大麥莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)和植株高頻再生

胡有良，汪軍成，司二靜，任盼榮，姚立蓉，李葆春，馬小樂(lè)，孟亞雄，王化俊

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

大麥莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)和植株高頻再生

胡有良1,2，汪軍成1,2，司二靜1,2，任盼榮1,2，姚立蓉1,2，李葆春1,3，馬小樂(lè)1,2，孟亞雄1,2，王化俊1,2

(1.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070； 3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

為明確大麥莖尖高頻再生培養(yǎng)體系的影響因素，以大麥品種甘啤3號(hào)、甘啤4號(hào)和甘啤6號(hào)為材料，研究穎殼去除方法、滅菌處理方式、無(wú)菌苗的苗齡、莖尖切段的大小和位置以及外源激素(2，4-D)濃度對(duì)大麥莖尖愈傷組織培養(yǎng)和植株高頻再生的影響。結(jié)果表明，大麥種子穎殼去除的最佳方法是將種子浸泡在30%的硫酸中，并置于水平搖床30 ℃、180 r·min-1搖動(dòng)1 h；同時(shí)發(fā)現(xiàn)參試品種中甘啤4號(hào)發(fā)芽率最高；75%的乙醇1.5 min + 2% 的NaClO 15 min的滅菌處理效果最好，其帶菌率和發(fā)芽率與其他處理有顯著差異，并且對(duì)種子傷害較小，幼苗整齊度較好，有利于無(wú)菌苗的培養(yǎng)；莖尖外植體愈傷組織的形成和植株再生頻率與莖尖切段的位置和苗齡密切相關(guān)，3 d苗齡、莖尖基部2 mm處的切段效果最好；3 mg·L-12，4-D適宜愈傷組織的離體培養(yǎng)，在出愈率和植株再生率上差異顯著，可以誘導(dǎo)出大量愈傷組織。

大麥；莖尖外植體；帶菌率；出愈率；植株再生率

大麥(HordeumvulgareL.)是禾本科大麥屬的一年生或越年生作物，用途比較廣泛，可食用、飼用，也是制造啤酒的重要原料[1]。隨著生物技術(shù)研究的進(jìn)步，大麥組織培養(yǎng)技術(shù)日趨完善，為大麥轉(zhuǎn)基因研究提供了可利用的受體材料。大麥不同部位的外植體材料已被嘗試用于建立高效的再生體系，主要有花藥[2]、幼穗[3]、幼葉[4]、幼胚[5-7]、成熟胚[8-9]、分生組織[10]、莖尖[11]、根尖[12]及葉基[13-15]等。在大麥體細(xì)胞培養(yǎng)中，成熟胚和幼胚是最常用的外植體。成熟胚具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性，但其誘導(dǎo)能力差，分化能力低下；而以幼胚及其胚性愈傷組織作為外植體轉(zhuǎn)化分化周期較長(zhǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中容易造成體細(xì)胞無(wú)性系變異，而且分化及轉(zhuǎn)化效率受基因型限制很大。因此尋找一種受基因型和季節(jié)限制小、快速、簡(jiǎn)單、高效的大麥再生體系對(duì)大麥組織培養(yǎng)以及大麥轉(zhuǎn)基因研究具有重要意義。通過(guò)植物莖尖先誘導(dǎo)愈傷組織，再誘導(dǎo)再生植株已有許多報(bào)道，如小麥[16-17]、珍珠黍[18]、早熟禾[19]、大豆[20]、黑麥草[21]、水稻[22]等。莖尖外植體的來(lái)源廣泛，不受季節(jié)、基因型限制，而且周期很短。Polumahanthi等[23]研究了高粱莖尖外植體的高效再生；陳 莉等[24]研究了玉米莖尖再生體系的建立。關(guān)于大麥莖尖離體培養(yǎng)已有報(bào)道，但目前尚缺乏針對(duì)大麥莖尖外植體高效再生的系統(tǒng)研究。

大麥種子被穎殼包裹且穎殼很難去除。在培養(yǎng)無(wú)菌苗時(shí)如果不去除穎殼，種子滅菌不徹底，接種時(shí)很容易污染。目前，試驗(yàn)中常采用人工去除大麥穎殼[25]，但人工去殼速度較慢，胚破損多，不能滿足大量試驗(yàn)的需求，且還有一定的污染，因此研究一種快速、大量且破損較小的去殼方法至關(guān)重要。

