蘋(píng)果塊固定化乳酸菌的發(fā)酵特性及凍干劑制備

陳濤，馬映昆，陳福生*

1(環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430070)2(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢，430070)

蘋(píng)果塊固定化乳酸菌的發(fā)酵特性及凍干劑制備

陳濤1,2，馬映昆2，陳福生1,2*

1(環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430070)2(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢，430070)

利用蘋(píng)果塊作為載體包埋乳酸菌L4-4、L6-2用于豆乳發(fā)酵和凍干發(fā)酵劑的制備。與游離細(xì)胞發(fā)酵相比，固定化細(xì)胞發(fā)酵豆乳中具有奶香和果香的風(fēng)味物質(zhì)含量較高；連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中固定化細(xì)胞比游離細(xì)胞更穩(wěn)定；固定化細(xì)胞凍干以后的存活率達(dá)到78%以上，高于游離細(xì)胞，且復(fù)蘇效率沒(méi)有明顯下降。

蘋(píng)果；固定化；乳酸菌；發(fā)酵特性；凍干劑

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是自古以來(lái)就被人類(lèi)作為食品微生物利用的一大類(lèi)菌，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品、醫(yī)藥、輕工業(yè)和畜牧業(yè)等領(lǐng)域[1]，是公認(rèn)的安全的微生物[2]。牛奶、豆乳、肉制品、蔬菜和水果等都可作為L(zhǎng)AB的優(yōu)良基質(zhì)，同時(shí)LAB介導(dǎo)的發(fā)酵可提高食品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分[3]，LAB作為發(fā)酵劑已廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中。

LAB發(fā)酵劑按形態(tài)的不同可分為 3 種，分別是：液體發(fā)酵劑、冷凍發(fā)酵劑和直投式發(fā)酵劑。液體發(fā)酵劑較便宜，菌種活力不穩(wěn)定，已經(jīng)逐漸被廠家淘汰；冷凍發(fā)酵劑經(jīng)深度冷凍而成，其運(yùn)輸和貯藏過(guò)程需要特殊環(huán)境條件，使用受到限制；直投式發(fā)酵劑又稱(chēng)凍干濃縮發(fā)酵劑，不需要經(jīng)過(guò)菌種活化、增殖培養(yǎng)和逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程，可直接應(yīng)用于生產(chǎn)，已在大型企業(yè)中使用[4]。

酸豆乳是一種以新鮮豆乳為原料，經(jīng)LAB發(fā)酵而成的風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富的新型功能性豆制品[5]。酸豆乳的主要生產(chǎn)工藝是接種游離LAB發(fā)酵。游離LAB發(fā)酵時(shí)需要多次轉(zhuǎn)接和擴(kuò)大培養(yǎng)，而且高接種量游離LAB長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生凝乳現(xiàn)象[6]。近年來(lái)，隨著固定化技術(shù)的發(fā)展，固定化微生物的研究和應(yīng)用日益受到人們重視。LAB經(jīng)固定化處理后，可提高其耐熱性、耐酸性、連續(xù)發(fā)酵能力，保持菌種比例恒定和生物活性的穩(wěn)定，增強(qiáng)抗污染力[7]。

傳統(tǒng)的固定化載體主要包括無(wú)機(jī)材料和有機(jī)高分子材料，如陶瓷、海藻酸鈉、瓊脂和聚乙烯醇(PVA)等[8]。隨著消費(fèi)者對(duì)食品安全的要求越來(lái)越高，傳統(tǒng)的固定化載體已不能滿足人們的需求，尋找新型綠色安全的固定化載體成為研究熱點(diǎn)，并且對(duì)風(fēng)味和口感的改善也是考慮因素[9]。水果、谷物內(nèi)部大多是由微管束，薄壁細(xì)胞組成，內(nèi)表面積很大，利于吸附微生物細(xì)胞[10]，且常見(jiàn)水果谷物來(lái)源豐富價(jià)格低，作為新型固定化載體是一個(gè)值得探索的新途徑。KOURKOUTAS等用水果塊作為固定化載體包埋LAB用于乳酸發(fā)酵，提高了乳酸的產(chǎn)率并且使連續(xù)發(fā)酵更為穩(wěn)定[9]；BOSNEA等以谷類(lèi)為固定化載體包埋LAB用于制備凍干發(fā)酵劑，與加保護(hù)劑相比較，固定化減少了污染的風(fēng)險(xiǎn)，且成本更低[11]。

