基于qPCR和16S rDNA高通量測序研究藍藻暴發(fā)期間太湖竺山灣水體浮游細菌群落

薛銀剛，蔣聰，耿金菊，謝文理，張皓，陳心一

(1. 江蘇省環(huán)境保護水環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室，常州市環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 常州 213001；2. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023)

基于qPCR和16S rDNA高通量測序研究藍藻暴發(fā)期間太湖竺山灣水體浮游細菌群落

薛銀剛1，蔣聰2，耿金菊2，謝文理1，張皓1，陳心一1

(1. 江蘇省環(huán)境保護水環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室，常州市環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 常州 213001；2. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210023)

為了探究浮游細菌和藍藻暴發(fā)之間的關(guān)系，利用實時熒光定量PCR和高通量測序技術(shù)，對夏季藍藻暴發(fā)期間太湖竺山灣表層水和底泥中浮游細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行研究。結(jié)果表明，從門水平來看，水樣和底泥中平均相對豐度最高的為變形菌門，放線菌門次之，此外藍藻門也有一定的比例，可為水華暴發(fā)提供預(yù)警指示；從屬水平來看，水樣中的優(yōu)勢細菌主要為GpXI和GpIIa，底泥中為Gp6和GpIIa。

藍藻暴發(fā)；太湖竺山灣；浮游細菌；高通量測序

2007 年 5 月，太湖暴發(fā)大面積微囊藻水華造成無錫市“5·29 供水危機”，引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注。近年來，國家、省、市等各級政府相繼投入了大量的人力物力，開展了污染減排、生態(tài)清淤、藍藻打撈及其資源化、“引江濟太”調(diào)水引流和“河長制”等一系列措施。盡管目前水體營養(yǎng)鹽指標(biāo)已經(jīng)取得了明顯的改善，但是根據(jù)長期監(jiān)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藍藻水華在太湖竺山灣(以下簡稱“竺山湖”)、梅梁灣等區(qū)域仍然頻繁暴發(fā)。多年來，針對藍藻水華的產(chǎn)生機理，國內(nèi)外學(xué)者已開展了大量研究?，F(xiàn)有成果多集中在藍藻的生長、形成過程、災(zāi)害預(yù)警以及藍藻防治等宏觀領(lǐng)域[1-4]。盡管人們已經(jīng)意識到細菌在湖泊營養(yǎng)鹽的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中起著重要作用[5]，但基于細菌的微觀層面來研究藍藻水華機制方面的報道較少。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基于原核生物核糖體小亞基基因(16S rDNA)的PCR擴增[6]、變性梯度凝膠電泳(DGGE)[7- 8]與末端限制性片段多態(tài)性(T-RFLP)[9]、熒光定量PCR[10]等指紋圖譜分析、克隆文庫分析等技術(shù)方法已被廣泛應(yīng)用于湖泊學(xué)的相關(guān)研究中[11- 12]。近年來，高通量測序技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能代謝通路的挖掘中顯示出巨大的應(yīng)用潛力[13-15]，為探索藍藻水華與水體微生物之間的相互作用機制提供了新的手段和思路。

現(xiàn)基于實時熒光定量PCR和16S rDNA高通量測序技術(shù)，研究夏季藍藻暴發(fā)期間竺山湖表層水體和底泥中微生物細菌群落結(jié)構(gòu)，豐富淺水湖泊富營養(yǎng)化微生物學(xué)的認(rèn)識，為揭示富營養(yǎng)化水體中細菌生態(tài)功能和水華暴發(fā)的預(yù)警預(yù)測提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA提取

1.1.1 樣品來源

樣品采集自2015年7月29日竺山湖水體，分別選擇了表層湖水及底泥各4個采樣點，從北向南依次為：雅浦港(E120.075°，N31.449°)、沙塘港(E120.035°，N31.433°)、竺山湖南(E120.036°，N31.373°)和椒山(E120.076°，N31.340°)。

1.1.2 樣品采集和處理

水樣和底泥樣品分別使用直立式水質(zhì)采樣器和彼得森采樣器進行采集。在運輸過程中，所有的樣品均放置在冷藏箱中保存，并在送到實驗室后立即進行預(yù)處理。采集的水樣用0.22 μm的混合纖維素濾膜過濾，待濾膜完全堵住后，記錄過濾的水樣體積。將采集的底泥樣品放置于50 mL離心管中，在10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心，棄上清液后將過濾后的濾膜和離心后得到的固態(tài)底泥浸沒于50% 的乙醇中，并保存于-20 ℃，用于后續(xù)的分析測試。

