基于PepT1—PPARα靶標組合的中藥協(xié)同機制解析

喬連生+陳艷昆+雒剛剛+路芳+劉思佳+李貢宇+張燕玲

[摘要] 協(xié)同效應是中藥發(fā)揮藥效的主要作用機制，結(jié)合關(guān)鍵靶標組合探討中藥的協(xié)同效應是闡釋中藥協(xié)同機制的有效方法之一。寡肽轉(zhuǎn)運蛋白（peptide transporter 1，PepT1）是藥物吸收入血的關(guān)鍵靶標之一，約占總轉(zhuǎn)運蛋白含量的50%。過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated recepror α，PPARα）是貝特類降脂藥物的作用靶點，其激動劑具有良好的降血脂藥效。研究表明PPARα可反式激活PepT1的基因表達，PPARα激動劑可促進PepT1底物的吸收，從而共同發(fā)揮協(xié)同作用。因此，本研究擬基于PepT1和PPARα的靶標組合，發(fā)現(xiàn)中藥活性成分中的PepT1底物和PPARα激動劑，并在一定程度上探討中藥活性成分吸收入血與降低血脂的協(xié)同機制。該研究基于前期實驗室已構(gòu)建的PPARα激動劑的融合藥效團模型，篩選潛在的具有PPARα激動效應的中藥活性成分，并追溯其來源中藥。同時構(gòu)建PepT1底物的支持向量機模型，預測中藥中潛在的PepT1底物。通過分析2組篩選結(jié)果，發(fā)現(xiàn)三七-靈芝、三七-丹參組合可能通過PepT1和PPARα協(xié)同機制發(fā)揮降脂藥效。該研究基于PepT1-PPARα的靶標組合，探索中藥活性成分吸收與降脂藥效的協(xié)同機制，為基于靶標組合探討中藥藥代動力學參與的協(xié)同機制研究提供了一條新思路。

[關(guān)鍵詞] PepT1；PPARα；協(xié)同機制；SVM；融合藥效團；分子對接；虛擬篩選

[Abstract] Synergistic effect is main pharmacological mechanism of traditional Chinese medicine（TCM）. The research method based on the key targets combination is an important method to explore the synergistic effect of TCM. Peptide transporter 1 （PepT1） is an essential target for drug uptake into the bloodstream，accounting for about 50% of the total transporter protein content from the small intestine. Peroxisome proliferator-activated receptor α（PPARα） is the lipid-lowering target of fibrates，which have a good hypolipidemic effect by activating PPARα. It has been reported that PPARα could activate the gene expression of PepT1s，and PPARα agonists can promote the uptake of PepT1 substrates，indicating their synergistic effect. In this paper，PepT1 substrates and PPARα agonists from TCM were discovered，and their synergistic mechanism was also been discussed based on the target combination of PepT1 and PPARα. The support vector machine（SVM） model of PepT1 substrates was first constructed and utilized to predict potential TCM components. Meanwhile，merged pharmacophore and docking model of PPARα agonists was used to screen the potential active ingredients from TCM. According to the analysis results of two groups，the TCM combination of Panax notoginseng and Ganoderma lucidum，as well as TCM combination of P. notoginseng and Salvia miltiorrhiza were identified to have the synergistic mechanism based on target combination of PepT1 and PPARα. In this study，synergistic mechanism of TCM was analyzed for absorption and hypolipidemic effect based on target combination，which provides a new way to explore the synergetic mechanism of TCM related to pharmacokinetics.

[Key words] PepT1；PPARα；synergistic mechanism；SVM；merged pharmacophore；docking；virtual screening