生長(zhǎng)素(2，4-D)在禾本科植物中愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)中具有重要作用，在大麥愈傷組織培養(yǎng)中2，4-D更是一個(gè)關(guān)鍵因素。Bregitzer 等[26]報(bào)道，在大麥中綠色植株的再生和2，4-D的濃度成正相關(guān)。Sahrawat等[27]在大麥胚芽鞘再生體系中研究表明，在MSB體系中添加11.3 μmol·L-12，4-D能高頻誘導(dǎo)出愈傷組織。Pasternak等[28]在大麥葉基高頻再生中利用2 mg·L-1的2，4-D成功誘導(dǎo)出愈傷組織。但關(guān)于大麥莖尖愈傷組織誘導(dǎo)方面2，4-D的最適濃度尚未見研究報(bào)道。

本研究以大麥栽培品種甘啤3號(hào)、甘啤4號(hào)、甘啤6號(hào)種子為材料，探討大麥種子穎殼去除的不同方法對(duì)幼苗的污染和對(duì)種子發(fā)芽情況的影響，并以篩選出的發(fā)芽率較好的種子(甘啤4號(hào))為材料，研究不同滅菌方式、苗齡、莖尖外植體不同切段和部位以及外源激素(2，4-D)濃度對(duì)大麥莖尖愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的影響，旨在建立大麥莖尖高頻再生體系，為大麥的遺傳轉(zhuǎn)化提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用大麥品種為甘啤3號(hào)、甘啤4號(hào)、甘啤6號(hào)，均由麥類實(shí)驗(yàn)室(甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)提供。

1.2 培養(yǎng)基

莖尖愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基:MS+瓊脂(0.7%)+麥芽糖(3%)+2，4-D(3 mg·L-1)+水解酪蛋白(0.5 g·L-1)+脯氨酸(0.5 g·L-1)

愈傷組織繼代培養(yǎng)基:MS+瓊脂(0.7%)+麥芽糖(3%)+2，4-D(1.5 mg·L-1)+水解酪蛋白(0.5 g·L-1)+脯氨酸(0.5 g·L-1)+KT(0.2 mg·L-1)

愈傷組織分化培養(yǎng)基:MS+瓊脂(0.4%)+麥芽糖(3%)+6-BA(0.5 mg·L-1)+KT(0.5 mg·L-1)

生根培養(yǎng)基：MS+瓊脂(0.4%)+麥芽糖(3%)+NAA(0.5 mg·L-1)

以上培養(yǎng)基pH均調(diào)至5.8，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3 種子去殼試驗(yàn)

選用當(dāng)年收獲的甘啤3號(hào)、甘啤4號(hào)、甘啤6號(hào)大麥成熟種子，挑選籽粒飽滿、無(wú)發(fā)霉、顏色相近、大小一致的種子分別進(jìn)行以下不同處理：A1(人工去殼)、A2(人工去殼后加入50 mL蒸餾水，在搖床中30 ℃、180 r·min-1下?lián)u動(dòng)1 h)、A3(加入30%的硫酸50 mL，在搖床中30 ℃、180 r·min-1下?lián)u動(dòng)1 h)、A4(種子未去殼)。每個(gè)處理60粒種子，3次重復(fù)。將各處理的種子分別裝入滅菌過(guò)的培養(yǎng)瓶，用75%乙醇浸泡30 s，再用0.1%升汞按常規(guī)方法滅菌，接種于MS培養(yǎng)基[29]，在25 ℃下培養(yǎng) 3 d 后，觀察種子上面有無(wú)細(xì)菌、真菌等長(zhǎng)出，若有則認(rèn)為被污染，記錄被污染種子數(shù)即為菌落數(shù)；同時(shí)觀察種子發(fā)芽情況，記錄發(fā)芽數(shù)。以滅菌種子的平均帶菌率、發(fā)芽率分別表示滅菌和發(fā)芽效果。種子平均帶菌率(%)=被污染種子數(shù)(菌落數(shù))/每處理供試種子數(shù)×100；發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/每處理供試種子數(shù)×100；整齊度(%)=苗高大于或等于2 cm的幼苗數(shù)/每處理供試種子數(shù)×100。下同。

1.4 種子滅菌試驗(yàn)

供試大麥品種為1.3節(jié)中篩選出的發(fā)芽率較好的品種(甘啤4號(hào))。挑選該大麥品種的種子2 160粒，通過(guò)30%的硫酸去殼后，用無(wú)菌蒸餾水沖洗5～7次，洗去多余的硫酸，再用75%酒精滅菌處理一定的時(shí)間，緊接著用相應(yīng)滅菌劑處理15 min，滅菌后的種子接種于MS培養(yǎng)基，在25 ℃、光照時(shí)間16 h·d-1、3 000 lx光照下培養(yǎng)3 d，記錄菌落數(shù)、發(fā)芽數(shù)以及苗高≥2 cm的幼苗數(shù)，以滅菌種子的平均帶菌率和發(fā)芽率、整齊度分別表示滅菌和發(fā)芽效果。本試驗(yàn)為二因子試驗(yàn)，因子1為滅菌劑使用前先用 75%乙醇浸泡一定時(shí)間，處理時(shí)間設(shè)6個(gè)水平，依次為0、0.5、1、1.5、2、3 min(依次編號(hào)為C1、C2、C3、C4、C5、C6)。因子2為滅菌劑處理，即在75%乙醇浸泡一定時(shí)間后，再分別用三種滅菌劑進(jìn)行滅菌，三種滅菌劑依次編號(hào)為B1(10%H2O2)、B2(2%有效氯的NaClO)、B3(1%升汞)，滅菌劑處理時(shí)間均為15 min，總共18個(gè)處理組合(表1)，每個(gè)組合3次重復(fù)，每重復(fù)40粒。

