壇紫菜多糖提取工藝的優(yōu)化及抗氧化研究

壇紫菜多糖提取工藝的優(yōu)化及抗氧化研究

楊欣然1，張海紅2，王 樹2，王 斌3，盧 欣3,曹夢云3，張 澤3

(1.河北北方學(xué)院藥學(xué)系2014級，河北 張家口 075000;2.河北北方學(xué)院藥學(xué)系，河北 張家口 075000；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院檢驗科，北京 100700)

壇紫菜主要在我國的南方海域大面積栽培[1]，紫菜富含多糖成分，多糖具有降血脂、抗腫瘤等多種生物活性[2-4]。目前普遍采用超聲波輔助技術(shù)[5]、雙水相萃取法[6]、微波輔助提取技術(shù)[7]或酶輔助提取技術(shù)[8]提取多糖，這些提取方法所用時間較短、操作簡單、提取多糖得率較高，但需要特殊儀器，成本較高。傳統(tǒng)的多糖水提醇沉法具有流程簡單，所用儀器簡單的特點。我們在提取溫度、提取時間、料液比三個因素進(jìn)行單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用水提醇沉法進(jìn)行了三個因素三個水平的正交實驗，優(yōu)化了壇紫菜多糖的提取工藝條件，并測定了壇紫菜多糖對DPPH·的清除能力。

1 儀器與試藥

干壇紫菜(市售，產(chǎn)地：福建連江)；福林酚試劑和二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)(購自Sigma公司)；

HH-WO-5數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市金南儀器制造有限公司)；SHZ-D(III)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；LabTech UV紫外/可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)；BSA223S電子天平。

2 方法與結(jié)果

2.1 壇紫菜的預(yù)處理

干燥壇紫菜撕成碎片，蒸餾水清洗至無雜質(zhì)，無水乙醇浸泡壇紫菜碎片，放置12 h，攪拌，重復(fù)此操作一次，以除去壇紫菜中的脂類和色素等物質(zhì)，蒸餾水洗滌1～2次。擠去壇紫菜碎片中水分，自然晾干，備用。

2.2 壇紫菜多糖的提取

稱取5 g預(yù)處理后的壇紫菜碎片，按要求加入一定量的蒸餾水，將燒杯放入水浴鍋中，在一定溫度下，水浴加熱提取一定時間。取出燒杯，放涼，紗布過濾兩次，濾液抽濾2～3次。取一定量的無水乙醇，加入濾液中，使乙醇濃中藥代謝動力學(xué)度達(dá)到80%。放置過夜，得到紫菜多糖(白色半透明絮狀物)。過濾，得到多糖沉淀，自然晾干。

2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

參照文獻(xiàn)[9]，精密稱取干燥至恒重的葡糖糖對照品50 mg，置50 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，得葡萄糖對照溶液，備用。精密量取葡萄糖對照溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于刻度試管中，分別加蒸餾水至4 mL，然后加入1 mL 6%的苯酚溶液，再加入5 mL濃硫酸，迅速搖勻，放置30 min，待試管放涼后進(jìn)行測定。同時，取4 mL蒸餾水加入等量的苯酚和濃硫酸，搖勻，放涼，作為空白對照溶液。在492 nm處測定上述系列濃度葡萄糖溶液的吸收度，以吸收度(A)為縱坐標(biāo)，葡萄糖溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，結(jié)果表明，葡萄糖在20～100 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，曲線方程為A=0.0098C+0.188(R2=0.9992)。

2.4 壇紫菜多糖含量的測定

各提取條件下制得的壇紫菜多糖稱定重量，5 mL蒸餾水溶解多糖沉淀，取1 mL樣品溶液于刻度試管中，照2.3項下方法進(jìn)行吸收度測定，代入葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算各壇紫菜樣品中多糖的含量。

2.5 不同提取條件對壇紫菜中多糖得率的影響

2.5.1 不同料液比對壇紫菜中多糖得率的影響 按照2.2所述的方法，分別稱取5份5 g壇紫菜碎片置燒杯中，分別按料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35加入蒸餾水，80 ℃水浴加熱2 h，比較各料液比提取條件下多糖的得率(見圖2)。

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 料液比對壇紫菜中多糖提取得率的影響

由圖2可以看出當(dāng)料液比為1∶15至1∶25之間時，多糖得率提高較明顯，其原因可能是較多的溶劑量有利于細(xì)胞中多糖成分的溶出。料液比為1∶25至1∶35繼續(xù)升高時，紫菜多糖得率沒有明顯變化，故選取1∶25為多糖提取時的料液比。

2.5.2 不同提取溫度對壇紫菜中多糖得率的影響 按照2.2所述的方法，分別稱取5份5 g壇紫菜碎片置燒杯中，按照料液比為1∶25加入蒸餾水，分別在50、60、70、80、90 ℃的條件下水浴提取2 h，比較各溫度條件下多糖得率(見圖3)。