1.1.3 樣品DNA提取

使用FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒(MP bio, USA)提取水樣和底泥樣品的DNA。經(jīng)NanoDrop 2000超微量蛋白質(zhì)核酸分析儀(Thermo Fisher, USA)測定提取出的DNA濃度和純度后，將DNA樣品于-20 ℃中保存，用于后續(xù)的PCR擴增等分析。

1.2 16S rDNA定量分析

1.2.1 普通PCR及產(chǎn)物鑒定

使用的PCR反應(yīng)體系溶液為25 μL，包括：2.5 μL 10 × PCR緩沖液，2 μL MgCl2，2 μL dNTP混合劑，上下引物各0.2 μL(20 μmol/L)，0.125 μL Ex Taq DNA 聚合酶，2 μL DNA模板(提取的DNA稀釋至約20 mg/L)及ddH2O。

使用PCR擴增儀進行擴增，反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min后，95 ℃變性15 s，退火溫度58 ℃下反應(yīng)30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃下延伸7 min。研究中對16S rDNA的普通PCR及實時熒光定量PCR分析使用的引物序列為CGAATATGGAATCCCTAGTAACT(正)/ GCCCACTCAGTTCGATACGC(反)[16-17]，擴增片段長度約為140 bp。PCR擴增產(chǎn)物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行電泳測定。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qPCR)

使用AB 7500實時定量PCR儀(Thermo Fisher, USA)進行qPCR反應(yīng)，96孔板反應(yīng)體系為25 μL，包括12.5 μL的2 × Power SYBR?Green PCR Master Mix(Thermo Fisher, USA)，正、反向引物各0.2 μL(20 μmol/L)，2 μL DNA 模板(2×107ng/L)以及10.1 μL的無菌水。熱循環(huán)過程為：預(yù)變性95°C下熱變性 15 min；然后進入45個循環(huán)的擴增階段，包括95 ℃變性 15 s，退火溫度57.5 ℃ 下反應(yīng)30 s，72 ℃延伸30 s。反應(yīng)結(jié)束后會繼續(xù)做相應(yīng)的溶解曲線以便檢驗反應(yīng)過程是否存在非特異性擴增，溶解曲線溫度為60～95 ℃。每個樣品做3個平行，陰性對照以無菌水代替DNA模板。實驗的擴增效率為90%～100%，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2>0.99。

1.3 16S rDNA基因高通量測序

1.3.1 PCR擴增

提前將DNA樣品稀釋至20 mg/L進行PCR擴增，每個樣品做4組平行樣。16S rRNA基因高通量測序選用V1—V2保守區(qū)的引物進行PCR擴增，引物序列(5’-3’)如下：正向引物27F(AGAGTTTGATYMTGGCTCAG)，反向引物338R(TGCTGCCTCCCGTAGGAGT)。PCR擴增體系為50 μL，包含Ex Taq DNA 0.25 μL，10 × Ex Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl24 μL，dNTP 4 μL，正向引物和反向引物各1 μL，DNA模板2 μL，超純水32.75 μL。PCR擴增過程為：98 ℃預(yù)變性5 min后，98 ℃變性30 s，退火溫度50°C下反應(yīng)30 s，72 ℃延伸40 s，共20個循環(huán)，后72 ℃下延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳進行檢測。

1.3.2 擴增產(chǎn)物純化

將PCR擴增后的4個平行樣混合，用E.Z.N.A.TM Cylcle-Pure試劑盒(Omega Bio-tec Inc., USA)進行純化。純化后的產(chǎn)物用超微量核酸蛋白分析儀測定濃度和純度。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Illumina Miseq平臺(USA)進行高通量測序。測序結(jié)果使用Sickle和Mothur程序進行降噪處理后，為了在同一測序深度上公平地比較所有樣品，以條序列最少的樣品為基準(zhǔn)，使用Mothur軟件(1.32.1版)的“Sub.sample”命令從其他樣品中隨機抽取相同的條序列，進行測序深度的統(tǒng)一。每個樣品在相同的測序深度下在Ribosomal Database Project Classifier(2.6版)處理平臺上進行系統(tǒng)分類和注釋。處理后的數(shù)據(jù)使用Origin(9.0版)繪圖，使用R語言程序(3.1.0版)繪制熱圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 竺山湖水體水樣和底泥不同點位16S rDNA豐度比較

