鏈霉菌CPCC 202950大米發(fā)酵中1個新的苯甲酰胺類化合物

常珊珊+陳明華+王仁中+巫曄翔+董飚+余利巖+高增平+司書毅

[摘要] 采用硅膠柱色譜、凝膠柱色譜、閃式反相C₁₈柱色譜以及反相HPLC等多種色譜技術(shù)和方法，從鏈霉菌CPCC 202950大米發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到8個化合物，借助理化性質(zhì)和波譜學(xué)數(shù)據(jù)分析，鑒定其結(jié)構(gòu)為3-[（3′-氨基-3′-氧丙-1′-烯-2′-基）氧]苯甲酰胺（1），間位-羥基苯甲酰胺 （2），leptosphaepin （3），5-methyluracil （4），feruloylamide （5），對羥基苯乙酰胺 （6），vanillamide （7），環(huán)-（L-纈氨酸-L-丙氨酸）（8）。其中化合物1為1個新的苯甲酰胺類化合物，2為新的天然產(chǎn)物?；衔?～8對HIV-1蛋白酶均沒有明顯的抑制作用，對Hela，HepG2和U2OS 3株腫瘤細胞株也未顯示出明顯的毒性（IC₅₀>10 μmol·L^-1）。

[關(guān)鍵詞] 鏈霉菌CPCC 202950；化學(xué)成分；大米發(fā)酵；HIV-1蛋白酶；苯甲酰胺

[Abstract] Eight compounds were isolated from the rice fermentation of Streptomyces sp. CPCC 202950 by a combination of various chromatographic techniques including column chromatography over silica，Sephadex LH-20，flash C₁₈，and reversed-phase HPLC. Their structures were identified as 3-[（3′-amino-3′-oxoprop-1′-en-2′-yl）oxy]benzamide （1），m-hydroxybenzamide （2），leptosphaepin （3），5-methyluracil （4），feruloylamide （5），p-hydroxyphenylacetoamide （6），vanillamide （7），cyclo （L-val-L-ala） （8）. Among them，1 was a new benzamide analogue，and 2 was a new natural product. In the preliminary assays，none of the compounds 1-8 exhibited obvious inhibition of HIV-1 protease activity，and toxic with the Hela，HepG2，and U2OS cells. （IC50 > 10 μmol·L^-1）.

[Key words] Streptomyces sp. CPCC 202950；chemical constituents；HIV-1 protease inhibitor；rice fermentation；benzamide

放線菌是微生物來源活性物質(zhì)的重要資源之一，目前已知的微生物來源抗生素中，有2/3均是由放線菌產(chǎn)生的[1]。鏈霉菌屬是放線菌中產(chǎn)生抗生素種類和數(shù)量最多的類群，廣泛分布于土壤、海洋、極端環(huán)境及生物體內(nèi)。臨床上大家所熟知的抗生素如鏈霉素、紅霉素、阿霉素、以及四環(huán)素等均來源于鏈霉菌[2-3]。因此，從鏈霉菌中尋找新的藥物先導(dǎo)化合物一直是微生物藥物學(xué)家關(guān)注的重點之一。

本課題組采用高通量熒光底物HIV-1蛋白酶模型對微生物發(fā)酵液提取樣品庫進行篩選，得到一株陽性鏈霉菌CPCC 202950。在前期研究中，本課題組已從該菌株液態(tài)發(fā)酵提取物中分離得到了12個化合物[4-5]，其中包括1個微量、新型具有較強HIV-1蛋白酶抑制活性的五肽類化合物。為進一步探尋該菌株中的次級代謝產(chǎn)物，本論文對該菌株的發(fā)酵條件進行了替換，采取大米固體發(fā)酵，以期獲得更加豐富和新的抗HIV-1蛋白酶活性成分，并對發(fā)酵提取物的乙酸乙酯部位進行了分離純化，得到8個化合物，利用波譜學(xué)技術(shù)分別鑒定為：3-[（3′-氨基-3′-氧丙-1′-烯-2′-基）氧]苯甲酰胺 （1），間位-羥基苯甲酰胺 （2），leptosphaepin （3），5-methyluracil （4），feruloylamide （5），對羥基苯乙酰胺 （6），vanillamide （7），環(huán)-（L-纈氨酸-L-丙氨酸）（8）。其中化合物1為1個新的苯甲酰胺類化合物，2為新的天然產(chǎn)物。

1 材料

1.1 儀器與試劑

1H和13C-NMR譜用Bruker 600 MHz核磁共振儀測定（溶劑峰為內(nèi)標(biāo)）；ESI-MS用Thermo LTQ XL線性離子阱質(zhì)譜儀測定。閃式柱色譜使用利穗中壓色譜儀（蘇州利穗科學(xué)有限公司）。HPLC利用安捷倫1100型液相色譜儀（美國安捷倫公司）。Capcell AQ C₁₈色譜柱（日本資生堂公司）；薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠分廠）。