圖3 提取溫度對壇紫菜中多糖提取得率的影響

由圖3可以看出隨著溫度不斷升高，多糖得率先升高后降低，當(dāng)提取溫度為80 ℃，多糖得率最高。可能是由于高溫容易使植物細(xì)胞破裂，利于紫菜多糖的溶出，從而提高多糖得率，但溫度過高則可能導(dǎo)致紫菜多糖的分解，與此同時高溫使得能源消耗增加，成本升高，所以80 ℃是多糖提取的最適溫度。

2.5.3 不同提取時間對壇紫菜多糖得率的影響 按照2.2所述方法，分別稱取5份5 g壇紫菜碎片置燒杯中，料液比1∶25，80 ℃，分別水浴加熱1、1.5、2、2.5、3 h，比較各提取時間下多糖得率(見圖4)。

圖4 提取時間對壇紫菜中多糖提取得率的影響

由圖4可以看出隨著提取時間延長，多糖得率呈先升高而后略微下降的變化，2.5 h多糖得率最高，可能由于多糖的溶解是一個比較緩慢的過程，需要一定的時間，若提取時間過短，不利于多糖溶解，多糖提取得率低。當(dāng)提取時間大于2.5 h時，多糖得率反而開始逐漸降低，其原因可能是多糖一直處在高溫環(huán)境下可能會出現(xiàn)分解導(dǎo)致，所以2.5 h為適宜提取時間。

2.6 壇紫菜多糖提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，對壇紫菜多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，按照正交實驗設(shè)計L9(33)進(jìn)行實驗(見表1)。按2.2方法進(jìn)行壇紫菜多糖提取，按2.4項方法進(jìn)行多糖含量的測定(見表2)。

表1 因素水平表

表2結(jié)果顯示，料液比為1∶25、提取溫度為80 ℃、提取時間2.5 h為壇紫菜多糖的最優(yōu)提取條件，在該條件下，多糖得率為2.101%。對壇紫菜多糖提取得率影響因素排序依次為A(料液比)>B(提取溫度)>C(提取時間)。

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

2.7 優(yōu)化提取工藝驗證

按照2.2項方法取5份壇紫菜碎片，每份100 g，在料液比為1∶25、提取溫度為80 ℃、提取時間為2.5 h的實驗條件下進(jìn)行多糖成分提取，計算其得率。實驗結(jié)果顯示壇紫菜多糖平均提取得率為2.094%，RSD為2.8%，說明該提取工藝穩(wěn)定可行，適合壇紫菜多糖的大量提取。

2.8 壇紫菜多糖清除DPPH·能力測定

采用優(yōu)化的條件提取制備壇紫菜多糖，然后將其稀釋成濃度為0.15，0.2，0.4，0.6，0.8和1 mg·mL-1的系列溶液，參照文獻(xiàn)[10]測定壇紫菜多糖清除DPPH·的能力。2 mL不同濃度的壇紫菜多糖溶液與2 mL的DPPH甲醇溶液(0.2 mmol·L-1)混合、搖勻，在暗處室溫孵育30 min，在517 nm處測定吸收度值A(chǔ)i；用等體積的甲醇代替壇紫菜多糖，測定吸光度值A(chǔ)0；不同濃度的壇紫菜多糖溶液中，用等體積甲醇代替DPPH溶液，測定吸收度Aj。按下式計算壇紫菜多糖對DPPH·清除能力：DPPH清除率(%)=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

壇紫菜多糖實驗濃度0.15～1 mg·mL-1在范圍內(nèi)，對DPPH·的清除率從18.2%增加到38.8%，表明壇紫菜多糖對DPPH·有很好的清除能力，且有一定的濃度依賴性(見圖5)。

3 結(jié) 論

壇紫菜多糖成分最佳提取工藝條件為料液比1∶25、提取溫度80 ℃、提取時間2.5 h，在該條件下壇紫菜多糖得率為2.101%，該提取法操作簡便、穩(wěn)定可行。壇紫菜多糖對DPPH·有很好的清除能力，且有一定的濃度依賴性，提示壇紫菜多糖作為抗氧劑有潛在的應(yīng)用價值。

圖5 不同濃度的壇紫菜多糖溶液對DPPH的清除率

[1]王莉.壇紫菜響應(yīng)失水脅迫的轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜特征分析[D].青島:中國海洋大學(xué),2013.

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[責(zé)任編輯：李薊龍]

河北北方學(xué)院自然科學(xué)研究計劃項目(No.2014013)

楊欣然(1997-)，女，河北邯鄲人，2014級藥學(xué)專業(yè)本科學(xué)生。

指導(dǎo)教師：張海紅(1982-)，女，講師，醫(yī)學(xué)碩士，主要研究方向：中藥代謝動力學(xué)。王樹(1968-)，男，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，主要研究方向：中藥代謝動力學(xué)。

R 284.2

A

10.3969/j.issn.1673-1492.2017.04.003

來稿日期：2016-12-12