響應(yīng)面優(yōu)化魚鰾膠原肽制備工藝及其抗氧化活性研究

涂宗財(cái)，唐平平，鄭婷婷，龐娟娟，張露，沙小梅，王輝

1(江西師范大學(xué) 功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330022)2(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047)

響應(yīng)面優(yōu)化魚鰾膠原肽制備工藝及其抗氧化活性研究

涂宗財(cái)1,2*，唐平平1，鄭婷婷1，龐娟娟1，張露1，沙小梅1，王輝2

1(江西師范大學(xué) 功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330022)2(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047)

魚鰾富含膠原蛋白，營養(yǎng)價(jià)值高，但目前對魚鰾的加工利用不足，造成資源浪費(fèi)、環(huán)境污染。以草魚魚鰾為原料，以DPPH自由基清除能力為評價(jià)指標(biāo)，通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酶解魚鰾膠原蛋白制備抗氧化活性肽的最佳工藝，并研究其體外抗氧化活性。結(jié)果表明：抗氧化活性肽的最佳制備工藝為，以風(fēng)味蛋白酶為酶制劑，酶解時(shí)間79.34 min，料液比為3.09∶100(g∶mL)，酶添加量為6 343.43 U/g，在此條件下制備的魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除能力達(dá)79.98%。魚鰾膠原肽清除DPPH自由基、羥自由基的IC50分別為8.05 mg/mL和3.54 mg/mL，并且具有較強(qiáng)的還原力。因此，魚鰾膠原肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，草魚魚鰾是制備抗氧化活性肽的良好原料。

魚鰾；膠原蛋白；肽；抗氧化活性

活性氧自由基(ROS)是有氧生物細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的一類高活性物質(zhì)。在機(jī)體內(nèi)，自由基會(huì)不斷被體內(nèi)抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)和過氧化氫酶(CAT)清除。當(dāng)人體中ROS過量時(shí)，易導(dǎo)致一系列人類疾病，如神經(jīng)退化、糖尿病、衰老、癌癥等[1-2]。ROS中DPPH自由基活性最高，羥自由基毒性最強(qiáng)，超氧陰離子自由基可導(dǎo)致機(jī)體中毒。目前使用的自由基清除劑主要有BHA、BHT、TBHQ等，但這些抗氧化劑為合成抗氧化劑，易引發(fā)DNA、蛋白質(zhì)損傷及本身的毒性危害[3]。因此，從食源蛋白中提取天然抗氧化活性肽已逐漸成為研究熱點(diǎn)之一。

魚加工過程中產(chǎn)生大約40%的副產(chǎn)物，其中魚鰾約占1%[4]，根據(jù)2016漁業(yè)年鑒統(tǒng)計(jì)結(jié)果，2015年草魚的總產(chǎn)量567.62萬t計(jì)算，魚鰾產(chǎn)量約為2.27萬t，產(chǎn)量較大。且魚鰾富含膠質(zhì)，膠原蛋白含量高達(dá)80%以上[5]，可作為良好、豐富的膠原蛋白資源。但是，目前除少部分魚鰾(特別是淡水魚魚鰾)直接被食用或加工為干制品外，大部分被當(dāng)做廢棄物丟棄，造成大量的資源浪費(fèi)和嚴(yán)重的環(huán)境污染。膠原蛋白肽是膠原蛋白經(jīng)酶降解得到的一系列由3～20個(gè)氨基酸組成的多肽[6]。研究表明，水產(chǎn)品尤其是魚類加工副產(chǎn)物可制備具有抗氧化活性的膠原肽，目前國內(nèi)外研究者已從魚皮[7-9]、魚骨[10-12]、魚鱗[13-14]等副產(chǎn)物中制備除抗氧化膠原肽。但目前對魚鰾膠原肽研究極少，只有劉姝[15]等直接以鳙魚魚鰾原材料，通過米曲霉發(fā)酵制備抗氧化活性肽，但該法耗時(shí)長，達(dá)40 h，且產(chǎn)物的抗氧化活性不高，超氧陰防子自由基和羥自由基的清除率分別為52%和78%。