1.5 莖尖外植體準(zhǔn)備

將已滅菌處理的甘啤4號(hào)種子接種于MS基本培養(yǎng)基，25 ℃下光照培養(yǎng)3 d后，選取健壯苗(苗的高度為2 cm左右)分別進(jìn)行以下處理:(1)剝離胚芽鞘及2片左右的幼葉，切下包含莖尖分生組織和葉原基在內(nèi)的長(zhǎng)約2 mm的莖尖，命名為ST00；(2)自幼苗基部去掉種子和根，由基部向上依次切取長(zhǎng)約2 mm左右的莖尖切段6段(編號(hào)依次為ST0、ST1、ST2、ST3、ST4、ST5)，ST0切段包括胚芽鞘基部、第1、2真葉葉基和莖尖分生組織。共7個(gè)處理，每一處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)包括60個(gè)莖尖外植體。

1.6 莖尖外植體愈傷組織誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)及植株再生

將以上切段置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基， 25 ±1 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。接種后隨時(shí)觀察愈傷組織生長(zhǎng)狀況，14 d后統(tǒng)計(jì)出愈率。接種7 d左右，初始愈傷組織形成，其結(jié)構(gòu)松散、呈水漬狀、且顏色發(fā)白。初始愈傷組織經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)，便會(huì)形成具有再生能力的胚性愈傷組織。分別選取繼代后不同切段產(chǎn)生的乳黃、顏色鮮亮、致密的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上于3 000 lx光照下培養(yǎng)，光照時(shí)間為16 h·d-1。分化培養(yǎng)后隨時(shí)觀察愈傷組織出現(xiàn)綠點(diǎn)的情況，每14 d進(jìn)行繼代，繼代2次后將分化出的小苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)，定期統(tǒng)計(jì)植株再生率。

1.7 不同苗齡莖尖的愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生

將生長(zhǎng)1～10 d的幼苗分別設(shè)6個(gè)苗齡梯度(1 d、2 d、3 d、5 d、8 d、10 d)并去掉種子和根，從每個(gè)材料的莖尖基部切取2 mm左右的切段，按苗齡梯度順序接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于25 ℃、黑暗培養(yǎng)2 d后，多數(shù)莖尖開始膨大，部分莖尖開始伸長(zhǎng)，少數(shù)莖尖產(chǎn)生愈傷組織。培養(yǎng)7 d時(shí)剝?nèi)ビ扇~原基發(fā)育的幼葉，剝離幼葉時(shí)要避免損傷葉原基附近的分生組織，將誘導(dǎo)出的小愈傷組織接種于愈傷組織繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖和繼代培養(yǎng)，14 d后統(tǒng)計(jì)出愈情況。分別選取繼代后不同苗齡莖尖基部切段產(chǎn)生的乳黃 、顏色鮮亮、致密的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上于3 000 lx光照下培養(yǎng)，光照時(shí)間為16 h·d-1。分化培養(yǎng)后隨時(shí)觀察愈傷組織出現(xiàn)綠點(diǎn)的狀況，每14 d進(jìn)行繼代，繼代2次后將分化出的小苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)，定期統(tǒng)計(jì)植株再生率。

1.8 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2，4-D濃度的設(shè)置

接種甘啤4號(hào)莖尖外植體材料，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MS+0.7%瓊脂+3%麥芽糖+0.5 g·L-1水解酪蛋白+0.5 g·L-1脯氨酸)中分別添加不同濃度的2，4-D(1、2、3、4、5、6、7 mg·L-1)誘導(dǎo)愈傷，觀察愈傷組織的顏色、形態(tài)等，14 d后統(tǒng)計(jì)出愈率，待其產(chǎn)生乳黃、 致密的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上于3 000 lx光照下培養(yǎng)，光照時(shí)間為16 h·d-1，分化培養(yǎng)后隨時(shí)觀察愈傷組織出現(xiàn)綠點(diǎn)的狀況，每14 d進(jìn)行繼代，繼代2次后將分化出的小苗轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)，定期統(tǒng)計(jì)植株再生率。每個(gè)2，4-D濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.9 植株生根培養(yǎng)和移栽