竺山湖水體各采樣點的水樣及泥樣中16S rDNA的豐度如圖1所示。由圖1可以看出，4個采樣點中，底泥中的16S rDNA豐度范圍為109～1011copies/g，遠遠高于水體中的浮游微生物量107～108copies/mL，說明底泥中微生物量較為豐富。底泥樣品中，又以沙塘港和椒山2個采樣點豐度最高，分別為9.54 × 1010和9.59 × 1010copies/g，竺山湖南的底泥樣品中16S rDNA豐度相對于其他采樣點稍低，約為4.13 × 109copies/g。水樣樣品中，除沙塘港豐度稍高，為 1.23 × 108copies/mL外，其余3個采樣點的豐度相差不大，分別為 7.74 × 107，4.84 × 107和 3.78 × 107copies/mL。

圖1 各采樣點水樣和底泥樣品16S rDNA豐度

2.2 竺山湖水體細菌群落結(jié)構(gòu)

水樣和底泥在門水平的優(yōu)勢細菌分布見圖2所示。由圖2可知，底泥和水樣中相對豐度最高的細菌為變形菌(Proteobacteria)，約占總細菌的29.09%～71.80%，其中水樣中變形菌門的平均豐度占43.63%，底泥中占41.88%，最高豐度為沙塘港的水樣，變形菌占比達71.80%。相對豐度較高的細菌其次為放線菌(Actinobacteria)，水樣中平均相對豐度為19.52%，底泥樣品中為9.58%。再次為擬桿菌(Bacteroidetes)，水樣中平均相對豐度為14.03%，而底泥樣品中含量其次的是酸桿菌(Acidobacteria)，占比為5.29%。眾多研究表明，放線菌、變形菌和擬桿菌是湖泊生態(tài)系統(tǒng)中常見的優(yōu)勢菌[7-8, 12-13]。

圖2 各采樣點水樣和底泥門水平優(yōu)勢細菌分布

太湖底泥和水樣樣品中藍藻細菌(Cyanobacteria)占比較高，水樣中平均相對豐度約占6.92%，底泥樣品中相對較少，占比約為2.16%，其屬于藍細菌中的一類，而富營養(yǎng)化淡水中的水華與藍細菌的急劇生長有著密切關(guān)系[15]，該類細菌的出現(xiàn)具有一定指示作用。另外，在底泥樣品中擬桿菌和厚壁菌(Firmicutes)也有較高豐度，平均占比均為4.51%。與硝化作用相關(guān)的硝化螺菌(Nitrospira)平均相對豐度為1.66%。

進一步對相對豐度最高的變形菌門進行分類，得到各變形菌綱的組成，結(jié)果見圖3。由圖3可知，水樣和底泥樣品中各變形菌綱分布趨勢相近，平均相對豐度由高到低依次為：β-變形菌(Betaproteobacteria, 15.94%)、γ-變形菌(Gammaproteobacteria, 8.22%)、α-變形菌(Alphaproteobacteria, 6.47%)、δ-變形菌(Deltaproteobacteria, 6.22%)和ε-變形菌(Epsilonproteobacteria, 0.01%)，除在竺山湖南采樣點存在ε-變形菌(0.07%)外，其他3個采樣點的水樣與泥樣中均不含有ε-變形菌。β-變形菌是好氧或兼性細菌，既包括許多異養(yǎng)型屬也包含某些自養(yǎng)型屬(如可以氧化氨的亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas)，是常見的優(yōu)勢變形菌[8, 14]。吳鑫等[8]研究表明，γ-變形菌是嚴(yán)重營養(yǎng)化的湖泊所具有的一個特征性種群結(jié)構(gòu)。

圖3 各采樣點水樣和底泥樣品變形菌分布

從屬水平來看，水樣中的優(yōu)勢細菌主要為：GpXI(未分類Unclassified屬)(其中椒山水樣中占比最高為7.22%，其余水樣中占比約>1%)，GpIIa(未分類Unclassified屬)(椒山水樣中占比約4.11%，竺山湖南中占比均>2.25%)，假單胞菌屬(Pseudomonas)在沙塘港中占比高達18.51%，但在其他3個采樣點的占比<1%(圖4)。由圖4可見，椒山與沙塘港2個點位水樣中的微生物在屬水平上的結(jié)果更接近，而竺山湖南與雅浦港更為類似。