1.2 菌株

鏈霉菌CPCC 202950 （Streptomyces sp. CPCC 202950）由中國藥學(xué)微生物菌種保藏中心提供，其16S rRNA基因序列經(jīng)比對，其與鏈霉菌S.albospinus NBRC 13846的相似度為99.07%。

2 試驗與結(jié)果

2.1 菌株發(fā)酵 將保藏的鏈霉菌CPCC 202950接種到Y(jié)M斜面，28 ℃恒溫箱培養(yǎng)1周，傳代后同法復(fù)壯1次。將種子斜面挖塊，碾碎接種于3個裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，玉米漿0.4%，黃豆餅粉1%，淀粉2%，碳酸鈣0.4%，二氯化鈷0.000 4 mg·L^-1，調(diào)節(jié)pH 7.2，121 ℃，30 min滅菌）的500 mL錐形瓶中，28 ℃振搖培養(yǎng)48 h后，作為種子液。用無菌水將種子液稀釋成1×10⁶⁰/mL的菌懸液。每個500 mL的三角瓶中放入80 g大米及120 mL蒸餾水，封口、浸泡過夜后在121 ℃，滅菌30 min，冷卻后向每瓶加入10 mL上述菌懸液（共30瓶），并在28 ℃培養(yǎng)30 d。

2.2 分離與純化 鏈霉菌CPCC 202950的大米發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)95%乙醇超聲提取40 min，提取3次，濾液經(jīng)減壓蒸去乙醇得到水混懸溶液，用乙酸乙酯萃取4次，得到水部位和乙酸乙酯部位。將乙酸乙酯部位（15.0 g）經(jīng)硅膠柱色譜，依次用二氯甲烷-甲醇梯度（1∶0，50∶1，40∶1，30∶1，20∶1，15∶1，10∶1，5∶1，1∶1，0∶1）洗脫，經(jīng)薄層色譜檢測，合并相同流分，得到12個洗脫部位（A～L）。E部位（5.8 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇梯度（1∶0，50∶1，35∶1，20∶1，10∶1，5∶1，0∶1） 洗脫，得到E1～E4。E3（4.2 g）經(jīng)硅膠柱色譜，依次用二氯甲烷-甲醇梯度（1∶0，40∶1，25∶1，20∶1，15∶1，10∶1，1∶1，0∶1）洗脫，得到9個洗脫部位。E3-3經(jīng)HPLC半制備（Capcell-Pak C₁₈，10 mm× 250 mm，5 μm，18% CH₃CN，1.5 mL·min^-1）得到5（2.8 mg）和7（3.2 mg）。E3-4經(jīng)反相C₁₈閃式柱色譜分離，甲醇-水梯度（5%～100%，120 min）洗脫，得7個洗脫部位。E3-4-3經(jīng)HPLC半制備（Capcell-Pak C₁₈，10 mm×250 mm，5 μm，14% CH₃CN，1.5 mL·min^-1）得到8（3.1 mg）。E3-6經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱分離，甲醇等度洗脫，得5個洗脫部位。E3-6-5經(jīng)HPLC半制備（Capcell-Pak C₁₈，10 mm×250 mm，5 μm，15% CH₃CN，1.5 mL·min^-1）得到2（3.8 mg），4（2.5 mg）和6（2.3 mg）。E4（2.8 g） 經(jīng)硅膠柱色譜，依次用二氯甲烷-甲醇梯度（1∶0，40∶1，30∶1，20∶1，10∶1，5∶1，0∶1）洗脫，得到7個洗脫部位。E4-6經(jīng)反相C₁₈閃式柱色譜分離，甲醇-水梯度（5%～60%，80 min；60%～100%，40 min）洗脫，得6個洗脫部位。E4-6-1經(jīng)HPLC半制備（Capcell-Pak C₁₈，10 mm×250 mm，5 μm，3% CH₃CN，1.5 mL·min^-1）得到3（2.1 mg）。E4-6-3經(jīng)HPLC半制備（Capcell-Pak C₁₈，10 mm×250 mm，5 μm，15% CH₃CN，1.5 mL·min^-1）得到1（3.3 mg）。