當(dāng)幼苗長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)。待苗長(zhǎng)出部分健壯的根時(shí)，進(jìn)行鍛煉后移入土中。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

出愈率(%)=(形成愈傷組織的莖尖數(shù)/總接種莖尖數(shù))×100

植株再生率(%)=(分化出完整植株的愈傷數(shù)/總接種愈傷數(shù))×100

用 Excel 2007 和 SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、方差分析(LSD法)和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麥種子不同穎殼去除方式的效果

如圖1所示，A3處理后再按1.3節(jié)中方法常規(guī)滅菌，種子的平均帶菌率為0，與其他處理相比差異顯著；不同品種中只有甘啤6號(hào)在A1、A2、A3處理間發(fā)芽率差異不顯著；整齊度在不同處理間差異顯著，但品種間差異均不顯著。A4處理帶菌率達(dá)到100%，發(fā)芽率也較低，為2.8%～8.9%，整齊度為1.1%～3.9%； A1處理帶菌率為33%以上，發(fā)芽率較高，其中最高為甘啤4號(hào)，甘啤3號(hào)次之，甘啤6號(hào)最低。A2處理明顯降低了污染，帶菌率在3.3%～5.0%之間，發(fā)芽率較高，最高為甘啤4號(hào)，甘啤3號(hào)次之，甘啤6號(hào)最低。以上結(jié)果表明，A3處理極大地降低了污染，增強(qiáng)了種子的發(fā)芽率和長(zhǎng)勢(shì)，說(shuō)明30%硫酸不僅能夠有效去殼，還能打破種子的休眠，增加發(fā)芽率。種子穎殼去除后，發(fā)芽率和整齊度顯著提高。

2.2 種子最佳滅菌組合

從表1可以看出，未經(jīng)75%乙醇預(yù)浸泡而直接用三種滅菌劑處理，C1B2和C1B3滅菌效果顯著高于C1B1。隨著75%乙醇處理時(shí)間的延長(zhǎng)，帶菌率呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明75%乙醇預(yù)處理能降低種子帶菌率。75%乙醇處理1.5 min以上，再結(jié)合2%的有效氯NaClO 15 min或1%升汞15 min，滅菌效果最好，帶菌率都為0。C6B1的滅菌效果與直接利用B1(C1B1)相比達(dá)極顯著水平，帶菌率下降80%。從發(fā)芽率可以看出，B3和B2的滅菌效果差異不顯著，都顯著高于B1。隨著75%乙醇處理時(shí)間的延長(zhǎng)，種子發(fā)芽率逐漸下降。C4結(jié)合B1或B2滅菌，對(duì)種子較安全，發(fā)芽率無(wú)顯著差異；C5、C6結(jié)合B1或B2滅菌對(duì)種子傷害顯著。整齊度的趨勢(shì)和發(fā)芽率相似。結(jié)合種子帶菌率、發(fā)芽率、整齊度三個(gè)方面來(lái)看，C4B2組合滅菌效果最好，不僅能有效降低種子帶菌率，而且對(duì)種子傷害較小，整齊度較好，有助于無(wú)菌苗的培養(yǎng)。

圖柱上不同小寫字母表示同一品種不同處理間差異在0.05水平上顯著；A1：人工去殼；A2：人工去殼后加入50 mL蒸餾水，在搖床中30 ℃、180 r·min-1下?lián)u動(dòng)1 h；A3：加入50 mL 30%的硫酸，在搖床中30 ℃、180 r·min-1下?lián)u動(dòng)1 h；A4：種子未去殼。

Different small letters on the columns indicate significant difference among different treatments of the same cultivar at 0.05 level.A1：Artificial dehulling；A2：Artificial dehulling and soaking in 50 mL distilled water at 30 ℃ and 180 r·min-1for 1 h；A3：Soaking in 30% sulfuric acid at 30 ℃ and 180 r·min-1for 1 h；A4：No dehulling.

圖1 不同處理方式對(duì)種子帶菌率、發(fā)芽率和幼苗整齊度的影響

C1～C6:75%酒精處理0、0.5、1、1.5、2、3 min；B1～B3:10%H2O2、2%有效氯的NaClO、1%升汞處理15 min；同列數(shù)據(jù)后的不同小寫和大寫字母分別表示差異達(dá) 5%和 1%顯著水平。

C1～C6：Soaking in 75% ethanol for 0,0.5,1,1.5,2,3 min;B1～B3:Sterilizing with 10% H2O2，sodium hypochlorite with 2% available chlorine and 1% mercuric chloride，respectively;Values within a column followed by different small and capital letters mean difference significant at the 0.05 and 0.01 levels，respectively.