中藥協(xié)同效應研究是中藥物質(zhì)基礎與作用機制研究的關(guān)鍵，已有研究多是從經(jīng)典方劑或藥對出發(fā)，解析其化學組成與物質(zhì)基礎，進一步探討其發(fā)揮藥理作用的分子機制，并闡明其協(xié)同效應[1-2]。本研究擬采用逆向的研究思路，即從藥物靶標組合出發(fā)，結(jié)合分子模擬技術(shù)，發(fā)現(xiàn)潛在的中藥活性成分，并在靶標組合的基礎上探討中藥的協(xié)同機制。傳統(tǒng)的靶標組合概念特指具有治療效應的靶標之間的組合，隨著概念的延伸，治療靶標與吸收、轉(zhuǎn)運、代謝等靶標之間組合也被稱為靶標組合[3-4]。本研究選擇的研究載體為寡肽轉(zhuǎn)運體（peptide transporter 1，PepT1）和過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）的靶標組合。PepT1主要存在于生物體的小腸部位，是經(jīng)典的藥物轉(zhuǎn)運體，具有極寬泛的底物譜，是多種藥物吸收入血的重要途徑，約占總轉(zhuǎn)運蛋白含量的50%[5]。PPARα是經(jīng)典的降脂靶標，其激動劑貝特類藥物具有明確的降脂藥效，其降脂機制有別于抑制膽固醇合成通路的HMG-CoA還原酶抑制劑，PPARα激動劑可通過調(diào)節(jié)血脂的代謝通路從而發(fā)揮降脂的藥效。研究表明PPARα具有調(diào)節(jié)多種腸道轉(zhuǎn)運體，尤其是PepT1表達的效應，部分PPARα激動劑也被證明具有促進PepT1底物吸收的效應[6-8]，因此，基于此靶標組合探討中藥吸收入血與降低血脂的協(xié)同機制對中藥藥代動力學參與的中藥協(xié)同機制分析具有重要意義。

本研究針對PepT1和PPARα的靶標組合，首先構(gòu)建PepT1底物預測的支持向量機模型（support vector machine，SVM），并通過多種內(nèi)測及外測參數(shù)挑選最優(yōu)的SVM模型?；谧顑?yōu)的SVM模型篩選中藥中潛在的PepT1底物成分。隨后，進一步結(jié)合實驗室已構(gòu)建的PPARα激動劑的融合藥效團模型和分子對接模型，篩選中藥中潛在的PPARα激動活性成分。追溯2個靶標篩選到的活性成分的來源中藥，并結(jié)合文獻探討高頻中藥在方劑和藥對中可能存在的協(xié)同機制，從PepT1和PPARα靶標組合的角度出發(fā)，闡釋中藥吸收入血與降低血脂的協(xié)同機制。

1 材料與方法

1.1 PepT1支持向量機模型的構(gòu)建與驗證

1.1.1 數(shù)據(jù)收集與整理 本文從文獻[9-11]中收集PepT1底物共計90個，以此作為陽性化合物構(gòu)建PepT1支持向量機模型。陰性化合物來源于Drugbank數(shù)據(jù)庫（http：//www.drugbank.ca/）中的非PepT1轉(zhuǎn)運的已上市藥物。首先，利用Discovery Studio 4.0軟件計算所有化合物的8個類藥性質(zhì)描述符，包括AlogP、相對分子質(zhì)量、氫鍵供體數(shù)目、氫鍵受體數(shù)目、可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目、脂環(huán)數(shù)目、芳環(huán)數(shù)目、分子極性比表面積。隨后利用8個描述符，基于主成分分析方法描述化合物的化學結(jié)構(gòu)空間分布[12]。通過比較陽性化合物和陰性化合物化學空間的差異，利用隨機選取和等距離抽樣的方式挑選用于建模的陰性化合物，并利用KS方法實現(xiàn)化合物數(shù)據(jù)集的劃分。為使訓練集具有較好的代表性，數(shù)據(jù)集劃分應保證訓練集中陽性化合物和陰性化合物的比例約為1∶1，內(nèi)部測試集中陽性樣本和陰性樣本的比例約為1∶3，外部測試集中陽性樣本和陰性樣本的比例約為1∶3。