本研究以蘋(píng)果塊作為載體固定LAB發(fā)酵豆乳，并與游離LAB發(fā)酵豆乳的風(fēng)味成分進(jìn)行了比較，同時(shí)比較了2者的連續(xù)發(fā)酵能力和制備凍干發(fā)酵劑的穩(wěn)定性。研究結(jié)果為發(fā)酵豆乳的開(kāi)發(fā)提供了參考，也為L(zhǎng)AB直投式凍干發(fā)酵劑的制備提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料及菌株

大豆、脫脂奶粉、蘋(píng)果：市售；菌株：發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentium)L6-2，干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)L4-4，本實(shí)驗(yàn)室分離并保藏[5]。

1.1.2 主要試劑

KH2PO4，分析純，汕頭市化學(xué)試劑廠；NaHCO3，分析純，天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司；NaOH，NaCl，酚酞，都為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乳酸標(biāo)準(zhǔn)品，色譜純，美國(guó)Supelco公司。

1.1.3 主要儀器

HC-2062型高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；7890A/5975C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；ThermoSavan冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Thermo Electron Co公司；S-520掃描電鏡，日本HIACHI公司。

1.2 方法

1.2.1 豆乳的配制

參考陳濤等的配制方法[5]。

1.2.2 乳酸菌固定化載體制備

參考KOURKOUTAS等的制備方法[9]。采用蘋(píng)果作為固定材料，洗凈去皮后切成1 cm見(jiàn)方的小塊，分別取200 g蘋(píng)果塊添加到400 mL事先分別接種L4-4，L6-2培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6的MRS培養(yǎng)基中，使菌液浸沒(méi)蘋(píng)果塊，37 ℃靜置培養(yǎng)過(guò)夜；固定過(guò)程完成以后，倒掉發(fā)酵菌液，用無(wú)菌水清洗2次固定載體，備用。

1.2.3 產(chǎn)酸速率的測(cè)定

固定化載體加生理鹽水研磨稀釋后，涂平板計(jì)數(shù)，確定單位質(zhì)量的載體的活菌數(shù)，以此確定接種量。將固定化載體按游離細(xì)胞接種量(5%，109CFU/mL)接入豆乳，達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)后，置于4 ℃冰箱存貯24 h，凝乳后記錄凝乳時(shí)間。保水性能、酸度、后酸化能力和活菌數(shù)等發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定參考陳濤等的測(cè)定方法[5]。

1.2.4 連續(xù)發(fā)酵穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將載體取出用無(wú)菌水沖洗2次后再轉(zhuǎn)接到另一瓶豆乳，連續(xù)轉(zhuǎn)接7代，測(cè)定各批次產(chǎn)品發(fā)酵終點(diǎn)的pH、酸度及乳酸含量。pH采用pH計(jì)測(cè)定，乳酸測(cè)定采用HPLC法[5]。

游離細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)參考陳濤等的測(cè)定方法[5]。

1.2.5 揮發(fā)性風(fēng)味成分的測(cè)定

采用頂空固相微萃取(HS-SPME)的方法吸附酸豆乳中的香氣成分，GC-MS對(duì)香氣成分進(jìn)行鑒定[12]。

樣品預(yù)處理的方法：先將PDMS萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口于250 ℃老化至無(wú)雜峰。取10 mL發(fā)酵乳樣加入裝有磁力攪拌器的頂空瓶中，并加入2.0 g NaCl，在70 ℃恒溫水浴鍋中，頂空吸附40 min，隨后抽回纖維頭，從樣品瓶中拔出萃取頭，再將萃取頭插入GC-MS 儀的氣相色譜進(jìn)樣口，推出纖維頭，于250 ℃解析5 min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

GC-MS參數(shù)條件：色譜條件：HP-5MS 色譜柱(柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.25 mm，厚度0.25 mm)，高純氦氣流量為1.0 mL/min，分流比1∶1；SPME插入進(jìn)樣孔，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，解析5 min。加熱箱的起始溫度為40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min 上升至160 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min 上升至220 ℃，保持3 min。質(zhì)譜條件：接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，電離方式采用70 eV 電子離子化模式，掃描范圍33-450 amu。