2.3 莖尖外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響因素

2.3.1 苗齡對(duì)愈傷組織培養(yǎng)的影響

由圖2可知，不同苗齡的莖尖外植體不僅形成愈傷組織的頻率不同，而且愈傷組織的再生能力也有很大差異。出愈率隨著苗齡的增加而先上升后下降，在苗齡為3 d時(shí)達(dá)到最高。愈傷組織的再生能力亦有相同表現(xiàn)。苗齡3 d的莖尖出愈率高達(dá)94.1%，明顯高于苗齡1 d (20.4%)、2 d(72.2%)、5 d(77.8%)和10 d(20.4%)的。而對(duì)于植株再生率，3 d苗齡莖尖誘導(dǎo)的愈傷組織有大約31.1% 的再生率，明顯高于其他苗齡的。來(lái)源于10 d苗齡的莖尖愈傷組織未見分化。因此，在大麥莖尖愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生過(guò)程中選用3 d苗齡莖尖效果最好。

圖2 苗齡對(duì)莖尖外植體出愈率和植株再生率的影響

2.3.2 不同莖尖外植體切段培養(yǎng)效果的比較

體外培養(yǎng)條件下，研究3 d苗齡的甘啤4號(hào)莖尖外植體切段(ST0～ST5)，以及直接剝?nèi)〉? mm的莖尖外植體(ST00)產(chǎn)生愈傷組織和再生綠苗能力。培養(yǎng)7 d后，轉(zhuǎn)移到新鮮的繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)愈傷組織誘導(dǎo)，14 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果表明，除了ST5切段，大多數(shù)莖尖切段都會(huì)高頻產(chǎn)生愈傷組織，其中莖尖基部切段(ST0)和直接剝?nèi)〉那o尖(ST00)更可能產(chǎn)生愈傷組織和再生植株，與其他切段相比都達(dá)到極顯著水平。ST00與ST0的出愈率和植株再生率無(wú)顯著差異，但莖尖的剝?nèi)〔僮鬏^困難，不適用于大量試驗(yàn)。ST00和ST0在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后，出愈率分別為93.9%、94.4%，植株再生率分別為31.1%、30.6%(圖3)。盡管莖尖切段ST4產(chǎn)生了少量的愈傷組織，但已經(jīng)失去了分化能力，不能形成再生植株。因此，ST0切段是最適合于愈傷組織的誘導(dǎo)的外植體材料。

ST00表示剝離胚芽鞘及2片左右的幼葉，切下包含莖尖分生組織和葉原基在內(nèi)的長(zhǎng)約2 mm的莖尖； ST0、ST1、ST2、ST3、ST4、ST5分別表示自幼苗基部去掉種子及根并由基部向上依次切取2 mm左右的莖尖切段；圖柱上不同小寫字母表示不同處理間差異在0.05水平上顯著。下同。

ST00:Stripping the coleoptile and two young leaves，cutting the 2 mm stem tip contained of stem tip meristem and leaf base; ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5:Removing the seeds and roots from the seedling base and cutting about 2 mm shoot tip segments from the base of the shoot tips successively;Different small letters on the columns indicate significant difference among different treatments at 0.05 level.The same below.

圖3 甘啤4號(hào)不同莖尖外植體切段對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的影響

Fig.3 Effect of shoot tip segments of Ganpi 4 on frequency of callus formation and plant regeneration

2.3.3 2，4-D濃度對(duì)莖尖外植體再生的影響

在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上設(shè)置7個(gè)2，4-D濃度梯度，統(tǒng)計(jì)甘啤4號(hào)大麥莖尖的出愈率和植株再生率，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同2，4-D濃度對(duì)大麥莖尖外植體出愈率及再生率的影響

隨著2，4-D濃度的升高，甘啤4號(hào)莖尖的出愈率先上升后下降，而植株再生率則逐漸下降。2，4-D濃度達(dá)到3 mg·L-1之后，出愈率升高緩慢，而植株再生率大幅度下降；3～5 mg·L-1濃度之間的出愈率無(wú)顯著差異，但植株再生率差異顯著；2，4-D濃度高于6 mg·L-1后出愈率和植株再生率顯著下降；1～3 mg·L-12，4-D濃度之間的植株再生率差異不顯著，但較≥4 mg·L-12，4-D的差異顯著。2，4-D濃度為1 mg·L-1和7 mg·L-1時(shí)出愈率最低。說(shuō)明2，4-D濃度過(guò)高會(huì)抑制大麥莖尖誘導(dǎo)愈傷組織且植株再生率較低，2，4-D濃度過(guò)低達(dá)不到莖尖愈傷組織誘導(dǎo)的要求。因此，3 mg·L-12，4-D是適宜愈傷組織離體培養(yǎng)的最佳條件。