1.1.2 模型的建立 本文利用Dragon 2.1軟件計算用于構(gòu)建模型的化合物的1 481個分子描述符，并利用Weka 3.6.10的BestFirst-D1-N5搜索方法和CfsSubsetEval-P1-E1評估方法，針對訓練集和內(nèi)部測試集的分子描述符，進行降維并去除冗余，得到與所構(gòu)建模型最相關(guān)的分子描述符子集。本研究基于訓練集化合物利用SVM建立定性預測模型。實驗所用SVM算法采用臺灣大學林智仁提供的網(wǎng)絡共享算法libsvm3.1（http：//www.csie.ntu.edu.tw/～cjlin/libsvm/），并將3種歸一化數(shù)據(jù)處理方法和4種模型參數(shù)尋優(yōu)方法組合并進行建模，通過比較各模型訓練集、內(nèi)部測試集和外部測試集的評價參數(shù)，得到最優(yōu)建模組合。歸一化數(shù)據(jù)處理中包括3種處理方法：不處理、[0，1]歸一化和[-1，1]歸一化。模型參數(shù)尋優(yōu)處理中選用RBF核函數(shù)，4種參數(shù)尋優(yōu)方法包括：不處理，GS，PSO和GA。3種數(shù)據(jù)處理方式與4種參數(shù)尋優(yōu)方法排列組合共計構(gòu)建12個SVM模型[13]。其中，尋優(yōu)參數(shù)（C，γ）的選擇采用逐一交叉驗證的方法確定C和γ，取均方根（RMS）最小時的C和γ值，以防止訓練集在過擬合的情況下找到最優(yōu)參數(shù)。綜合考慮各模型間訓練集、外部測試集和內(nèi)部測試集的優(yōu)劣，選擇最優(yōu)實驗方案。

1.1.3 模型的驗證 針對已構(gòu)建的12個SVM模型，首先利用內(nèi)部測試集對模型進行評價，評價指標包括準確率（ACC）、靈敏度（SE）和特異性（SP）。各項指標數(shù)值越大，模型性能越好。計算公式為（1）～（3）[14]。其中TP為真陽化合物數(shù)目，TN為真陰化合物數(shù)目，F(xiàn)P為假陽化合物數(shù)目，F(xiàn)N為假陰化合物數(shù)目。

ACC=（TP+TN）/（TP+FN+TN+FP）（1）

SE=TP/（TP+FN）（2）

SP=TN/（TN+FP）（3）

隨后利用外部測試集對模型進行評價。評價指標同樣包括：ACC，SE和SP。同時，繪制外部測試集的ROC曲線，并計算其曲線下面積（AUC）值，從而共同說明模型的準確性。隨后，利用獲得的最優(yōu)PepT1底物判別模型預測中藥化學成分數(shù)據(jù)庫（TCMD）的成分，追溯其來源中藥，分析高頻中藥的藥性及功能主治，通過文獻驗證，說明篩選結(jié)果的合理性。

1.2 基于PepT1-PPARα的協(xié)同機制解析

利用實驗室前期已構(gòu)建的PPARα激動劑的融合藥效團模型，篩選TCMD數(shù)據(jù)庫[15]。同時，結(jié)合PPARα激動劑的分子對接篩選模型（PDB：3KDU），進一步篩選藥效團命中的潛在活性成分，并追溯篩選結(jié)果的來源中藥。隨后，針對PPARα激動劑與PepT1底物的來源中藥，分析其相互關(guān)系，并討論具有PPARα激動效應的中藥成分對PepT1中藥底物吸收和藥效發(fā)揮的促進作用，進一步闡釋中藥協(xié)同作用機制。

2 結(jié)果與討論

2.1 PepT1的支持向量機模型

基于陰性化合物與陽性化合物的化學空間分析，結(jié)合隨機選取和等距離抽樣的方式，共挑選150個陰性化合物用于SVM模型的構(gòu)建與驗證，基于8個類藥描述符進行陰性與陽性化合物的主成分分析結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，陽性化合物的化學空間可以被陰性化合物所覆蓋，說明研究所用數(shù)據(jù)集中的陰性和陽性化合物在類藥性質(zhì)上沒有明顯差異，能夠確保構(gòu)建的SVM模型的可靠性[16]。隨后基于KS方法進行數(shù)據(jù)集的劃分，結(jié)果如下：訓練集中包括60個陽性化合物和60個陰性化合物，內(nèi)部測試集中包括15個陽性化合物和45個陰性化合物，外部測試集中包括15個陽性化合物和45個陰性化合物。本研究進一步利用weka機器平臺進行描述符的篩選，共獲得28個描述符，模型的描述符名稱見表1。

