基于聲化學(xué)效應(yīng)探究低頻超聲處理對溫州蜜柑汁殺菌及其品質(zhì)的影響

李申，馬亞琴,李楠楠，張震

(西南大學(xué) 柑桔研究所，國家柑桔工程技術(shù)中心，重慶，400712)

基于聲化學(xué)效應(yīng)探究低頻超聲處理對溫州蜜柑汁殺菌及其品質(zhì)的影響

李申，馬亞琴*,李楠楠，張震

(西南大學(xué) 柑桔研究所，國家柑桔工程技術(shù)中心，重慶，400712)

應(yīng)用低頻超聲波(25 kHz)處理寬皮柑橘(溫州蜜柑)汁，考察其對特征微生物菌群(細(xì)菌、霉菌、酵母、大腸菌群)的滅活效果，同時分析了低頻超聲波對橘汁品質(zhì)的影響。研究結(jié)果表明，超聲時間、超聲溫度、超聲功率均對殺菌率具有極顯著影響(P<0.01)，超聲殺菌處理最佳工藝條件為超聲溫度50 ℃，超聲時間40 min，超聲功率720 W；低頻超聲處理對橘汁糖酸成分無顯著性影響(P>0.05)，同時橘汁抗壞血酸、總酚，以及抗氧化能力均顯著高于巴氏殺菌橘汁(P<0.05)。低頻超聲技術(shù)具有提升橘汁品質(zhì)的潛在作用。

溫州蜜柑；低頻超聲；殺菌；品質(zhì)

柑橘是世界第一大貿(mào)易水果，我國的柑橘產(chǎn)量以及種植面積均居世界首位，其中寬皮柑橘產(chǎn)量最高，2015年產(chǎn)量高達(dá)1 850萬t，占世界寬皮柑橘總產(chǎn)量的三分之二以上，出口量超過世界出口量的三分之一[1]。我國寬皮柑橘以鮮食為主，貯藏期短，易造成嚴(yán)重的資源浪費[2]。

柑橘汁富含膳食纖維、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，以及黃酮、酚酸、香豆素、類胡蘿卜素、抗壞血酸等多種活性成分，對心腦血管疾病等慢性和退行性疾病具有潛在的預(yù)防與治療作用[3-4]。尤其是非濃縮還原汁，因其較好的保留了水果原有的營養(yǎng)與風(fēng)味，日益受到消費者的青睞。柑橘汁作為一種熱敏性食品，傳統(tǒng)熱殺菌雖能有效地殺滅微生物并抑制酶活，但高溫處理對果汁色澤、味道、營養(yǎng)成分以及活性物質(zhì)造成不同程度的破壞，加速色素降解，產(chǎn)生蒸煮異味，加劇褐變反應(yīng)，降低果汁新鮮度，甚至產(chǎn)生醛和環(huán)氧化合物，對果汁的安全性造成極大的危害和隱患[5-6]。因此，超聲波、輻照、超高壓、脈沖電泳、真空滲透脫水等非熱技術(shù)在果汁加工領(lǐng)域應(yīng)用的潛在可能性受到廣泛關(guān)注。

超聲波是指頻率為 20 kHz～500 MHz的聲波，超聲波的引入可引起介質(zhì)發(fā)生交替壓縮和伸張的機(jī)械震動，當(dāng)液體分子間的距離超過保持液體作用的臨界分子間距時會形成空穴氣泡，在超聲波的連續(xù)作用下，部分空穴氣泡會瞬間絕熱收縮至爆破，產(chǎn)生局部高溫、高壓(5 000～500 000 kPa)、強(qiáng)烈的剪切力等超聲波特有的聲化學(xué)效應(yīng)，同時引起質(zhì)點線性和非線性的交變震動，并伴隨機(jī)械剪切力以及自由基的產(chǎn)生[7]?？昭馀莸拇笮∨c超聲頻率的高低呈負(fù)相關(guān)，因此低頻超聲波(20 kHz～100 kHz)能產(chǎn)生較大的空穴氣泡，氣泡崩塌時比高頻超聲波(100 kHz～1 MHz)更為劇烈，具有更高的超聲能量，有利于促進(jìn)聲化學(xué)效應(yīng)的產(chǎn)生。當(dāng)超聲波應(yīng)用于果汁殺菌時，其能量可瞬間分布于果汁中，空穴氣泡絕熱收縮至爆破的瞬間過程，產(chǎn)生“熱點”效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜在變化的壓強(qiáng)條件下拉伸，破裂，并伴有膜電位的改變，因而在中低溫條件下具有顯著的殺菌效力，達(dá)到減緩熱效應(yīng)(降低熱殺菌溫度/縮短熱殺菌時間)和降低能耗的效果[8-9]。國內(nèi)外學(xué)者基于模擬體系和真實體系開展了眾多關(guān)于超聲技術(shù)的殺菌效力及其機(jī)理的研究[10-16]。超聲作為一種新的殺菌技術(shù)，與傳統(tǒng)熱殺菌相比，能減少熱效應(yīng)，降低能耗，有效地減少營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)的損失，尤其在糖度較高的果汁中，兼具良好的均質(zhì)效果，有潛力成為輔助甚至替代熱殺菌的新技術(shù)。

