高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定4種植物生長延緩劑在6種根及根莖類藥材中殘留量

翟宇瑤+郭寶林

[摘要] 建立了適用于根及根莖類藥材中同時測定多效唑、丁酰肼、矮壯素和縮節(jié)胺4種植物生長延緩劑殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS-MS）測定方法。根類藥材樣品分別經(jīng)含0.1%甲酸的乙腈混合液提取兩次，混合提取溶液經(jīng)Waters Atlantis HILIC色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.0 μm）分離，用含0.1%甲酸的0.005 mol·L^-1醋酸銨溶液-甲醇-乙腈（13∶15∶72）等度洗脫，采用電噴霧正離子模式多反應監(jiān)測。4種植物生長延緩劑在6～1 500 μg·kg^-1線性良好，相關系數(shù)為0.997 8～0.999 9；加樣回收率為79.3%～103.3%，相對標準偏差（RSD）均不大于11%。在檢測的麥冬、當歸、牛膝、澤瀉、川芎和三七等藥材中，4種植物生長延緩劑在其中部分藥材中有檢出，其中較為嚴重的情況是，麥冬的多效唑檢測量為63.4～1 351.6 μg·kg^-1，麥冬、澤瀉、川芎、當歸4種藥材中檢測到丁酰肼。

[關鍵詞] 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；根類藥材；植物生長延緩劑

[Abstract] HPLC-MS/MS was applied to the determination of residual amount of plant growth retardant such as paclobutrazol，daminozide，chlormequat and mepiquat chloride in dried root and rhizome herbs. The sample was extracted twice with acetonitrile containing 0.1% formic acid. The separation was performed on a Waters Atlantis HILIC column with an elution system consisting of acetonitrile-5 mmol·L^-1 ammonium acetate solution with 0.1% formic acid，methanol and acetonitrile. The MS spectrum was acquired in positive mode with multiple reactions monitoring （MRM）. The linear range was 6-1 500 μg·kg，and the optimized method offered a good linear correlation （r>0.997 8），excellent precision （RSD<11%） and acceptable recovery （from 79.3% to 103.3%）. Four kinds of plant growth retardant have detected in some of these herbs like Ophiopogonis Radix，Angelicae Sinensis Radix，Achyranthis Bidentatae Radix，Alismatis Rhizoma，Chuanxiong Rhizama and Notoginseng Radix et Rhizama，is among the more severe cases，dwarf lilyturf，multi-effect azole detection quantity is 63.4～1 351.66 μg·kg^-1，and Daminozide was detected in Ophiopogonis Radix，Angelicae Sinensis Radix，Chuanxiong Rhizama，Alismatis Rhizoma.

[Key words] HPLC-MS/MS；dried root herbs；plant growth retardant

植物生長延緩劑（plant growth retardant，PGR）是植物生長調(diào)節(jié)劑的一類，進入植株體內(nèi)，主要是通過抑制赤霉素的合成抑制植物地上部分的營養(yǎng)生長，從而具有抗倒伏、促分蘗等作用，同時可促進營養(yǎng)向果實和根部轉(zhuǎn)移，而提高果實和根部產(chǎn)量[1]。本研究組在藥用植物種植產(chǎn)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該類植物生長調(diào)節(jié)劑已經(jīng)在幾種根及根莖類藥材種植過程中大量使用[2]。本文作者在道地藥材主產(chǎn)區(qū)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)多效唑（paclobutrazol）、烯效唑（uniconazole）、丁酰肼（daminozide）、矮壯素（chlormequat chloride）、縮節(jié)胺（mepiquat chloride）、氯化膽堿 （choline chloride）等6種植物生長延緩劑在根和根莖類藥材種植過程中使用較多。

目前使用的大部分植物生長延緩劑的毒性為低毒或微毒，不合理使用會導致其在農(nóng)產(chǎn)品中殘留，從而影響食用者的健康。例如丁酰肼（比久）的水解產(chǎn)物非對稱二甲基聯(lián)氨具有致癌的作用[3]。歐盟、日本、澳大利亞等國已制定了水果，蔬菜及農(nóng)作物中多種植物生長延緩劑的限量。其中，歐盟、日本、澳大利亞對多效唑在獼猴桃上的殘留限量分別為 0.02，0.01，0.01 mg·kg^-1；日本規(guī)定丁酰肼在任何食物中不得檢出，在番茄中矮壯素和縮節(jié)胺的最大殘留限量分別是0.05，0.01 mg·kg-1 [4-10]。但對于中藥材中植物生長延緩劑的殘留限量規(guī)定國內(nèi)外尚是空白，實際上，植物生長調(diào)節(jié)劑被發(fā)現(xiàn)廣泛用于藥用植物種植中，因此，在藥材中的限量必須受到重視。本文將首次檢測多效唑、丁酰肼、矮壯素、縮節(jié)胺4種在其他作物中具有殘留限度要求的延緩劑在麥冬、三七、澤瀉、川芎、牛膝、當歸6種藥材中的殘留量。