針對魚鰾資源加工利用不足，魚鰾膠原肽研究不夠深入，魚源膠原肽活性不高等問題，本文先從草魚(Ctenopharyngodonidellus)魚鰾中提取明膠，然后以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，采用酶法降解魚鰾明膠，通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化魚鰾明膠制備抗氧化膠原肽的制備工藝，并對其體外抗氧化活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚魚鰾(平均長度(20.3±1.4) cm、質(zhì)量(15.29±2.5) g)，由南昌市鄱陽湖農(nóng)牧漁產(chǎn)業(yè)發(fā)展股份有限公司提供，魚鰾在公司經(jīng)冷庫冰凍，加冰塊包裝好1 h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，新鮮魚鰾經(jīng)清洗后放-20℃保存?zhèn)溆?1個(gè)月內(nèi)使用)。

風(fēng)味蛋白酶(2.6×104U/g)、堿性蛋白酶(17.3×104U/g)、中性蛋白酶(5.0×104U/g)，諾維信生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶(26.7×104U/g)、木瓜蛋白酶(17.1×104U/g)，江蘇銳陽生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-3-硝基苯肼，美國Sigma公司；還原型谷胱甘肽，北京索萊寶有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

LGJ-1D-80型冷凍干燥機(jī)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；ESJ200-4型電子天平，沈陽龍騰電子有限公司；UV-3200型紫外-可見分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器有限公司；synergH1型酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；5430R型離心機(jī)，艾本德中國有限公司；KDY-9820型凱氏定氮儀，北京瑞邦興業(yè)科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 魚鰾明膠的提取[16]

稱取適量的草魚魚鰾，剪成(1 cm×1 cm)的小塊，按料液比1∶3(g∶mL)加入0.15%的NaOH，浸泡1 h后水洗至中性，再按1∶3的料液比加0.15%的H2SO4溶液，靜置1 h后水洗至中性，最后用80 ℃熱水浸提2 h，雙層濾紙過濾，濾液冷凍干燥后備用。

1.3.2 魚鰾明膠蛋白含量的測定[17]

參照GB 5009.5—2010《國家食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白的測定》中凱氏定氮法測定魚鰾明膠蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 蛋白酶的選擇

將魚鰾明膠配制成蛋白質(zhì)含量為20 mg/mL的溶液，加酶酶解，酶解條件見表1。酶解結(jié)束后，沸水浴滅酶10 min，7 500 r/min離心10 min，取上清液測定DPPH自由基清除率和游離氨基氮含量，篩選出最適蛋白酶。

表1 5種蛋白酶的酶解條件

1.3.4 酶解工藝研究

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

通過1.3.2篩選出水解魚鰾明膠的最適酶，以酶解液的DPPH自由基清除率及游離氨基氮含量為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。分別研究料液比(g∶mL)(1∶100、2∶100、3∶100、4∶100、5∶100)、酶解溫度(40、45、50、55、60、65 ℃)、反應(yīng)pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、反應(yīng)時(shí)間(15、30、45、60、75、90 min)、酶添加量[E/S](2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g)對魚鰾明膠酶解液DPPH自由基清除率和游離氨基氮含量的影響。

1.3.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，選擇對酶解產(chǎn)物抗氧化性影響較強(qiáng)的3個(gè)因素(酶添加量、反應(yīng)時(shí)間、料液比)進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。

1.3.5 游離氨基氮含量的測定

采用茚三酮法[18]測定游離氨基氮含量。

1.3.6 抗氧化活性研究

1.3.6.1 DPPH·清除能力測定[19]

用95%乙醇配制0.2 mmol/L DPPH，取100 μL酶解液與100 μL DPPH溶液于96孔酶標(biāo)板混合均勻，常溫避光反應(yīng)30 min，517 nm處測定吸光值A(chǔ)1。以100 μL 95%乙醇代替DPPH溶液與100 μL去離子水反應(yīng)為空白組(A0)，以100 μL DPPH溶液與100 μL去離子水反應(yīng)為對照組(A2)。DPPH·清除率計(jì)算公式如下：

DPPH自由基清除率/%=(A2-A1)/(A2-A0)×100

(1)