本研究進一步結(jié)合3種數(shù)據(jù)處理方法與4種尋優(yōu)算法，構(gòu)建了12個SVM模型，12個模型的訓練集、內(nèi)部測試集和外部測試集的準確率見表2。通過綜合考慮各模型間訓練集、內(nèi)部測試集和外部測試集的優(yōu)劣，選取6號模型為最優(yōu)模型。該模型對數(shù)據(jù)采用[0，1]歸一化處理和GS參數(shù)尋優(yōu)方法進行建模，C為5.278，γ為1.741 1，得到模型自身預測ACC為96.67%。歸一化與參數(shù)尋優(yōu)結(jié)果見圖2。6號模型內(nèi)部測試集的SE和SP值分別為86.67%，80.00%，外部測試集的SE和SP值分別為86.67%，86.66%。根據(jù)測試集與訓練集數(shù)據(jù)，對PepT1底物模型進行ROC曲線分析，所得曲線下面積（AUC）為0.939，曲線見圖2。PepT1底物模型的ACC，SE，SP均在80%以上，AUC大于0.9，結(jié)果表明PepT1底物模型具有較好的預測能力。

2.2 PepT1底物與PPARα激動劑的中藥活性成分篩選

利用已構(gòu)建的PepT1底物的SVM模型，篩選經(jīng)過類藥五原則處理的TCMD數(shù)據(jù)庫，共獲得194個潛在的PepT1中藥底物，結(jié)果表明其可通過PepT1轉(zhuǎn)運吸收入血，通過追溯來源中藥，排名前9的來源中藥見表3，其中，三七和鉤藤為常用降脂中藥[17]。同時，本研究通過PPARα激動劑的藥效團和分子對接模型的聯(lián)合篩選，共獲得潛在的中藥活性成分182個，結(jié)果表明其具有潛在的降脂藥理活性，排名前9的來源中藥見表3，其中，靈芝、五味子、羅漢果、茯苓、甘草和丹參為常用降脂中藥。由于PPARα激動劑降脂機制有別于抑制膽固醇合成通路的HMG-CoA還原酶抑制劑，PPARα激動劑可通過調(diào)節(jié)血脂的代謝途徑從而發(fā)揮降脂的藥效。因此，本文篩選結(jié)果中并未發(fā)現(xiàn)常用降脂中藥紅曲，中藥紅曲的降脂機制已經(jīng)部分解析，其主要成分洛伐他汀可通過抑制HMG-CoA還原酶阻斷膽固醇合成通路發(fā)揮降脂藥效，與本文所述機制激活甘油三酯與膽固醇的代謝通路不同。

本研究以命中的13個靈芝三萜中綜合打分最高的靈芝酸ε（CAS：294674-05-8）為例，展示靈芝三萜與PPARα激動劑融合藥效團及分子對接的匹配結(jié)果，結(jié)果見圖3。靈芝酸ε與藥效團的匹配度（Fitvalue）為8.54，與分子對接打分（libdock score）為112.4。C-15的羰基氧與藥效團的氫鍵受體特征具有良好匹配并與關(guān)鍵氨基酸SER280產(chǎn)生氫鍵作用[18]。同時，C-25的羧基與藥效團的負電特征具有良好的匹配，且其羥基氧與THR279和CYS275產(chǎn)生氫鍵相互作用。

三七和靈芝分別是包含2個靶標潛在活性成分數(shù)最多的中藥。三七是常用的止血活血藥，具有明確的降血脂活性[19]，三七環(huán)肽是其主要成分之一[20]。