植物生長延緩劑殘留量的檢測方法包括傳統(tǒng)分析方法（化學法、電位滴定法）和色譜法（氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等），其中 LC-MS/MS 以其可檢測成分微量準確的特點，已成為檢測農(nóng)藥殘留的主要方法。本文建立了一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），用于檢測藥材中多效唑，丁酰肼，矮壯素，縮節(jié)胺成分，此方法可為中藥材中植物生長延緩劑殘留的檢測提供技術(shù)手段。

1 材料

Agilent1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），API3200Q-trap質(zhì)譜儀（美國應用生物系統(tǒng)公司），KQ-100DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），0.45 μm 有機相濾膜（上海安譜科學儀器有限公司），乙腈（色譜純，Honeywell Burdick & Jackson，韓國 SK Chemicals 公司），甲醇（分析純，西隴化工股份有限公司），多效唑（P109932-250 mg分析對照品，純度>99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司），矮壯素（C114434-250 mg分析對照品，純度>97.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司），丁酰肼（B9）（D105966-250 mg分析對照品，德國Dr.Ehrenstorfer公司），縮節(jié)胺（00812，純度>99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司），甲醇（Fisher色譜純），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2013年在6種藥材的道地藥材產(chǎn)區(qū)，見表1。每種藥材隨機收集5份，每份不少于1 kg，每份藥材全部粉碎后混合均勻后取樣。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱定各對照品5 mg，用乙腈定容至5 mg量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1 g·L^-1的標準儲備液，然后用乙腈稀釋成所需的適當質(zhì)量濃度的混合標準溶液，于棕色試劑瓶中保存。

供試品溶液的制備：精密稱取樣品粉末（過60目篩）2 g，置于具塞離心管中，精密加入含0.1%甲酸的20 mL乙腈提取液，旋渦混勻30 s，超聲 （功率450 W，頻率59 kHz） 30 min，以3 000 r·min^-1離心10 min后，室溫靜置，取上清液。下層殘渣再加入10 mL 乙腈重復提取 1次，合并2次上清液。取上清液，用0.45 μm有機相濾膜過濾后，進樣5 μL，供HPLC-MS-MS分析。

2.2 色譜條件 Waters Atlantis HILIC色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.0 μm），柱溫25 ℃，流速0.4 mL·min^-1，進樣量5 μL，流動相與洗脫條件0.1%甲酸的0.005 mol·L^-1醋酸銨溶液-甲醇-乙腈（13∶15∶72），電離方式：電噴霧（ESI +），噴霧電壓5 000 V，毛細管溫度450 ℃；鞘氣2.06×10⁵Pa；輔助氣15 mL·min^-1，化合物質(zhì)譜采集參數(shù)見表 2，在上述色譜條件下，對照品溶液的色譜圖見圖 1。

2.3 線性關系考察 4種植物延緩劑采用基質(zhì)匹配-外標法定量分析。用空白麥冬樣品提取液配制不同濃度范圍的植物生長調(diào)節(jié)劑混合標準溶液，以濃度為橫坐標（X，μg·kg^-1），定量離子對峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸計算，所得相關系數(shù)均大于0.99，線性關系良好，見表3。以3倍信噪比估算檢出限（LOD），以10倍信噪比對應濃度作為定量限（LOQ），4 種植物生長延緩劑的檢出限在1.5～3.8 μg·kg^-1，定量限在6～15 μg·kg^-1。

2.4 精密度試驗 取一定質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰的面積，計算4種植物延緩劑多效唑，丁酰肼，矮壯素，縮節(jié)胺的峰面積，得RSD分別為1.4%，0.80%，1.4%，1.0%；連續(xù)進樣3 d，每天6次，記錄峰面積，以上4種指標成分日間精密度分別為1.2%，0.70%，1.5 %，1.1%，表明精密度良好。

2.5 重復性試驗 精密稱取麥冬1供試品粉末6份，每份2.0 g，按2.1項方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進行測定。結(jié)果表明：樣品中4種植物延緩劑多效唑，丁酰肼，矮壯素，縮節(jié)胺含量測定的RSD分別為1.3%，1.0%，1.5%，2.0% （n=6）。