2.3 活性測定 熒光底物HIV-1蛋白酶模型測定化合物對HIV-1蛋白酶抑制活性見參考文獻[5]，細胞毒活性測定見參考文獻[6]。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色無定型粉末，ESI-MS得到準(zhǔn)分子離子峰 m/z 207 [M+H]+，HR-ESI-MS m/z 207.075 9 [M+H]+提示其分子組成為C₁₀H₁₀N₂O₃（計算值 C₁₀H₁₁N₂O₃，207.076 4），不飽和度為7?；衔?的1H-NMR譜顯示1個間位二取代的苯環(huán)[δH 7.56（1H，dd，J=1.8，1.8 Hz，H-2），7.22（1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-4），7.49（1H，dd，J=8.4，7.8 Hz，H-5），7.67（1H，d，J=7.8 Hz，H-6）]，1個末端雙鍵[δH 5.48（1H，d，J=1.8 Hz，H-1′a），4.61（1H，d，J=1.8 Hz，H-1′b）]的質(zhì)子共振信號；另外還有4個活潑質(zhì)子[δH 7.43（1H，br s，NH-7a），8.01（1H，br s，NH-7b），7.50（1H，br s，NH-3′a），7.78（1H，d，J=br s，NH-3′b）]的共振信號。在13C-NMR譜和DEPT譜中，除了與上述基團相對應(yīng)的碳信號之外，還有2個羰基共振信號[δC 163.1（C-3′），166.9（C-7）]。為了準(zhǔn)確確定該化合物結(jié)構(gòu)，進行了2D NMR實驗。通過HSQC和1H-1H COSY譜解析，對該化合物NMR譜中1H以及相應(yīng)的13C共振信號進行了準(zhǔn)確歸屬（表1）?；衔? 的1H-1H COSY譜顯示H-4/H-5/H-6鄰位質(zhì)子偶合的相關(guān)信號；HMBC譜中顯示H-2與C-3、C-6、C-7，H-4與C-2、C-3、C-6，H-5與C-1、C-3、C-4、C-6，H-6與C-2、C-4、C-5、C-7，以及NH₂-7與C-1和C-7的HMBC信號，結(jié)合這些質(zhì)子和碳共振信號的化學(xué)位移，推斷化合物1中有1個3-氧取代的苯甲酰胺單元。同時，HMBC譜顯示H₂-1′與C-2′和C-3′，NH₂-3″與C-2″和C-3″的相關(guān)信號，這些信號及其它們的化學(xué)位移，表明化合物1中含有1個2-氧取代的丙烯酰胺單元（圖1）。結(jié)合該化合物的分子組成，上述的3-氧取代的苯甲酰胺和2-氧取代的丙烯酰胺這2個單元之間只能是通過1個氧原子相連，從而確定化合物1的結(jié)構(gòu)為3-[（3′-氨基-3′-氧丙-1′-烯-2′-基）氧]苯甲酰胺{3-[（3′-amino-3′-oxoprop-1′-en-2′-yl）oxy]benzamide}。

化合物2 白色無定型粉末，ESI-MS m/z 138 [M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz） δ： 6.88（1H，dd，J=7.8，1.8 Hz，H-4），7.20（1H，dd，J=7.8，7.2 Hz，H-5），7.23（1H，dd，J=1.8，1.8 Hz，H-2），7.27（1H，dd，J=7.2，1.8 Hz，H-6）；13C-NMR （DMSO-d6，150 MHz） δ： 114.5（C-2），118.0（C-4），118.0（C-6），129.1（C-5），135.8（C-1），157.2（C-3），167.9（C-7）。上述數(shù)據(jù)與文獻[7]對比，且經(jīng)過二維核磁共振（2D-NMR）實驗的確證，故鑒定化合物2為間位-羥基苯甲酰胺（m-hydroxybenzamide），該化合物為1個新的天然產(chǎn)物。

化合物3 白色無定型粉末，ESI-MS m/z 202 [M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz） δ： 10.02（1H，s，NH），7.43（1H，d，J=3.0 Hz，H-3），5.11（1H，dd，J=10.2，3.0 Hz，H-4），3.69（1H，m，H-5），3.45（1H，dd，J=11.4，5.4 Hz，H-6a），3.42（1H，dd，J=11.4，6.6 Hz，H-6b），2.05（1H，s，H₃-8）；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz） δ： 23.0（C-8），62.6（C-6），71.4（C-5），81.5（C-4），126.5 （C-3），127.5（C-2），169.0（C-7），169.6（C-1）。上述數(shù)據(jù)與文獻[8]對比，且經(jīng)過二維核磁共振（2D-NMR）實驗的確證，故鑒定化合物3為leptosphaepin。

化合物4 白色無定型粉末，ESI-MS m/z 127 [M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz） δ： 10.98（1H，s，NH-3），10.57（1H，s，NH-1），7.23（1H，d，J=5.4 Hz，H-6），1.71（3H，s，H-7）；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz） δ： 164.9（C-4），151.5 （C-2），137.7（C-6），107.6（C-5），11.8（C-7）。上述數(shù)據(jù)與文獻[9]對比，故鑒定化合物4為5-methyluracil。