1.3.6.2 羥自由基清除能力的測定[20]

取1.0 mL酶解液依次加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4，1.5 mL 1.8 mmol/L 水楊酸-乙醇和0.1 mL 8.8 mmol/L H2O2，37℃水浴30 min。反應(yīng)結(jié)束后取200 uL混合液于96孔酶標(biāo)板，510 nm處測定吸光值A(chǔ)i，以去離子代替樣品液的吸光值為A0。羥自由基清除活性計(jì)算公式如下：

羥自由基清除率/%=[(A0-Ai)/A0]×100

(2)

1.3.6.3 還原力的測定

采用鐵氰化鉀還原法[21]測定水解產(chǎn)物的還原能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

由圖1-A可知，5種蛋白酶中以風(fēng)味蛋白酶制備的肽具有最高的DPPH自由基清除能力，達(dá)到73.71%，其后依次是木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶。由于游離氨基含量可間接反應(yīng)出蛋白質(zhì)水解度，酶解液中游離氨基含量越高，水解度越大[22]。從圖1-B中可以看出，風(fēng)味蛋白酶水解液中游離氨基氮含量最高，達(dá)到3 236.38 μg/mL。由此可知，在酶活力及酶解時(shí)間相同情況下，風(fēng)味蛋白酶酶解魚鰾明膠的效率最高，制備得到的肽具有最強(qiáng)的抗氧化活性，因此，選擇風(fēng)味蛋白酶為后續(xù)試驗(yàn)優(yōu)化魚鰾膠原肽制備工藝的蛋白酶。

圖1 不同蛋白酶酶解對魚鰾膠原肽DPPH清除率(A)及游離氨基氮含量(B)的影響Fig.1 Effect of protease on DPPHscavenging rate(A) and free amino nitrogen content(B) of collagen peptide from swimming bladder

2.2 風(fēng)味蛋白酶酶解魚鰾明膠制備抗氧化肽單因素試驗(yàn)

如圖2-A所示，pH值為6.0時(shí)，魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除率及游離氨基氮含量均達(dá)到最大。這可能是由于酶具有最適pH，pH值過高或過低都會(huì)降低酶的活力[23]。圖2-A中結(jié)果表明，風(fēng)味蛋白酶對魚鰾明膠的最適pH值為6.0，過高或過低均可降低膠原肽的DPPH自由基清除率及游離氨基氮含量，表明6.0為風(fēng)味蛋白酶制備魚鰾明膠抗氧化肽的最適pH值。

圖2 pH(A)、酶解溫度(B)、酶解時(shí)間(C)、酶添加量(D)、料液比(E)對魚鰾膠原肽DPPH清除率及游離氨基氮含量的影響Fig.2 Effect of pH(A)、 temperature(B)、 hydrolytic time(C)、 emzyme concentration(D)、liquid-to-material(E)on DPPH scavenging rate and free amino nitrogen content of collagen peptide from swimming bladder

由圖2-B可以看出，隨著酶解溫度升高，魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除率及游離氨基氮含量呈先增大后降低的趨勢，當(dāng)酶解溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，具有最高的DPPH自由基清除率及游離氨基氮含量，分別為72.25%和3 409.28 μg/mL，這可能是因?yàn)闇囟冗^高會(huì)導(dǎo)致酶活力降低甚至失活[24]。因此，風(fēng)味蛋白酶酶解的較適溫度為50 ℃。

圖2-C表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，魚鰾膠原肽DPPH自由基清除能力及游離氨基氮含量越來越高。當(dāng)酶解時(shí)間為75 min時(shí)達(dá)到最高，隨后降低，游離氨基氮含量則平緩降低。這可能是因?yàn)槊附夥磻?yīng)到一定時(shí)間后，進(jìn)一步酶解會(huì)切斷一些抗氧化多肽片段[25]，導(dǎo)致酶解液DPPH自由基清除率的降低。綜合考慮，酶解時(shí)間定為75 min。