2.6 穩(wěn)定性試驗 制備供試品溶液和對照品溶液各一份，于制備完成后的0，2，4，6，8，10 h分別進樣，測定峰面積。4種植物延緩劑（多效唑，丁酰肼，矮壯素，縮節(jié)胺）對照品溶液的RSD分別為1.4%，1.7%，1.1%，0.6% （n=6）。供試品溶液的RSD分別為1.8%，1.5%，1.2%，1.6% （n=6）。結(jié)果表明供試品溶液和對照品溶液在制備后10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加樣回收率試驗 以麥冬、三七、澤瀉、川芎、牛膝、當歸6種中藥材為樣品，對4種植物延緩劑（多效唑，丁酰肼，矮壯素，縮節(jié)胺）進行50，100，200 μg·kg^-13個水平的加樣回收率和精密度實驗。6種中藥材中4種植物生長延緩劑的3個添加水平的回收率為79.3%～103.3%，相對標準偏差（RSD）均不大于11%，具體數(shù)據(jù)見表4。

2.8 樣品含量測定 按2.1項方法分別制備對照品溶液及藥材供試品溶液，按上述色譜條件測定，采用峰面積外標法，計算4種植物延緩劑（多效唑，丁酰肼，矮壯素，縮節(jié)胺）的含量。每批樣品平行2份，每個溶液進樣3次，結(jié)果見表5。典型樣品中4種植物生長延緩劑的MRM圖譜見圖2。

從分析結(jié)果可以看出：這6種中藥材中都檢測出一種或以上的植物生長調(diào)節(jié)劑，這表明植物生長延緩劑被廣泛應用于中藥材生產(chǎn)中。多效唑在麥冬、澤瀉、三七、川芎中有檢出，其中5個麥冬樣品中全部含有多效唑殘留，檢測量為63.4～1 351.6 μg·kg^-1，個別樣品高于水果蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品中有關多效唑的最大殘留限量200（菜籽油）～500（小麥、蘋果、荔枝、稻谷）μg·kg^-1。4個川芎樣品含有多效唑殘留，檢測量為10.0～21.0 μg·kg^-1。麥冬、澤瀉、川芎、當歸中檢測到丁酰肼的殘留，其中2個麥冬樣品中丁酰肼的殘留量為40.4 μg·kg^-1，80.9 μg·kg^-1，4個當歸樣品中殘留的丁酰肼為13.4～20.2 μg·kg^-1，而我國規(guī)定花生種不得檢出丁酰肼。麥冬、澤瀉中檢測到了矮壯素殘留，殘留量為22.9 ～55.7 μg·kg^-1，矮壯素在我國的最大殘留限量為500（棉籽）～5 000（小麥、玉米）μg·kg^-1?？s節(jié)胺只在5個麥冬樣品中有殘留，殘留量為19.1～83.2 μg·kg^-1，目前我國關于縮節(jié)胺的殘留標準無相關規(guī)定，但其殘留量遠遠低于縮節(jié)胺在日本的最大殘留限量2 000 μg·kg^-1。

3 討論

3.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 采用針泵進樣分析化合物的標準溶液（0.1 mg·L^-1），離子源為電噴霧電離源，多反應監(jiān)測模式下對植物生長延緩劑的質(zhì)譜條件進行優(yōu)化。多效唑和丁酰肼進入一級質(zhì)譜后，易產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+分子離子，矮壯素，縮節(jié)胺進入一級質(zhì)譜后，很容易產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+Cl]-分子離子。最終確定多效唑的母離子為m/z 294.5，丁酰肼的的母離子為m/z 161.3，矮壯素的母離子為m/z 122.1，縮節(jié)胺的的母離子為m/z 114.4。

[M+H]+和[M+Cl]-母離子在質(zhì)譜二級裂解時，可發(fā)生重排、斷裂等裂解相關反應，而生成不同質(zhì)量數(shù)的碎片離子。設定質(zhì)譜二級裂解時碎片離子的掃描范圍，從 50 amu 到比母離子大20 amu，監(jiān)測其變化情況。[M+H]+（m/z 294.5）作為多效唑的母離子，產(chǎn)生有顯著豐度的m/z 70.2及m/z 125.3等離子碎片，其中m/z 70.2豐度最高。因此，選擇m/z 294.5→70.2作為定量離子對，其他作為定性離子對。丁酰肼的定量離子對分別為m/z 292.5→70.2，161.3→143.2[M+Cl]-（m/z 122.1）作為矮壯素的母離子，很容易在質(zhì)譜二級裂解時，發(fā)生α斷裂，i 斷裂及氫重排，產(chǎn)生有顯著豐度的m/z 58.2 離子和m/z 63.1 離子碎片，其中m/z 58.2豐度最高。因此，選擇m/z 122.1→58.2 作為定量離子對。這與Ondrej Lacina，張洪霞等的相關報道相一致[18-19]?？s節(jié)胺分子的質(zhì)譜裂解規(guī)律相類似，同理得出[M+Cl]-離子即m/z 114.1為縮節(jié)胺母離子，定量離子為m/z 98.2。具體的裂解圖譜見圖3，4。