底泥樣品中的優(yōu)勢細菌主要為：酸桿菌門Gp6酸桿菌綱(Acidobacteria_Gp6)(竺山湖南中占比最高約為2.14%，其余底泥樣品中占比也均>1%)，GpIIa(椒山中占比最高約為1.50%，沙塘港與雅浦港中占比均約1%)，硝化螺菌(椒山與竺山湖南底泥中占比也較高，分別約占3.79%和1.82%)，鏈球菌屬(Streptococcus)在椒山和雅浦港底泥樣品中占比均>1%，而在沙塘港和竺山湖南底泥樣品中占比均<1%(圖5)。

由圖5可見，4個點位泥樣中的微生物在屬水平上的結(jié)果與水樣存在差異，總體上可以分成兩類。沙塘港和雅浦港較為接近，竺山湖南與椒山的結(jié)果最為相近，可能是因為這2個點位都處于竺山湖南面的湖心區(qū)，而沙塘港和雅浦港處于竺山湖北側(cè)的河口區(qū)。底泥和水樣出現(xiàn)差異的主要原因可能是底泥的流動性相比水樣更為穩(wěn)定，受風(fēng)浪等擾動較小。因此，相同湖區(qū)底泥中的微生物在屬水平上較為接近。

圖4 各采樣點水樣屬水平優(yōu)勢細菌分布熱圖(相對豐度>0.1%)

圖5 各采樣點底泥樣品屬水平優(yōu)勢細菌分布熱圖(相對豐度>0.1%)

3 結(jié)論

以大型淺水富營養(yǎng)化湖泊——太湖為研究對象，基于實時熒光定量PCR和高通量測序技術(shù)，重點研究了竺山湖在夏季藍藻暴發(fā)期間表層水和底泥樣品中的浮游細菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性。從門水平來看，夏季表層水中優(yōu)勢門類由高到低依次為變形菌門>放線菌門>擬桿菌門>藍藻門，底泥中依次為變形菌門>放線菌門>酸桿菌門>藍藻門；從屬水平來看，水樣中的優(yōu)勢細菌主要為GpXI和GpIIa，底泥中為Gp6和GpIIa。本文只針對夏季竺山湖進行研究，今后可以選擇太湖多種類型湖區(qū)的多個點位，通過長期監(jiān)測，確立水華暴發(fā)不同階段的浮游細菌優(yōu)勢群落譜庫，為水華暴發(fā)提供預(yù)測預(yù)警。同時，進一步研究浮游細菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系，明確浮游細菌群落與環(huán)境主導(dǎo)因子的生態(tài)耦合關(guān)系[13, 15]。

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欄目編輯 周立平

Profiles of Bacterioplankton Based on qPCR and 16S rDNA High-throughput Sequencing during a Heavy Cyanobacterial Bloom in Zhushan Bay, Taihu Lake

XUE Yin-gang1, JIANG Cong2, GENG Jin-ju2, XIE Wen-li1, ZHANG Hao1, CHEN Xin-yi1

(1.KeyLaboratoryofEnvironmentalProtectionofWaterEnvironmentBiologicalMonitoringofJiangsuProvince,ChangzhouEnvironmentalMonitoringCenter,Changzhou,Jiangsu213001,China; 2.StateKeyLaboratoryofPollutionControlandResourcesReuse,SchoolofEnvironment,NanjingUniversity,Nanjing,Jiangsu210023,China)

In order to explore the relationships between the planktonic bacteria and algae bloom, planktonic bacteria community structure and diversity of surface water and sediment in Zhushan Bay, Taihu Lake were studied using qPCR and 16S rDNA high-throughput sequencing during a heavy cyanobacterial bloom. The results showed that:Proteobacteriawas the predominant bacterial phyla, followed byActinobacteriain water and sediment. In addition,Cyanobacteriahad a certain proportion which can provide early warning indicator for algae bloom. At the level of genera, the predominant bacteria in the water were mainlyGpXIandGpIIa, whereasGp6 andGpIIain sediment.

Algae blooms; Zhushan Bay, Taihu Lake; Planktonic bacterial; High-throughput sequencing

10.3969/j.issn.1674-6732.2017.03.004

2017-03-17；

2017-03-29

江蘇省環(huán)境監(jiān)測科研基金資助項目(1404、1320)

薛銀剛(1981—)，男，高級工程師，博士，主要從事生態(tài)毒理學(xué)和生物監(jiān)測工作。

X832

B

1674-6732(2017)03-0019-05