由圖2-D可知，魚鰾膠原肽DPPH自由基清除能力及游離氨基氮含量隨著酶添加量的增加呈先升高后趨于平緩的趨勢。這可能是因?yàn)殡S著酶量的增加，酶與底物達(dá)到飽和，酶進(jìn)一步添加DPPH自由基清除能力及游離氨基氮含量不再增加。當(dāng)酶添加量為6 000 U/g魚鰾明膠蛋白時(shí)，DPPH自由基清除能力及游離氨基氮含量最高。因此，選擇最適酶添加量為6 000 U/g。

從圖2-E的結(jié)果可知，料液比在(1∶100～3∶100)(g∶mL)范圍內(nèi)，隨著料液比的升高魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除能力及游離氨基氮含量逐漸增大；料液比超過3∶100后，進(jìn)一步增大料液比魚鰾膠原肽DPPH自由基清除能力及游離氨基氮含量開始緩慢降低。這可能是由于料液比較低時(shí)，酶量多于底物，隨著料液比增加，底物濃度升高，底物多于酶量，進(jìn)一步增加已沒有多余的酶與底物反應(yīng)[26]。因此，最適料液比為3∶100。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，用Design Expert 8.0軟件對上述結(jié)果進(jìn)行分析，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

軟件分析結(jié)果得到二次多項(xiàng)式回歸方程為：

R=79.66+1.4X1+0.9X2+0.97X3-0.06X1X2+0.34X1X3-1.08X2X3-2.42X12-4.16X22-2.57X32

表3 回歸模型方差分析

由表3可知，模型P<0.000 1表示模型為極顯著。失擬項(xiàng)P值為0.1155(大于0.05)，表示模型預(yù)測值與實(shí)際誤差值較小。分析模型各系數(shù)的P值可

得，因素X1、X2、X3、X2X3、X12、X22、X32項(xiàng)的P<0.05，說明反應(yīng)時(shí)間、料液比和酶添加量的一次項(xiàng)和二次項(xiàng)，以及料液比和酶添加量的交互作用對魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除能力具有顯著影響。通過對DPPH自由基清除率的回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.979 8，表示預(yù)測值與實(shí)測值之間具有很高的相關(guān)性；Radj2=0.953 8，表明此模型能解釋95.38%的響應(yīng)值變化，僅有總變異的4.62%不能解釋。因此，該模型可以描述風(fēng)味蛋白酶對草魚魚鰾明膠酶解制備膠原肽的變化規(guī)律，此模型能較好的優(yōu)化試驗(yàn)方案。剔除不顯著項(xiàng)X1X2、X1X3，再對方程進(jìn)行優(yōu)化，得方程：R=79.66+1.4X1+0.9X2+0.97X3-1.08X2X3-2.42X12-4.16X22-2.57X32

圖3為料液比與酶添加量的等高線和響應(yīng)面圖。

圖3 料液比和酶添加量對DPPH自由基清除率影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig.3 Ration of solid to liquid and cmzyme content on DPPH scavenging rate of response surface chart and contour plots

等高線的形狀可反應(yīng)交互作用的強(qiáng)弱，橢圓表示交互作用顯著，圓形則表示不顯著。圖3可知，料液比與酶添加量之間具有顯著的交互作用，這與表3的結(jié)果一致。采用軟件分析得到風(fēng)味蛋白酶酶解魚鰾明膠的最優(yōu)工藝條件：反應(yīng)時(shí)間為79.34 min、料液比為3.09∶100、酶添加量6 343.43 U/g。此時(shí)魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除率理論值可達(dá)79.98%。按照該條件進(jìn)行DPPH自由基清除率的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，重復(fù)6次計(jì)算平均值，DPPH自由基清除率為81.25%。與理論值的相對誤差為1.57%。說明此模型可以較好的模擬和預(yù)測魚鰾膠原肽的DPPH自由基清除率。

2.4 魚鰾膠原肽抗氧化活性研究

以魚鰾膠原蛋白為原料，采用風(fēng)味蛋白酶在最佳酶解條件制備膠原肽，并對膠原肽的抗DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和還原力進(jìn)行測定，結(jié)果見圖4。

圖4 魚鰾膠原肽的抗氧化活性：(A)DPPH自由基清除率、(B)羥自由基清除率、(C)還原力Fig.4 Antioxidant activity of collagen peptide from swimming bladder(a)，DPPH scavenging rate，(b)OH scavenging rate and (c) reducing power