3.2 色譜柱的選擇 4 種植物生長延緩劑雖然分子結(jié)構(gòu)相似，如縮節(jié)胺，矮壯素分子結(jié)構(gòu)十分相近，但結(jié)構(gòu)與性質(zhì)差別較大，并且含有不同的元素。原則上MRM模式分離不需要所有峰達到基線分離，但若分離效果差，容易導致離子相互作用，影響定量結(jié)果。因此，選擇色譜柱至關重要。本文分別比較了Waters的Atlantis HILIC（2.1 mm×150 mm，3.0μm），Thermo的Hypersil GOLD aQ（4.6 mm×150 mm，5.0 μm），Agela的Venusil HILIC （2.1 mm×150 mm，3.0 μm），3種色譜柱對4種植物生長延緩劑的分離效果。結(jié)果表明，Atlantis HILIC（2.1 mm×150 mm，3.0 μm）色譜柱對4種植物生長延緩劑的分離效果最好，因此本研究以其作為分離柱。4種植物生長的MRM色譜圖見圖1。

3.3 流動相條件的優(yōu)化 由于流動相的組成和pH直接影響化合物的色譜行為及其質(zhì)譜響應值，所以本文考察比較了不同流動相配比時目標化合物的分離情況。當流動相為水-乙腈（28∶72）時，縮節(jié)胺不能達到基線分離。在HILIC色譜柱中甲醇為較水弱的洗脫溶劑，當流動相中加入15%甲醇時，5種化合物基線分離，但縮節(jié)胺，矮壯素，丁酰肼出現(xiàn)峰拖尾。隨著向流動相中加入乙酸的濃度增大，流動相pH減小，色譜峰拖尾現(xiàn)象改善。因此，最終選擇0.1%甲酸的5 mmol·L^-1醋酸銨溶液-甲醇-乙腈（13∶15∶72）為色譜洗脫條件。

3.4 提取溶劑的選擇 實驗比較了4種植物生長延緩劑加標濃度為100 μg·kg^-1時，不同的提取溶劑對4種植物生長延緩劑的提取效果，每種基質(zhì)每種提取溶劑做3個平行樣，提取效果見表6。結(jié)果表明，4種植物生長調(diào)節(jié)劑在6種不同基質(zhì)中回收率在在85.4%～117.6%，由于乙腈提取可避免樣品基質(zhì)中蠟質(zhì)，脂肪和脂溶性色素的干擾，降低提取液中雜質(zhì)的含量，提高目標物的回收率，所以本實驗選擇乙腈作為提取溶劑[11]。

3.5 藥材中的殘留情況 根據(jù)檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)4種植物生長延緩劑在麥冬中藥材中的殘留最為嚴重，這反映了麥冬種植過程中使用幾種延緩劑的強度很大，其中最嚴重的是多效唑[2]，一年噴灑多次，另外麥冬是連作植物，一個地塊收獲以后，仍舊繼續(xù)種植，土壤中的殘留會繼續(xù)累加作用于植物，因此麥冬亟待建立幾種延緩劑的殘留標準。

從產(chǎn)地調(diào)研不同藥材中使用植物生長延緩劑（俗稱“壯根靈”）的情況看，除了麥冬，使用比較嚴重的還有澤瀉、牛膝，當歸次之，川芎和三七較少[2]，從殘留檢測結(jié)果看，除了麥冬，只有當歸中檢測出丁酰肼，其他幾種延緩劑有檢出，但是殘留量不高，一方面可能使用強度不大，另一方面也可能是本研究的取樣量比較少。當然對于澤瀉來說，雖然使用比較嚴重，但是澤瀉是水生植物，不容易產(chǎn)生殘留。因此，藥材中植物生長延緩劑的殘留問題仍是值得深入研究也需要引起社會的廣泛關注。

3.6 建立藥材殘留標準的建議 中藥材由野生轉(zhuǎn)為種植是保證藥材供應的必要手段，也是中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。本研究組經(jīng)過調(diào)查發(fā)現(xiàn)植物生長延緩劑已經(jīng)成為部分根和根莖類藥材增產(chǎn)的常規(guī)手段，除了本文報道之外[2]，還有白術(shù)、白芍等常用藥材，但植物生長延緩劑對中藥材質(zhì)量的影響復雜，也缺乏相關基礎研究，應禁止單純以增加藥用器官產(chǎn)量為目標的使用，與此同時，為了實現(xiàn)有效的監(jiān)管，有必要對該類成分在中藥材中的殘留導致的安全性進行風險評估，并建立相應的殘留標準。

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[責任編輯 丁廣治]