本研究PepT1底物預測模型命中了大量的三七環(huán)肽成分，說明三七中環(huán)肽成分可能主要通過PepT1吸收入血，從而發(fā)揮藥效作用。靈芝具有明確的降血脂藥效[21]，本研究發(fā)現(xiàn)靈芝中大量的靈芝三萜具有較好的PPARα激動效應，說明靈芝可能是通過激動PPARα來調(diào)節(jié)血漿中甘油三酯和膽固醇的含量，從而發(fā)揮降脂藥效。靈芝-三七藥對是近年來發(fā)現(xiàn)的具有良好降脂藥效的藥對組合，如三七-靈芝孢子粉提取物[22]以及靈芝三七降壓片[23]均被證明有良好的降低甘油三酯和膽固醇的作用?；诒狙芯康念A測結(jié)果，靈芝中具有的潛在PPARα激動效應的靈芝三萜既能發(fā)揮良好的降脂效應，同時又能調(diào)節(jié)PepT1轉(zhuǎn)運體的表達，從而促進三七環(huán)肽等PepT1底物的吸收入血，從而加強其降脂效應。因此，靈芝與三七藥對的協(xié)同效應，可能是其發(fā)揮藥效的主要機制之一。

丹參-三七配伍具有活血散瘀，理氣止痛之功效[24]。丹參-三七藥對是臨床常用治療心腦血管疾病的核心藥對之一，其主要參與組成包括復方丹參方和芪參益氣方等丹七類方?；诒狙芯康念A測結(jié)果，三七環(huán)肽可通過PepT1吸收入血，而丹參中部分成分也被發(fā)現(xiàn)具有潛在的PPARα激動效應，說明激動PPARα可能是丹參發(fā)揮降脂藥效的作用機制之一。針對丹七類方的多項研究表明，丹七類方具有良好的治療心腦血管疾病的藥效，其可以顯著降低血漿中膽固醇及甘油三酯含量[25-26]。通過本研究的篩選結(jié)果分析，丹七類方發(fā)揮協(xié)同藥效的作用機制之一，可能是通過丹參中部分成分激動PPARα，從而上調(diào)PepT1轉(zhuǎn)運體的表達，促進三七中環(huán)肽及其他成分的加速吸收，增強三七的藥理活性，因此進一步針對丹七類方的研究可以從其吸收機制出發(fā)，探討其吸收入血與降低血脂的協(xié)同機制。

3 結(jié)論

中藥協(xié)同機制的闡釋是中藥作用機制解析的關(guān)鍵。本研究從PepT1和PPARα的靶標組合出發(fā)，構(gòu)建其底物及激動劑的辨識模型。進一步通過篩選中藥活性成分，追溯其來源中藥，在整體中藥的層次探討其協(xié)同機制。研究發(fā)現(xiàn)三七-靈芝和三七-丹參藥對含有可有效激活PepT1-PPARα靶標組合的藥效成分，可能是協(xié)同發(fā)揮其吸收入血與降低血脂的藥效的機制之一，研究結(jié)果尚需進一步的生物活性驗證。本研究為從靶標組合角度出發(fā)探討中藥協(xié)同機制提供了一個研究范例，為結(jié)合中藥活性成分的藥代動力學性質(zhì)探討中藥增效機制提供了一個新的研究方法。

[參考文獻]

[1] Liu Y，Kong J M，Chia L S，et al. Synergistic effect of traditional Chinese medicine[J]. Asian J Chem，2007，19（2）：867.

[2] Jing Z，Zhou T，Chen M，et al. Research progress on synergistic anti-tumor mechanisms of compounds in traditional Chinese medicine[J]. J TCM，2014，34（1）：100.

[3] Tiwari A K，Sodani K，Dai C L，et al. Nilotinib potentiates anticancer drug sensitivity in murine ABCB1-，ABCG2-，and ABCC10-multidrug resistance xenograft models [J]. Cancer Lett，2013，328（2）：307.

[4] Cavalli A，Bolognesi M. Neglected tropical diseases： multi-target-directed ligands in the search for novel lead candidates against trypanosoma and leishmania[J]. J Med Chem，2009，52（23）：7339.

[5] Drozdzik M，Grer C，Penski J，et al. Protein abundance of clinically relevant multidrug transporters along the entire length of the human intestine[J]. Mol Pharm，2014，11（10）：3547.

[6] Okamura A，Koyanagi S，Dilxiat A，et al. Bile acid-regulated PPARα activity underlies circadian expression of intestinal peptide absorption transporter PepT1/Slc15a1[J]. J Biol Chem，2014，289（36）：25296.