3 討 論

3.1 大麥種子無(wú)菌苗的培養(yǎng)

穎殼對(duì)大麥愈傷組織的培養(yǎng)和植株的高頻再生影響較大。嚴(yán)華軍等[30]在研究大麥成熟胚愈傷組織的高頻誘導(dǎo)和植株再生時(shí)，利用50% H2SO4在25 ℃下處理3 h，振蕩去殼。潘向群等[31]在大麥成熟胚愈傷組織培養(yǎng)前經(jīng)過(guò)50% H2SO4在30 ℃水浴中處理2 h，振蕩去殼。但他們并未說(shuō)明H2SO4去殼的效果以及對(duì)種子發(fā)芽的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，30% H2SO4去殼效果最好且對(duì)種胚傷害較小。Becher等[32]利用15%H2O2對(duì)種子進(jìn)行種子滅菌。據(jù)報(bào)道，在常用的幾種滅菌劑(次氯酸鈣、次氯酸鈉、過(guò)氧化氫、溴水、硝酸銀、升汞、抗生素)中，升汞的滅菌效果最好[33]。然而本研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)75%乙醇處理1.5 min 以上，再結(jié)合2%有效氯的NaClO或1%升汞處理15 min，滅菌效果最好，帶菌率都為0，但升汞毒性較大，傷害種子，影響種子發(fā)芽，因此適于大麥種子滅菌的組合為75%乙醇1.5 min+2%有效氯的NaClO 15 min。

3.2 大麥愈傷組織的培養(yǎng)

郝建國(guó)等[34]研究發(fā)現(xiàn)，苗齡3 d的小麥葉基愈傷組織誘導(dǎo)率為 72%，明顯高于苗齡5 d(50%)和10 d(25.3%)的外植體；來(lái)自10 d苗齡的切段愈傷組織未見芽的分化，3 d苗齡的葉基切段愈傷組織有大約 20% 的芽分化率，明顯高5 d苗齡的材料。這與本研究對(duì)1～10 d苗齡大麥莖尖再生的研究結(jié)果相似。因此，在大麥莖尖再生體系中，用3 d苗齡是莖尖外植體誘導(dǎo)具有再生能力的愈傷組織的最佳取材時(shí)期。在大多數(shù)的植物組織培養(yǎng)研究中，通常使用2，4-D誘導(dǎo)愈傷組織的產(chǎn)生，使用濃度為 10-5～10-7mol·L-1[35]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，2，4-D對(duì)大麥莖尖愈傷組織的誘導(dǎo)影響很大，隨著2，4-D濃度升高，出愈率明顯提高，但2，4-D 濃度超過(guò)6 mg·L-1時(shí)，出愈率、植株再生率明顯下降。愈傷組織變硬，容易褐化，這可能也是導(dǎo)致植株再生率低的原因，跟以往的研究結(jié)論相符[36]，故3 mg·L-12，4-D是適宜大麥莖尖愈傷組織離體培養(yǎng)的條件。

[1] 盧良恕.中國(guó)大麥學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1996,119-122.

LU L S.Chinese Barley Science [M].Beijing:China Agriculture Press,1996,119-122.

[2] ZIAUDDIN A,SIMION E,KASHA K J.Improved plant regeneration from shed microspore culture in barley(HordeumvulgareL.) cv.Igri [J].PlantCellReports,1990,9(2):69.

[3] SENER O,CAN E,ARSLAN M.Effects of genotype and picloram concentrations on callus induction and plant regeneration from immature inflorescence of spring barley cultivars (HordeumvulgareL.) [J].BiotechnologyandBiotechnologicalEquipment,2008,22(4):915.

[4] SIDOR L S,ORLOV P A.Regeneration potential of different wheat,rye and barley species in leaf explant culture [J].TsitologiiaIGenetika,2005,39(5):28.

[5] NORSTOG K.Induction of embryolike structures by kinetin in cultured barley embryos [J].DevelopmentalBiology,1970,23(4):665.

[6] BARTLETT J G,ALVES S C,SMEDLEY M,etal.High-throughputAgrobacterium-mediated barley transformation[J].PlantMethods,2008,4(1):1.

[7] HOLME I B,BRINCH-PEDERSEN H,LANGE M,etal.Transformation of different barley (HordeumvulgareL.) cultivars byAgrobacteriumtumefaciens infection ofinvitrocultured ovules [J].PlantCellReports,2008,27(12):1833.

[8] AKULA C,AKULA A,HENRY R.Improved regeneration efficiency from mature embryos of barley cultivars [J].BiologiaPlantarum,1999,42(4):505.