數(shù)據(jù)檢索：通過(guò)計(jì)算機(jī)對(duì)檢出的各組分進(jìn)行檢索，檢索譜庫(kù)為Willey 譜庫(kù)和NIST譜庫(kù)。針對(duì)檢測(cè)出的揮發(fā)性成分匹配度大于800的化合物，再結(jié)合化學(xué)成分的保留時(shí)間、質(zhì)譜圖譜等進(jìn)行定性分析。

1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)品存儲(chǔ)15、60、90 d復(fù)蘇性能測(cè)試

固定化載體按游離細(xì)胞接種量的比例(5%，109CFU/mL)接入豆乳達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)后，于4 ℃存儲(chǔ)15、60、90 d后取樣，進(jìn)行感官鑒定，并進(jìn)行轉(zhuǎn)接，繪制再次發(fā)酵豆乳達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)的動(dòng)力曲線[9]。

1.2.7 凍干發(fā)酵劑的存活率及復(fù)蘇效率比較分析

1.2.7.1 凍干發(fā)酵劑制備

凍干發(fā)酵劑的制備及指標(biāo)測(cè)定參考邵東燕的制備方法[13]。

收集菌體：收集對(duì)數(shù)期后期菌體5 mL/管，每菌株做10管，4 000 r/min離心20 min，用生理鹽水洗滌2次備用。

菌懸液制備：收集的菌泥中加保護(hù)劑(菌泥∶保護(hù)劑=1∶3)，注入凍干管前，每株菌取3管測(cè)定凍干前活菌數(shù)。

真空冷凍干燥：將裝有菌懸液的凍干管置-80 ℃超低溫冰箱預(yù)凍3 h后，放真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，-54 ℃，5 mtorr下冷凍36 h，測(cè)定凍干后活菌數(shù)。

1.2.7.2 指標(biāo)測(cè)定

活菌數(shù)測(cè)定：對(duì)冷凍干燥的干菌粉，用相應(yīng)的保護(hù)劑復(fù)水20 min，然后再進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定。存活率計(jì)算：

式中：S，細(xì)胞存活率，%；A，凍干后1管樣品中測(cè)得的活菌數(shù)，CFU；B，凍干前1管樣品中測(cè)得的活菌數(shù)，CFU。

凍干菌粉發(fā)酵性能測(cè)定：每株菌取1管凍干菌粉加入到5 mL滅菌脫脂乳中，復(fù)水活化20 min，以5%接種到豆乳原液中進(jìn)行發(fā)酵，定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵豆乳的pH。

1.2.7.3 固定化載體真空冷凍干燥

真空冷凍干燥：每管將固定化載體5 g與復(fù)合保護(hù)劑以1∶1的比例混合，另取固定化載體不加保護(hù)劑，分別裝入凍干管中，混合前每菌株取3管測(cè)定樣品中活菌數(shù)，-80 ℃超低溫冰箱預(yù)凍3 h，-54 ℃，5 mtorr下凍干36 h，再次將每菌株取3管測(cè)定活菌數(shù)[14]。存活率計(jì)算：

式中：S，細(xì)胞存活率，%；A，凍干后1管樣品中測(cè)得的活菌數(shù)，CFU；B，凍干前1管樣品中測(cè)得的活菌數(shù)，CFU。

凍干菌粒發(fā)酵性能測(cè)定：為了考察菌粒凍干前后的發(fā)酵性能差異，凍干菌粒發(fā)酵條件與鮮菌粒保持一致。根據(jù)未凍干前的接種比例，先加入到少量滅菌脫脂乳中，復(fù)水20 min，再接入滅菌豆乳原液中進(jìn)行發(fā)酵，定時(shí)取樣測(cè)定發(fā)酵豆乳的pH。

1.2.7.4 固定化細(xì)胞掃描電鏡觀察

樣品的制備及觀察參考曹水良等的方法并稍作改動(dòng)[15]。

(1)收集菌體：收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LAB菌液，12 000 r/min 離心5 min 收集菌體，以PBS(0.1 mol/L，pH 7.0)洗滌2遍。

