X, ZHU H, WANG T, et al.Exogenous high-mobility group box 1 inhibits apoptosis and promotes the proliferation of lewis cells via RAGE/TLR4-dependent signal pathways[J].Scand J Immunol,2014,79(6):386-394.

[ 8 ] TAKEDA T,IZUMI H, KITADA S,et al.The combination of a nuclear HMGB1-positive and HMGB2-negative expression is potentially associated with a shortened survival in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma[J].Tumour Biol,2014,35(10):10555-10569.

[ 9 ] MOURATIDIS P X,COLSTON K W,DALGLEISH A G.Doxycycline induces caspase-dependent apoptosis in human pancreatic cancer cells[J].Int J Cancer,2007, 120(4):743-752.

[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

Effect of pancreatic cancer treated with high intensity focused ultrasound combined radiotherapy in null mice

HU Ye1, GAO Feng2, YAO Sheng-yu1, CHEN Xu-ming1, WU Qing1, WANG Chun-gang1*, WANG Li-wei1*

1.Department of Oncology, Shanghai General People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 201620, China 2.Department of Pathology, Shanghai General People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 201620, China

Objective： To analyze the effect of high intensity focused ultrasound (HIFU) combined with sequential radiotherapy on pancreatic cancer via transplanted tumor mice model. Methods： PANC-1 cells were injected subcutaneously into the right scapular region of twenty-four BALB/c nu-nu mice. The mice were then randomly divided to 4 groups, control group, HIFU alone group, RT alone group, HIFU combined RT group. The tumor volume change and acute side reaction were measured. The expressions of Ki-67, Caspase-3, STAT-3, and HMGB-1 were analyzed using immunohistochemistry. Results： In the control group, tumor volume increased significantly. Tumor control rate was 36.32% in HIFU alone group, 84.49% in RT alone group, and 70.49% in HIFU combined RT group, respectively (P<0.05). There was no acute adverse event in control and RT alone groups. Two shock reaction and four cases of burn injury reaction were all found in HIFU and HIFU combined RT groups. The expression of HMGB-1 was significantly increased in HIFU and HIFU combined RT groups as compared with control and RT alone groups (P<0.05). Ki-67 and STAT-3 were highly expressed in all groups, but the expression of Caspase-3 was quite low in all groups. Conclusions： The treatment of HIFU combined with sequential radiotherapy on pancreatic cancer failed to show synergistic effect, and the adverse reaction was higher than that of radiotherapy alone.

high intensity focused ultrasound; radiotherapy; pancreatic cancer; Caspase-3

2016-10-09 [接受日期] 2017-03-07

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(11DZ1922002)，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院科技基金資助項(xiàng)目(20120710). Supported by Project of Industry, School and Research Institution of Shanghai Science and Technology Commission(11DZ1922002) and the Science Foundation of Shanghai Jiao Tong University School of Medicine(20120710).

胡 燁，碩士生.E-mail: amylittlefox@163.com

*通信作者(Corresponding authors). Tel: 021-63240090,E-mail: cg2002wang@126.com; Tel: 021-68385559, E-mail: lwwang2013@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160940

R 735.9

A