由圖4-A可知，隨著魚鰾膠原肽濃度的增加，樣品對DPPH自由基的清除率逐漸升高，30 mg/mL達(dá)到最高81.27%，其IC50值為8.05 mg/mL。劉成梅[27]等研究的羅非魚皮多肽(TSP-1)DPPH自由基清除率的IC50為13.96 mg/mL。劉文穎[28]等報(bào)道三文魚魚皮膠原肽對DPPH自由基清除率的IC50為14.95 mg/mL；夏光華[29]等采用三酶法制備羅非魚皮膠原肽，其清除DPPH自由基的IC50為10.78 mg/mL。尹利端[30]等制備的鯉魚魚鱗膠原肽對DPPH自由基清除率的IC50為18.24 mg/mL。與這2種魚皮膠原肽的DPPH自由基清除率相比，魚鰾膠原肽具有更高的DPPH自由基清除能力，但稍低于綠鰭馬面鲀魚皮膠原肽[31]的IC50為5.22 mg/mL，低于譚洪亮[12]等分離純化了的金槍魚骨膠原肽的DPPH自由基清除能力(IC50=0.97 mg/mL)，這可能是因?yàn)轸~鰾膠原肽是粗酶解物，未經(jīng)進(jìn)一步的分離純化。

從圖4-B可知，在0～15 mg/mL內(nèi)，魚鰾膠原肽的羥自由基清除率隨著濃度增大而升高，15 mg/mL后升高緩慢，IC50為3.54 mg/mL。馬華威[32]等以鮟鱇魚皮制備膠原活性肽，其對羥自由基清除的IC50為15.7 mg/mL。梁鵬[33]等研究了鯰魚骨酶解物的羥自由基清除能力，IC50為6.47 mg/mL；尹利端[30]等以鯉魚魚鱗為原料制備膠原肽，其清除羥自由基的IC50為12.11 mg/mL。這3種膠原肽的羥自由基清除能力均低于本文的魚鰾膠原肽。

圖4-C結(jié)果可看出，魚鰾膠原肽的還原能力具有良好的量效關(guān)系。隨著多肽濃度升高，還原能力越來越強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到30 mg/mL時(shí)，還原力相當(dāng)于相同濃度下VC的一半。任俊鳳[34]等對河豚魚皮膠原肽進(jìn)行超濾分離得到3 000～10 000 Da和1 000～3 000 Da和1 000 Da以下的3個(gè)肽段，其在濃度為30 mg/mL下的OD700 nm的值不到0.8。楊露[11]等制備的馬面魚骨多肽在60 mg/mL的OD700 nm的值僅約為0.6。2種膠原肽還原力均顯著低于魚鰾膠原肽。魚鰾膠原肽具有較強(qiáng)的還原力。雖然魚鰾膠原肽的DPPH自由基、羥自由基清除能力和還原力均低于VC和還原型谷胱甘肽，但優(yōu)于大部分的魚皮、魚骨、魚鱗膠原肽。綜上，通過對魚鰾膠原肽的體外抗氧化能力研究，表明魚鰾膠原肽具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

3 結(jié)論

魚鰾為富含膠原蛋白的藥食兩用資源，但其加工利用程度卻不高，本文通過單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)對草魚魚鰾明膠制備抗氧化肽的酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。確定最優(yōu)工藝條件為：風(fēng)味蛋白酶，酶解時(shí)間79.34 min，料液比為3.09∶100(g∶mL)，酶添加量為6 343.43 U/g，此時(shí)的DPPH自由基清除率達(dá)79.98%。體外抗氧化活性研究顯示，魚鰾膠原肽清除DPPH自由基和羥自由基的IC50分別為8.05 mg/mL和3.54 mg/mL，且具有較強(qiáng)的還原力，當(dāng)質(zhì)量濃度為30 mg/mL時(shí)，700nm處的吸光值達(dá)1.432 8。因此，魚鰾明膠酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可作為制備抗氧化活性肽的資源，本研究對促進(jìn)魚鰾資源的開發(fā)和高值化利用具有重要參考意義。

[1] ANASTASIOU D, POULOGIANNIS G, ASARA J M, et al. Inhibition of pyruvate kinase M2 by reactive oxygen species contributes to cellular antioxidant responses[J]. Science, 2011, 334(60): 1 278-1 283.