(2)戊二醛固定：清洗過(guò)的菌體加入2.5%的戊二醛溶液中重懸，充分混勻后，4 ℃靜置2～5 h。

(3)洗滌：5 000 r/min離心10 min收集固定后的菌體，棄上清，超純水洗2遍。

(4)酒精洗脫：以30%、50%、70%的乙醇依次將菌體洗1遍，將菌體充分重懸，與酒精充分接觸，脫去水分，每次10 min。

(5)真空冷凍干燥：洗脫完的樣品置于冷凍干燥機(jī)中，冷凍抽干48 h以上至菌體完全干燥。用Eiko IB-3型離子濺射儀噴金后于HIACHI S-520掃描電鏡下(20 kV)進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化LAB的發(fā)酵特性分析

2.1.1 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞產(chǎn)酸速率比較

通過(guò)研磨稀釋涂平板記活菌數(shù)，測(cè)定固定化載體中L4-4，L6-2的活菌數(shù)均在108CFU/g數(shù)量級(jí)，按照與游離細(xì)胞相同的接種比例(5%，109CFU/mL)接種到滅菌豆乳中，根據(jù)L4-4，L6-2不同的特性確定發(fā)酵終點(diǎn)，每隔2 h測(cè)定發(fā)酵豆乳的pH，以游離細(xì)胞單獨(dú)發(fā)酵作為對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞發(fā)酵豆乳的pH變化Fig.1 pH changes of fermented soymilk by immobilized cells and free cells

從圖1可以看出，固定化細(xì)胞在前2 h，由于LAB包埋在載體內(nèi)部，菌體釋放較慢，產(chǎn)酸速率比游離細(xì)胞低，此后，固定化細(xì)胞產(chǎn)酸速率加快，而游離細(xì)胞反而降低，10 h后，固定化細(xì)胞酸度與游離細(xì)胞趨于一致。

2.1.2 固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞后酸化性能比較

固定化細(xì)胞，游離細(xì)胞分別發(fā)酵達(dá)終點(diǎn)(L4-4和L6-2分別為10 h和12 h)后于4 ℃冷藏21d，于0、1、7、14、21 d分別測(cè)定酸度及活菌數(shù)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞發(fā)酵4℃冷藏21d滴定酸度及活菌數(shù)變化Fig.2 The change of titratable acidity and viable count of fermented soy milk during 21d storage time

從圖2可以看出，與對(duì)應(yīng)的游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞發(fā)酵豆乳的酸度上升較快，說(shuō)明固定化細(xì)胞后酸化能力強(qiáng)，不利于酸奶保存，但是在21 d存儲(chǔ)期間活菌數(shù)的變化來(lái)看，固定化細(xì)胞發(fā)酵豆乳中活菌數(shù)明顯比游離細(xì)胞發(fā)酵豆乳高，在后酸化能力的改良上可以采取低溫長(zhǎng)時(shí)發(fā)酵來(lái)進(jìn)一步改善[16]。

2.2 連續(xù)發(fā)酵穩(wěn)定性比較

近年來(lái)人們研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的很多生理特征及性狀都或多或少地與其自身所攜帶的質(zhì)粒有關(guān)[17]，乳酸菌某些重要代謝特征如產(chǎn)酸、黏度等是由質(zhì)粒所攜帶的基因控制，菌株在傳代過(guò)程中可能使這些特征性狀丟失[18]，因而有必要對(duì)乳酸菌連續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。游離細(xì)胞，固定化細(xì)胞分別按初始的接種量連續(xù)在豆乳中傳代7次，按照各自初始的發(fā)酵時(shí)間為發(fā)酵終點(diǎn)，測(cè)定各批次產(chǎn)品的pH、酸度以及乳酸含量，結(jié)果如表1所示。