化合物5 白色無定型粉末，ESI-MS m/z 194 [M+H]+。1H-NMR（acetone-d6，600 MHz） δ： 7.47（1H，d，J=15.6 Hz，H-7），7.20（1H，d，J=1.8 Hz，H-2），7.08（1H，dd，J=8.4，1.8 Hz，H-6），6.86（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），6.59（1H，d，J=15.6 Hz，H-8），3.91（3H，s，4-OMe）；13C-NMR（acetone-d6，150 MHz） δ： 168.0（C-9），149.1（C-3），148.5 （C-4），141.4（C-7），128.1（C-1），122.7（C-6），116.0（C-5），111.3（C-2），56.2（C-3-OMe）。上述數(shù)據(jù)與文獻[10]對比，故鑒定化合物5為feruloylamide。

化合物6 白色無定型粉末，ESI-MS m/z 152 [M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz） δ： 9.19（1H，br s，OH），7.32（1H，br s，NHa），7.02（2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6），6.76（1H，br s，NHb），6.66（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5），3.21（2H，s，H-7）；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz） δ： 172.8（C-8），155.8（C-4），129.9（C-2，6），126.6（C-1），114.9（C-3，5），41.4（C-7）。上述數(shù)據(jù)與文獻[11]對比，故鑒定化合物6為對羥基苯乙酰胺。

化合物7 白色無定型粉末，ESI-MS m/z 168 [M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz） δ： 9.50（1H，br s），7.74（1H，br s，NHb），7.43（1H，d，J=1.8 Hz，H-2），7.35（1H，dd，J= 1.8，7.8 Hz，H-6），7.08（1H，br s，NHa），6.77（1H，d，J=7.8 Hz，H-5），3.79（3H，s，OMe）。上述數(shù)據(jù)與文獻[5]對比，故鑒定化合物7為vanillamide。

化合物8 白色無定型粉末，ESI-MS m/z 171 [M+H]+。1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz） δ： 8.12（1H，br s，NH-1），7.99（1H，br s，NH-4），3.88（1H，m，H-6），3.68（1H，m，H-3），2.16（1H，m，H-7），1.28（3H，d，J=7.2 Hz，H-6），0.95（3H，d，J=7.2 Hz，H-8），0.84（3H，d，J=7.2 Hz，H-9）；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz） δ： 168.7（C-5），166.6（C-2），59.3（C-3），49.6（C-6），31.0（C-7），20.0（C-10），18.5（C-8），16.8（C-9）。上述數(shù)據(jù)與文獻[9]對比，故鑒定化合物8為環(huán)-（L-纈氨酸-L-丙氨酸）。

4 HIV-1蛋白酶活性抑制測試及細胞毒活性測試

當(dāng)化合物1～8為10 μmol·L^-1時，在 HIV-1蛋白酶模型上沒有顯示出明顯的抑制作用，以及對腫瘤細胞株HeLa，HepG2，U2OS均沒有細胞毒作用，IC₅₀>10 μmol·L^-1。

5 小結(jié)與討論

本文采用大米固體培養(yǎng)基對前期在液態(tài)發(fā)酵中產(chǎn)生新HIV-1蛋白酶抑制劑的菌株鏈霉菌CPCC 202950[4-5]進行了發(fā)酵，并從中分離鑒定了8個化合物，發(fā)現(xiàn)1個新的苯甲酰胺類化合物（1）以及1個新的天然產(chǎn)物（2）。比較大米和液態(tài)這2種不同培養(yǎng)條件下的次級代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)除了化合物7（vanillamide），這2種培養(yǎng)基條件下的次級代謝產(chǎn)物并未重復(fù)產(chǎn)生。結(jié)合本課題組前期對鏈霉菌CPCC 203909也在這2種發(fā)酵條件下次級代謝產(chǎn)物的研究比較，發(fā)現(xiàn)鏈霉菌CPCC 203909在大米固體培養(yǎng)基條件下能產(chǎn)生更多新的曲古柳菌素類似物[6，12-16]。大米固體培養(yǎng)基一般在研究真菌的次級代謝產(chǎn)物中作為1種常規(guī)培養(yǎng)基使用，但是在研究鏈霉菌的化學(xué)成分時卻很少作為發(fā)酵條件。而通過對2鏈霉菌株CPCC 203909和202950的研究，發(fā)現(xiàn)在大米培養(yǎng)基條件下也能產(chǎn)生比較豐富的次級代謝產(chǎn)物。因此，大米也可以被考慮作為一種能豐富鏈霉菌化學(xué)成分種類的固體培養(yǎng)基加以充分利用，期望能從其培養(yǎng)條件下的鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)更多的活性天然產(chǎn)物，為新藥創(chuàng)制提供更多的先導(dǎo)化合物。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]