[2] FRANSEN M, NORDGREN M, WANG B, et al. Role of peroxisomes in ROS/RNS-metabolism: implications for human disease[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease, 2012, 1822(9): 1 363-1 373.

[3] WILLIAMS G M, IATROPOULOS M J, WHYSNER J. Safety assessment of butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene as antioxidant food additives[J]. Food and Chemical Toxicology, 1999, 37(9): 1 027-1 038.

[4] 詹永獻(xiàn). 草魚魚鰾膠原蛋白理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的研究[D]. 洛陽: 河南科技大學(xué), 2012.

[5] 段振華, 汪菊蘭, 殷安齊, 等. 幾種魚鰾的營養(yǎng)成分分析與評價(jià)[J]. 食品研究與開發(fā), 2007, 28(10): 62-65.

[6] ELIAS R J, KELLERBY S S, DECKER E A. Antioxidant activity of proteins and peptides[J]. Critical reviews in food science and nutrition, 2008, 48(5): 430-441.

[7] 王雨生, 冷云, 陳海華, 等. 黃鰭金槍魚皮膠原肽酶解工藝及抗氧化活性研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2015 (2): 72-78.

[8] NIKOO M, BENJAKUL S, X U X. Antioxidant and cryoprotective effects of Amur sturgeon skin gelatin hydrolysate in unwashed fish mince[J]. Food Chemistry, 2015, 181: 295-303.

[9] KETNAWA S, MART?NEZ-ALVAREZ O, BENJAKUL S, et al. Gelatin hydrolysates from farmed Giant catfish skin using alkaline proteases and its antioxidative function of simulated gastro-intestinal digestion[J]. Food Chemistry, 2016, 192: 34-42.

[10] NAQASH S Y, NAZEER R A. Evaluation of bioactive properties of peptide isolated from Exocoetus volitans backbone[J]. International Journal of Food Science & Technology, 2011, 46(1): 37-43.

[11] 楊露, 丁利君, 藍(lán)德安. 馬面魚骨膠原多肽的理化特性及其抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(11): 109-112.

[12] 譚洪亮, 郁迪, 王斌, 等. 金槍魚魚骨膠原肽的制備及抗氧化活性研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2014, 38(1): 143-148.

[13] NGO D H, QIAN Z J, RYU B M, et al.Invitroantioxidant activity of a peptide isolated from Nile tilapia (Oreochromisniloticus) scale gelatin in free radical-mediated oxidative systems[J]. Journal of Functional Foods, 2010, 2(2): 107-117.

[14] 洪瑤. 大黃魚魚鱗酶解制備膠原蛋白多肽的研究[D]. 杭州：中國計(jì)量學(xué)院, 2014.

[15] 劉姝, 余勃. 發(fā)酵法制備魚鰾多肽及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2009,30(21): 332-334.

[16] CHANDRA M V, SHAMASUNDAR B A. Rheological properties of gelatin prepared from the swim bladders of freshwater fish Catla catla[J]. Food Hydrocolloids, 2015, 48: 47-54.

[17] 中國人民共和國衛(wèi)生部. GB 5009.5—2010 食品中蛋白質(zhì)的測定[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010.

[18] 趙新淮, 馮志彪. 蛋白質(zhì)水解物水解度的測定[J]. 食品科學(xué), 1994 (11): 65-67.

[19] LEE J K, YUN J H, JEON J K, et al. Effect of antioxidant peptide isolated fromBrachionuscalyciflorus[J]. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 2010, 53(2): 192-197.

[20] 王運(yùn)改, 林琳, 李明輝, 等. 鮰魚皮明膠抗氧化肽的制備工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2010,30(19): 254-258.

[21] UDENIGWE C C, LU Y L, HAN C H, et al. Flaxseed protein-derived peptide fractions: Antioxidant properties and inhibition of lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in murine macrophages[J]. Food Chemistry, 2009, 116(1): 277-284.