表1 固定化細(xì)胞，游離細(xì)胞傳代過(guò)程中發(fā)酵指標(biāo)比較

從表1可知，L4-4游離細(xì)胞連續(xù)轉(zhuǎn)接7次，終點(diǎn)pH由4.13上升到4.69，酸度由91 °T降低到81°T ，乳酸含量由7.9 mg/mL降低到5.57 mg/mL，L4-4固定化細(xì)胞連續(xù)轉(zhuǎn)接7次，終點(diǎn)pH和酸度差異不大，乳酸含量由8.50 mg/mL升高到9.53 mg/mL；L6-2游離細(xì)胞連續(xù)轉(zhuǎn)接7次，終點(diǎn)pH由4.34上升到4.89，酸度由75 °T降低到61 °T，乳酸含量由6.92 mg/mL降低到4.37 mg/mL，L6-2固定化細(xì)胞連續(xù)轉(zhuǎn)接7次，終點(diǎn)pH由4.61上升到4.95，酸度由75 °T降低到68 °T，乳酸含量由7.40 mg/mL升高到8.73 mg/mL。轉(zhuǎn)接7次后，游離細(xì)胞的產(chǎn)酸性能有所下降，并且轉(zhuǎn)接過(guò)程中波動(dòng)較大，而固定化細(xì)胞的產(chǎn)酸性能保持穩(wěn)定，且略有上升。這可能是由于每次轉(zhuǎn)接發(fā)酵中固定化載體僅表層果肉細(xì)胞脫離，是外層乳酸菌釋放，在轉(zhuǎn)接到新批次的豆乳時(shí)，保持著相對(duì)穩(wěn)定的接種比例；投入發(fā)酵初始時(shí)期，發(fā)酵速率較低，但由于載體剝落的菌體活性較高，在后期發(fā)酵速率會(huì)明顯上升，因而在連續(xù)7次轉(zhuǎn)接試驗(yàn)中，在相同的發(fā)酵時(shí)間都達(dá)到了較一致的pH，且酸度，乳酸含量也處于同一水平。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明LAB固定化細(xì)胞較游離細(xì)胞更穩(wěn)定，便于控制發(fā)酵時(shí)間，并且在利用固定化包埋技術(shù)制備高活性可連續(xù)使用發(fā)酵劑，便于使用時(shí)定量取用，保持菌種在發(fā)酵乳中的比例[11]。

2.3 固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞發(fā)酵風(fēng)味比較

對(duì)未發(fā)酵豆乳、L4-4游離細(xì)胞發(fā)酵豆乳、L6-2游離細(xì)胞發(fā)酵豆乳、兩游離細(xì)胞混合發(fā)酵豆乳、L4-4固定化發(fā)酵豆乳和L6-2固定化發(fā)酵豆乳的風(fēng)味進(jìn)行了GC-MS分析，分析結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，未發(fā)酵豆乳中共檢測(cè)出19 種揮發(fā)性成分，主要成分是醇、醛類(lèi)，相對(duì)含量分別為41.45% 和 28.53%；含量相對(duì)較高的是正己醛(25.97%)、1-辛烯-3-醇(21.31%)、正己醇(18.21%)和2-戊基呋喃(2.97%)，這與ALAOUA等的研究結(jié)果相同，它們是豆腥味的主要來(lái)源[19]。而L4-4游離細(xì)胞、L4-4固定化細(xì)胞、游離細(xì)胞混合發(fā)酵、L6-2游離細(xì)胞和L6-2固定化細(xì)胞發(fā)酵的豆乳分別檢測(cè)出24、25、27、22和25種香氣成分，主要香氣成分是酮、酸、醇和醛類(lèi)；其中，酮類(lèi)相對(duì)含量最高，酸類(lèi)其次。豆乳發(fā)酵前后的香氣成分種類(lèi)和含量發(fā)生了明顯變化。發(fā)酵后，酮、酸類(lèi)物質(zhì)相對(duì)含量明顯增多，而醇、醛類(lèi)物質(zhì)明顯減少，如2,3-丁二酮在未發(fā)酵豆乳中未檢出，而在發(fā)酵乳中其相對(duì)含量在5.33%～23.88%之間，2,3-丁二酮具有奶香味，使發(fā)酵后的酸乳奶香味增加[20]，另一方面，發(fā)酵豆乳中正己醛、正己醇含量的大幅度下降，是由于LAB發(fā)酵，可將羰基化合物轉(zhuǎn)化為酮、醇類(lèi)和有機(jī)酸[21]，這充分表明LAB發(fā)酵可減輕豆乳的豆腥味，并提高其香氣質(zhì)量。

表2 固定化細(xì)胞，游離細(xì)胞發(fā)酵豆乳揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分