[7] Shimakura J，Terada T，Saito H，et al. Induction of intestinal peptide transporter 1 expression during fasting is mediated via peroxisome proliferator-activated receptor alpha[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006，291（5）：851.

[8] Madsen S L，Wong E A. Expression of the chicken peptide transporter 1 and the peroxisome proliferator-activated receptor α following feed restriction and subsequent refeeding[J]. Poultry Sci，2011，90（10）：2295.

[9] Biegel A，Knütter I，Hartrodt B，et al. The renal type H+/peptide symporter PEPT2： structure-affinity relationships[J]. Amino Acids，2006，31（2）：137.

[10] 孫冬黎，曾蘇，蔣惠娣.人寡肽轉(zhuǎn)運體hPepT1及其在前藥設計中的應用[J].中國藥學雜志，2011，46（3）：161.

[11] Xuan S，Wang M，Kang H，et al. Support vector machine（SVM） models for predicting inhibitors of the 3′processing step of HIV-1 integrase[J]. Mol Informatics，2013，32（9/10）：811.

[12] Zheng C S，Xu X J，Ye H Z，et al. Computational approaches for exploring the potential synergy and polypharmacology of Duhuo Jisheng Decoction in the therapy of osteoarthritis[J]. Mol Med Rep，2013，7（6）：1812.

[13] Qiao L S，Zhang X B，Jiang L D，et al. Identification of potential ACAT-2 selective inhibitors using pharmacophore，SVM and SVR from Chinese herbs[J]. Mol Divers，2016，20：933.

[14] 張景芳，蔣蘆荻，張燕玲. 支持向量機在中藥神經(jīng)毒性成分篩查中的應用[J]. 中國中藥雜志，2014，39（17）：3330.

[15] Qiao L S，He Y S，Huo X Q，et al. Construction and evaluation of merged pharmacophore based on peroxisome proliferator receptor-alpha agonists[J]. Chin J Chem Physics，2016，29（4）：508.

[16] 鄭春松，葉蕻芝，劉獻祥，等. 海桐皮湯治療骨性關(guān)節(jié)炎的化學空間及多靶點效應分析[J]. 中國臨床藥理學與治療學，2009，14（1）：67.

[17] 鐘周，周鴻圖，胡志希，等. 140味降脂中藥治療高脂血癥的用藥規(guī)律分析[J]. 湖南中醫(yī)藥大學學報，2015，35（1）：64.

[18] Dhoke G V，Gangwal R P，Sangamwar A T. A combined ligand and structure based approach to design potent PPAR-alpha agonists[J]. J Mol Struct，2012，1028（28）：22.

[19] 孫欣峰，吳立明，郝芬蘭.降脂中藥的研究現(xiàn)狀及展望[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2001，8（1）：25.

[20] 蘇磊，姜艷艷，劉斌.《中國藥典》收錄的植物類中藥中含有的寡肽類成分[J].中國中藥雜志，2016，41（16）：2943.

[21] 唐粉芳，郭豫，張靜，等.靈芝菌絲體降脂作用的實驗研究[J].食品科學，2003，24（4）：145.

[22] 王亞東，王海玉，張桂霞，等. 三七和靈芝孢子粉提取物對高血脂模型大鼠降血脂作用的實驗研究[J]. 實用預防醫(yī)學，2006，13（6）：1452.

[23] 雷曉林，劉偉，王瑞丞.靈芝三七降脂片對高脂血癥大鼠降血脂作用的實驗研究[J].中國實用醫(yī)藥，2009，4（16）：24.

[24] 陳銳娥，申東艷，李鵬，等.中藥藥對的系統(tǒng)研究（Ⅴ）——丹參三七藥對研究[J].世界科學技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，14（2）：1342.

[25] 羅穎穎，陳蘭英，龔琴，等.冠心丹參片對高脂大鼠球囊損傷術(shù)后血管內(nèi)膜增生的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志，2011（23）：203.

[26] 佘奕鈿.丹七湯治療痰瘀互結(jié)型血脂異常的臨床觀察[D]. 廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2010.

[責任編輯 張寧寧]