[22] 宋茹, 馮婷立, 謝超. 海產(chǎn)小雜魚抗氧化肽制備工藝[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(12): 29-33.

[23] 顧明廣, 蘇芳, 劉艷霞. 酶解魚皮膠原蛋白制備抗氧化肽工藝研究[J]. 食品與機(jī)械, 2014 (2): 149-151.

[24] 賈韶千, 李艷霞. 黃鱔魚骨多肽制備及其抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 133-138.

[25] 茅宇虹, 楊文鴿, 徐大倫, 等. 秘魯魷魚皮明膠抗氧化肽的制備及其分子質(zhì)量分布[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2014 (9): 48-55.

[26] 賈建萍, 周彥鋼, 魯健章, 等. 三文魚皮膠原肽的制備及其抗氧化活性的研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2010 (4): 94-99.

[27] 劉成梅, 梁漢縈, 劉偉. 羅非魚魚皮多肽 (TSP—I) 抗氧化活性的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2007, 28(11): 148-151.

[28] 劉文穎, 徐亞光, 任瑋, 等. 三文魚皮膠原肽體外抗氧化活性研究[J]. 食品科技, 2010 (12): 86-89.

[29] 夏光華, 申鉉日, 蔡錦紅, 等. 三酶法制備羅非魚魚皮膠原蛋白抗氧化肽及活性研究[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(23): 175-179.

[30] 尹利端, 黃靜, 王立志. 鯉魚魚鱗膠原蛋白肽抗氧化活性研究[J]. 明膠科學(xué)與技術(shù), 2015, 35(3): 133-136.

[31] CHI C F, WANG B, HU F Y, et al. Purification and identification of three novel antioxidant peptides from protein hydrolysate of bluefin leatherjacket (Navodonseptentrionalis) skin[J]. Food Research International, 2015, 73: 124-129.

[32] 馬華威, 楊會(huì)成, 付萬冬, 等. 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(9): 80-84.

[33] 梁鵬, 張陽, 竇媛. 鯰魚骨酶解物抗氧化活性及其穩(wěn)定性研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2012, 33(11): 49-52.

[34] 任俊鳳, 任婷婷, 朱蓓薇. 河豚魚皮膠原蛋白肽的提取及其抗氧化活性的研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2009, 9(1): 77-83.

Optimization of swimming bladder collagen peptide preparation using response surface methodology and its antioxidant activity research

TU Zong-cai1,2*, TANG Ping-ping1, ZHENG Ting-ting1, PANG Juan-juan1,ZHANG Lu1, SHA Xiao-mei1, WANG Hui2

1(Key Laboratory of Functional Small Organic Molecule, Ministry of Education, College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)2(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Swim bladder is rich in collagen, high in nutrition, but it is waste and cause environmental pollution due to lack of processing technology, causing severe waste and environmental pollution. The technology parameters of enzymatic hydrolysis swim bladder in preparing collagen peptide through single factor experiment and response surface methodology was optimized, DPPH· scavenging ability was used as the indicator. The antioxidant activities of peptide prepared under the optimal condition were also evaluated. Results indicated that the optimal conditions for preparing antioxidant peptides were: Flavourzyme hydrolyzing for 79.34 min, liquid-to-material of 3.09%, emzyme-collagen ratio of 6 343.43 U/g. Under the above conditions, the DPPH· scavenging ability of swim bladder collagen peptide was 79.98%. The IC50value for DPPH· and ·OH scavenging ability was 8.05 mg/mL and 3.54 mg/mL, respectively. The peptide also exhibited relatively strong reducing power. Therefore, swim bladder is a good source in preparing swim bladder collagen with strong antioxidant activity.

swimming bladder; collagen; peptides; antioxidant activity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705026

博士，教授，(本文通訊作者，E-mail: tuzc_mail@aliyun.com)

江西省重大生態(tài)安全問題監(jiān)控協(xié)同創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目(No,JSX-EW-00)；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助(No,JXARS-04)

2016-08-16，改回日期：2016-10-08