從表2還發(fā)現(xiàn)，5種發(fā)酵豆乳之間它們的香氣構(gòu)成成分、數(shù)量和相互比例不同，其呈現(xiàn)的發(fā)酵香氣強(qiáng)度各不相同。其中L4-4發(fā)酵豆乳的香氣成分含量及種類(lèi)都明顯高于L6-2。酮基類(lèi)化合物，3-己酮、2-庚酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮，醛基類(lèi)化合物乙醛和糠醛，酯類(lèi)中丁酸乙酯都具有果香風(fēng)味，另外，2-庚酮還具有奶香風(fēng)味[22]，固定化LAB發(fā)酵豆乳中這些物質(zhì)的含量明顯高于游離LAB發(fā)酵豆乳，說(shuō)明固定化發(fā)酵增加了發(fā)酵豆乳的果香和奶香香氣?；旌习l(fā)酵的豆乳中風(fēng)味成分中，酮類(lèi)，酸類(lèi)化合物都低于L4-4單獨(dú)發(fā)酵，但是也明顯高于L6-2單獨(dú)發(fā)酵乳，說(shuō)明混合發(fā)酵豆乳彌補(bǔ)了L6-2菌株發(fā)酵風(fēng)味不足的劣勢(shì)，表明混合發(fā)酵有一定的合理性。

簡(jiǎn)言之，經(jīng)LAB發(fā)酵后，豆類(lèi)的不良風(fēng)味有明顯改善，而由固定化細(xì)胞發(fā)酵的豆乳在果香，奶香風(fēng)味化合物含量較高，風(fēng)味較好，說(shuō)明以蘋(píng)果塊作為固定載體用于酸豆乳發(fā)酵有利于進(jìn)一步提高發(fā)酵風(fēng)味。

2.4 發(fā)酵豆乳存儲(chǔ)15、60、90 d復(fù)蘇性能比較

固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞分別發(fā)酵達(dá)終點(diǎn)后，于4 ℃存儲(chǔ)15、60、90 d后按初始的接種比例用于豆乳發(fā)酵，比較其作為發(fā)酵劑的復(fù)蘇性能見(jiàn)圖4。

從圖4中可以看出，初始，存儲(chǔ)15、60、90 d這4個(gè)處理取樣用于復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)固定化細(xì)胞的產(chǎn)酸速率并沒(méi)有太大變化，而游離細(xì)胞復(fù)蘇產(chǎn)酸速率迅速減慢，發(fā)酵時(shí)間較固定化細(xì)胞延長(zhǎng)多2 h，存儲(chǔ)90 d以后發(fā)酵液已經(jīng)明顯變質(zhì)，已不能用于復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)，而固定化細(xì)胞在存儲(chǔ)90 d時(shí)依然能夠保持活力，能夠再次用于復(fù)蘇，這說(shuō)明固定化載體里的LAB，由于載體的包裹作用，已逐漸適應(yīng)了對(duì)其自身不利的酸性環(huán)境，在發(fā)酵乳中較好的生存了下來(lái)，并保持活力，且再次用于豆乳發(fā)酵依然能有效復(fù)蘇[9]。

2.5 直投式LAB凍干發(fā)酵劑的制備

制備凍干發(fā)酵劑關(guān)鍵點(diǎn)是干制后盡量保持較高的存活率，并且存儲(chǔ)期內(nèi)能夠迅速恢復(fù)活力，快速凝乳。在凍干過(guò)程中，細(xì)胞死亡主要是由冷凍損傷所引起的，加入保護(hù)劑是防止冷凍損傷較為有效的方法[23]。本實(shí)驗(yàn)采用游離細(xì)胞添加保護(hù)劑，游離細(xì)胞不添加保護(hù)劑，固定細(xì)胞不添加保護(hù)劑，固定細(xì)胞添加保護(hù)劑4種方式比較了各自凍干后的活菌數(shù)及復(fù)蘇效率。