[9] DAHLEEN L S,BREGITZER P.An improved media system for high regeneration rates from barley immature embryo-derived callus cultures of commercial cultivars [J].CropScience,2002,42(3):934.

[10] SHARMA V K,H?NSCH R,MENDEL R R,etal.A highly efficient plant regeneration system through multiple shoot differentiation from commercial cultivars of barley (HordeumvulgareL.) using meristematic shoot segments excised from ger minated mature embryos [J].PlantCellReports,2004,23(1-2):9.

[11] MAHESWARI M,LAKSHMI N J,YADAV S K,etal.Efficient plant regeneration from shoot apices of sorghum [J].BiologiaPlantarum,2006,50(50):741.

[12] RENGEL Z,JELASKA S.Somatic embryogenesis and plant regeneration from seedling tissues ofHordeumvulgareL. [J].JournalofPlantPhysiology,1986,124(5):385.

[13] LI H P,HUANG T,WANG C X,etal.An efficient regeneration system of barley cultivars from leaf base segments [J].BiologiaPlantarum,2009,53(4):733.

[14] HALILOGLU K.Efficient regeneration system from wheat leaf base segments [J].BiologiaPlantarum,2006,50(4):326.

[15] WANG C T,WEI Z M.Embryogenesis and regeneration of green plantlets from wheat (Triticumaestivum) leaf base [J].PlantCellTissue&OrganCulture,2004,77(1):149.

[16] GANESHAN S,CHODAPARAMBIL S V,B?GA M,etal.Invitroregeneration of cereals based on multiple shoot induction from mature embryos in response to thidiazuron [J].PlantCellTissue&OrganCulture,2006,85(1):63.

[17] VIERTEL K,HESS D.Shoot tips of wheat as an alternative source for regenerable embryogenic callus cultures [J].PlantCell,TissueandOrganCulture,1996,44(3):183.

[18] DEVI P,ZHONG H,STICKLEN M B.Invitromorphogenesis of pearl millet [Pennisetumglaucum(L.) R.Br.]:efficient production of multiple shoots and inflorescences from shoot apices [J].PlantCellReports,2000,19(6):546.

[19] HU X R,YANG A F,ZHANG K W,etal.Optimization ofinvitromultiple shoot clump induction and plantlet regeneration ofKentuckybluegrass(Poa pratensis) [J].Plantcell,TissueandOrganCulture,2006,84(1):90.

[20] 李文霞,寧海龍,李文濱,等.6-BA對(duì)大豆子葉節(jié)再生的影響 [J].核農(nóng)學(xué)報(bào),2007,21(5):502.

LI W X,NING H L,LI W B,etal.The effect of 6-BA on the regeneration of soybean cotyledonary node [J].JournalofNuclearAgriculturalScience,2007,21(5):502.

[21] 姜素云,胡孝瑞,晁相蓉,等.黑麥草高效叢生芽的發(fā)生及離體開花的初步研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào),2005,14(6):100.

JIANG S Y,HU X R,YAO X R,etal.A preliminary study on the occurrence andinvitroflowering of highly efficient shoot of ryegrass [J].ActaPrataculturaeSinica,2005,14(6):100.

[22] DEY M,BAKSHI S,GALIBA G,etal.Development of a genotype independent and transformation amenable regeneration system from shoot apex in rice (Oryzasativaspp.indica) using TDZ [J].Biotechnology,2012,2(3):233.

[23] POLUMAHANTHI S,MANI N S,KUMAR P K R.Callus induction and multiple shoot regeneration of sorghum cultivars using shoot tip as an explants [J].InternationalJournalofAdvancedLifeSciences,2014,7(1):66.

[24] 陳 莉,竇秉德,羅玉明,等.玉米莖尖培養(yǎng)再生體系的建立[J].淮陰師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2006,5(1):64.

CHEN L,DOU B D,LUO Y M,etal.Maize shoot tip establishment of regeneration system [J].JournalofHuaiyinTeachersCollege(NaturalScience),2006,5(1):64.

[25] 馬玲瓏,任盼榮,汪軍成,等.啤酒大麥品種甘啤4號(hào)成熟胚再生體系的建立[J].分子植物育種,2015(3):663.

MA L L,REN P R,WANG J C,etal.Establishing regeneration system from mature embryos of beer barley variety Ganpi 4 [J].MolecularPlantBreeding,2015(3):663.

[26] BREGITZER P,CAMPBELL R D,WU Y.Plant regeneration from barley callus:Effects of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and phenylacetic acid [J].PlantCellTissue&OrganCulture,1995,43(3):229.

[27] SAHRAWAT A K,CHAND S.High frequency plant regeneration from coleoptile tissue of barley (HordeumvulgareL.) [J].PlantScience,2004,167(1):27.