2.5.1 不同凍干發(fā)酵劑存活率比較

固定化細(xì)胞、游離細(xì)胞添加或不添加保護(hù)劑經(jīng)冷凍干燥后存活率結(jié)果見(jiàn)表3。如表3所示，添加保護(hù)劑后游離細(xì)胞的存活率有顯著提高，但是添加保護(hù)劑后固定化細(xì)胞的存活率僅有少量提高。固定化細(xì)胞即使在不添加保護(hù)劑的情況下也能保持78%以上的存活率，原因可能是固定化載體作為一個(gè)半封閉的包埋載體，其中的蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)對(duì)其內(nèi)部的LAB有一定的保護(hù)作用，這一作用類(lèi)似于開(kāi)菲爾顆?；蚴俏鞑仂`菇的保護(hù)機(jī)制[13]。添加保護(hù)劑對(duì)固定化細(xì)胞存活率的提高沒(méi)有明顯的作用，可能是因?yàn)楸Ｗo(hù)劑接觸較多的是載體表面的菌，僅有較少的保護(hù)液可以滲透到載體內(nèi)部，從而沒(méi)有進(jìn)一步提高細(xì)菌的存活率。兩個(gè)菌種之間比較，也可以看出L6-2較L4-4在各種情況下的存活率要高，這可能是因?yàn)榍罢吣軌虍a(chǎn)生大量的胞外多糖，這正是該菌株發(fā)酵豆乳黏性較大的原因，而胞外多糖進(jìn)一步起到了保護(hù)菌體細(xì)胞不受凍害的作用[24]。

圖4 固定化，游離細(xì)胞4℃存儲(chǔ)0、15、60、90 d復(fù)蘇發(fā)酵動(dòng)力曲線Fig.4 Kinetics during milk fermentation using immobilized cells and free cells after store at 4℃ for 0, 15, 60 and 90 d

菌株及處理存活率/%L4-4游離不加保護(hù)劑凍干34.93%L4-4游離加保護(hù)劑凍干69.68L4-4固定不加保護(hù)劑凍干78.17L4-4固定加保護(hù)劑凍干83.49L6-2游離不加保護(hù)劑凍干48.47L6-2游離加保護(hù)劑凍干74.92L6-2固定不加保護(hù)劑凍干85.78L6-2固定加保護(hù)劑凍干87.87

2.5.2 不同凍干發(fā)酵劑復(fù)蘇性能比較

游離細(xì)胞，固定化細(xì)胞分別添加和不添加保護(hù)劑下凍干以后，按未凍干之前的接種比例接種到豆乳中復(fù)水活化，再次用于豆乳發(fā)酵復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4。

從表4可以看出，添加保護(hù)劑的游離細(xì)胞在復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)中，其產(chǎn)酸速率較未凍干之前的發(fā)酵速率顯著下降，發(fā)酵10 h時(shí)，游離L4-4，游離L6-2加保護(hù)劑凍干分別比未凍干處理的pH高0.73和0.53；而固定化細(xì)胞在未凍干、添加保護(hù)劑凍干和不添加保護(hù)劑凍干3種情況下發(fā)酵速率相差不大，發(fā)酵10 h時(shí)，未添加保護(hù)劑的固定化L4-4，L6-2干劑，比未凍干處理pH分別高0.36和0.28。

表4 不同凍干發(fā)酵劑發(fā)酵豆乳的pH變化

固定化載體同冷凍保護(hù)劑一樣為活細(xì)胞恢復(fù)功能和活力提供了良好的環(huán)境，包裹菌體細(xì)胞的保護(hù)劑，具有滲透緩沖作用，能調(diào)節(jié)液體進(jìn)入凍干細(xì)胞內(nèi)部的速度，使細(xì)胞有一個(gè)良好的環(huán)境快速恢復(fù)活力，尤其是損傷細(xì)胞，它只有在修復(fù)自身?yè)p傷之后才能盡快恢復(fù)活力。若沒(méi)有保護(hù)劑，液體很快滲入細(xì)胞，造成受損細(xì)胞破裂、死亡，或是活細(xì)胞暫時(shí)性滲壓休克，從而延緩活力的恢復(fù)，這正是造成不添加保護(hù)劑的游離細(xì)胞干劑凝乳時(shí)間顯著延長(zhǎng)的原因[7]。

2.5.3 固定化細(xì)胞掃描電鏡觀察

為揭示固定化細(xì)胞制備凍干劑提高活菌數(shù)，以及復(fù)蘇效率的機(jī)理，對(duì)不同固定化載體進(jìn)行了掃描電鏡觀察，如圖5所示。

(a):L6-2; (b):L4-4圖5 固定化細(xì)胞掃描顯微鏡微觀形態(tài)觀察(3000×; SEM)Fig.5 Morphology of immobilized LAB cells by scanning microscope (3000×; SEM)

掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu)顯示，經(jīng)凍干以后的固定化細(xì)胞形成了疏松的層疊狀空隙結(jié)構(gòu)，在層疊的片狀和空隙內(nèi)都附著了大量的菌體細(xì)胞。添加保護(hù)劑可以提高復(fù)蘇效率，一方面是由于保護(hù)劑存在氫鍵或離子基團(tuán)能夠與細(xì)胞蛋白質(zhì)相結(jié)合形成海綿狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而起到穩(wěn)定細(xì)胞蛋白結(jié)構(gòu)的作用，得以保護(hù)菌體避免損傷[25]；另一方面由于保護(hù)劑的持水性加上形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使干燥過(guò)程中細(xì)胞不會(huì)由于水分急劇下降，而破壞細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使菌體損傷[26]。而游離細(xì)胞干劑形成的纖維結(jié)構(gòu)表面積大，菌體細(xì)胞大量暴露在表面，因而受損嚴(yán)重。而固定化蘋(píng)果載體凍干形成的層疊片狀很有可能與凍干保護(hù)劑形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)果起到了相同作用，使得固定化載體凍干發(fā)酵劑的復(fù)蘇效率明顯高于游離細(xì)胞凍干發(fā)酵劑，另外，由于這種層疊或網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的包裹，可以減少菌體與氧氣的接觸，使菌體細(xì)胞得到較好的保護(hù)。

通過(guò)掃描電鏡的觀察，從微觀結(jié)構(gòu)上部分解釋了固定化載體能夠提高細(xì)胞存活率和復(fù)蘇效率的原因，并且也說(shuō)明用固定化載體取代保護(hù)劑制備凍干劑發(fā)酵劑將是一個(gè)可行并值得探索的途徑。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用蘋(píng)果塊作為載體包埋乳酸菌用于豆乳發(fā)酵和凍干發(fā)酵劑制備，并與游離細(xì)胞進(jìn)行比較。經(jīng)GC-MS分析發(fā)現(xiàn)固定化細(xì)胞發(fā)酵豆乳中具有芳香氣味的酮基類(lèi)物質(zhì)含量較高，兼具了奶香和果香風(fēng)味，產(chǎn)品的接受度更高；在連續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，固定化細(xì)胞比游離細(xì)胞更為穩(wěn)定；用于制備凍干發(fā)酵劑時(shí)，固定化細(xì)胞凍干以后的存活率在78%以上，且復(fù)蘇效率沒(méi)有明顯下降，說(shuō)明固定化載體同樣具有凍干保護(hù)劑的作用。蘋(píng)果塊固定化LAB既可用于豆乳發(fā)酵，且風(fēng)味和發(fā)酵效率好于游離細(xì)胞，又可作為制備凍干劑發(fā)酵劑的一種新方法。

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Fermentation characteristics and preparation of freeze-dried starter ofLactobacillusspp. immobilized by apple pieces

CHEN Tao1,2,MA Ying-kun2,CHEN Fu-sheng1,2*

1(Key Laboratory of Environment Correlative Dietology,Ministry of Education,Wuhan 430070,China)2(College of Food Science and Technology,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

Apple pieces were used as a carrier to embedLactobacillusL4-4 and L6-2 for soymilk fermentation and preparation of freeze-dried starter. Contents of flavor components with milk incense and fruitiness in the fermented soymilk from immobilized cells fermentation was more than that from free cells fermentation. In the continuous fermentation process, immobilized cells showed higher stable fermentation ability compared with free cells. The survival rate of immobilized cells after freeze drying was higher than that of free cells and reached over 78%, while its recovery efficiency didn't obviously decline.

apple pieces; immobilization; lactic acid bacteria; fermentation characteristics;freeze-dried starter

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705019

博士，講師(陳福生教授為通訊作者，E-mail:chenfs@mail.hzau.edu.cn)。

科技部國(guó)際科技合作與交流專(zhuān)項(xiàng)(2014DFG32380)；武漢市國(guó)際科技合作計(jì)劃(2015030809020368)；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)自主科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(2662014PY034)。

2016-12-06,改回日期：2017-01-07