[28] PASTERNAK T P,RUDAS V A,L?RZ H,etal.Embryogenic callus formation and plant regeneration from leaf base segments of barley (HordeumvulgareL.) [J].JournalofPlantPhysiology,1999,155(3):371.

[29] MURASHIGE T,SKOOG F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures [J].PhysiologiaPlantarum,1962,15(3):473.

[30] 嚴(yán)華軍,王君暉.大麥成熟胚胚性愈傷組織的高頻誘導(dǎo)和植株再生[J].作物學(xué)報(bào),1996,22(1):58.

YAN H J,WANG J H.Callus induction of high frequency and plant regeneration from mature embryos of barley [J].ActaAgronomicaSinica,1996,22(1):58.

[31] 潘向群,梁海曼.大麥成熟胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基研究[J].作物學(xué)報(bào),1991,17(4):267.

PAN X Q,LIANG H M.The study of cultural medium on barley mature embryo [J].ActaAgronomicaSinica,1991,17(4):267.

[32] BECHER T,HABERLAND G,KOOP H U.Callus formation and plant regeneration in standard and microexplants from seedlings of barley(HordeumvulgareL.) [J].PlantCellReports,1992,11(1):39.

[33] 熊 麗,吳麗芳.觀賞花卉的組織培養(yǎng)與大規(guī)模生產(chǎn)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社.2003：80.

XIONG L,WU L F.Tissue Culture of Ornamental Flowers and Large-Scale Production [M].Beijing:Chemical Industry Press,2003:80.

[34] 郝建國(guó),賈敬芬.小麥葉基切段愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生 [J].西北大學(xué)學(xué)報(bào),2003,33(4):489.

HAO J G,JIA J F.Callus induction and plantlets regeneration of wheat leaf segments [J].JournalofNorthwestUniversity,2003,33(4):489.

[35] HE H,PAN R,HE Y,etal.Factors affecting organogenesis ofCitrusmicrocarpaBunge [J].JournalofTropicalandSubtropicalBotany,1996,5(3):53.

[36] GAIRI A,RASHID A.TDZ-induced somatic embryogenesis in non-responsive caryopses of rice using a short treatment with 2,4-D [J].PlantCell,TissueandOrganCulture,2004,76(1):29.

Callus Induction and High Frequency Regeneration of Plant from Shoot Tip of Barley (HordeumvulgareL.)

HU Youliang1,2，WANG Juncheng1,2，SI Erjing1,2，REN Panrong1,2,YAO Lirong1,2，LI Baochun1,3，MA Xiaole1,2，MENG Yaxiong1,2，WANG Huajun1,2

(1.Gansu Key Laboratory of Crop Improvement & Germplasm Enhancement/Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science，Lanzhou，Gansu 730070,China; 2.College of Agronomy，Gansu Agricultural University，Lanzhou，Gansu 730070,China;3.College of Life Sciences and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou，Gansu 730070,China)

High frequency regeneration system for tissue culture possesses high efficient and stable regeneration，and it is also the foundation of genetic transformation. Explant materials of different parts were tried to establish high frequency regeneration system in barley. In order to study the factors related to high frequency regeneration from shoot tip of barley，Ganpi 3，Ganpi 4 and Ganpi 6 were used to study the effects of the dehulling methods，sterilization ways，seedling age，shoot tip size and location，and the concentration of exogenous hormone (2,4-D) on the stem tip callus induction and the plant high frequency regeneration. The results showed that the optimal dehulling way is to use 30% sulfate and shake for an hour at 180 r·min-1and 30 ℃， and Ganpi 4 has the highest germination rate. The optimal method for surface sterilization was soaking in 75% ethanol for 1.5 min and then 2% sodium hypochlorite for 15 min，which is benefit for the aseptic seedling cultivation，with significant difference in microorganism-carrying and germination rate for seeds，less damage on seed and the good uniformity for seedlings. Callus formation of the shoot tip explants and plant regeneration frequency are closely related to shoot tip position and seedling age，and the optimal length of basal segments is 2 mm and the optimal seedling age is 3 d. The optimal concentration of 2，4-D for callus culture is 3 mg·L-1，which indicated the most significant difference in recovery and differentiation rates and could induce a large number of callus.

HordeumvulgareL.；Shoot tip explants；Microorganism-carrying；Frquency of callus formation;Frequency of plant regeneration

時(shí)間：2017-05-12

2016-10-25

2016-12-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460347)；盛彤笙創(chuàng)新基金項(xiàng)目(GSAU-STS-1513)；甘肅省財(cái)政廳科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目(035-041047); 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-05)

E-mail:hyliang008@163.com

王化俊(E-mail:whuajun@yahoo.com)

S512.3；S330

A

1009-1041(2017)05-0601-08

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