本研究選取溫州蜜柑為原料，考察低頻超聲處理對溫州蜜柑汁中主要微生物菌群(細(xì)菌、霉菌、酵母菌、大腸菌群)的滅活效果，探究不同超聲參數(shù)對超聲介質(zhì)物理效應(yīng)和化學(xué)效用的影響，并綜合評價該技術(shù)對溫州蜜柑汁品質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)菌測試片、霉菌/酵母菌測試片、大腸菌群測試片，3M中國有限公司；NaOH(分析純)，天津市風(fēng)船試劑有限公司；福林酚試劑(分析純)，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；草酸(分析純)，重慶川東化工試劑廠；乙醇、H3PO4、冰乙酸(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；抗壞血酸(標(biāo)準(zhǔn)品)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KH2PO3(色譜級)，阿拉丁試劑(上海)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl, DPPH)、2,4,6-反式-2-吡啶基三嗪(2,4,6-tri-2-pyridinyl-1,3,5-triazine; TPTZ)、甲醇(色譜級)，西格瑪奧德里奇(上海)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DP-800超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司；恒溫槽，寧波天恒儀器廠；4161榨汁機(jī)，美國Brown公司；Milli-Q Advantage A10超純水儀，美國Millipore公司；WAY-2S阿貝折射儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司；FE20實驗室PH計，梅特勒-托利多(上海)有限公司；TU-1901紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；UniCen MR高速離心機(jī)，德國Herolab公司；Color i5色差儀，瑞士Gretag Macbech公司；Ultimate 3000高效液相色譜，美國ThermoFisher公司；BT224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 寬皮柑橘(溫州蜜柑)汁制備

選取商業(yè)成熟度的溫州蜜柑(產(chǎn)自重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn))為試驗原料，洗凈、擦干并切半，用Brown手動榨汁機(jī)榨汁，經(jīng)80目無菌雙層紗布過濾后裝于無菌真空封裝袋，并用真空封裝機(jī)密封后待處理。

1.3.2 超聲處理

1.3.2.1 超聲位點選擇

選用實驗室規(guī)模超聲清洗設(shè)備，并與恒溫水域槽鏈接，以實現(xiàn)在超聲處理過程中對介質(zhì)溫度的調(diào)控。超聲換能器均勻分布于清洗槽底部。超聲場能量分布具有不均勻性以及動態(tài)變化性，參照朱攀攀等人[17]對超聲局部效應(yīng)的研究，選取距離超聲水域槽底部垂直距離為6 cm超聲輻射面，橫截面的中心位置，為樣品超聲處理位點，液面高度為12 cm(見圖1)。

圖1 超聲波設(shè)備示意圖Fig.1 Schematic diagram of ultrasonic irradiation at 25 kHz

1.3.2.2 低頻超聲技術(shù)參數(shù)試驗

超聲參數(shù)的選定是決定介質(zhì)化學(xué)和物理效應(yīng)產(chǎn)生與強(qiáng)弱的直接因素，選取超聲時間、超聲溫度、超聲強(qiáng)度、樣品處理量為考察參數(shù)，探究低頻高能超聲波(25 kHz)不同超聲參數(shù)對殺菌效果的影響及其作用機(jī)制，明確不同微生物菌群對低頻超聲波的敏感性及耐受度。(1)超聲溫度水平：10、20、30、40、50 ℃；(2)超聲功率水平：160、320、480、640、800 W；(3)樣品處理量：50、100、150、250 mL；(4)超聲聯(lián)合中溫效應(yīng)的殺菌效力探究。每組樣品重復(fù)處理3次。

1.3.3 微生物測定

1.3.3.1 細(xì)菌總數(shù)測定

用無菌水將超聲處理后的溫州蜜柑汁樣品稀釋到適當(dāng)濃度并混合均勻，精確吸取1 mL稀釋液，垂直滴加于細(xì)菌總數(shù)測試片中央，利用壓板模具使稀釋液均勻覆蓋于圓形培養(yǎng)皿面積上，靜置lmin使培養(yǎng)基凝固。將測試片置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計數(shù)。精確量取1 mL無菌水按以上操作步驟制作空白對照。測定方法參照《3M細(xì)菌總數(shù)測試片判讀手冊》。

1.3.3.2 霉菌/酵母菌測定

用無菌水將超聲處理后的溫州蜜柑汁樣品稀釋到適當(dāng)濃度并混合均勻，精確吸取1 mL稀釋液，垂直滴加在霉菌和酵母菌測試片中央，利用壓板模具使稀釋液均勻覆蓋于圓形培養(yǎng)皿面積上，靜置1 min使培養(yǎng)基凝固。將測試片置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后計數(shù)。精確量取1 mL無菌水按以上操作步驟制作空白對照。測定方法參照《3M霉菌和酵母菌測試片判讀手冊》。

1.3.3.3 大腸菌群測定

用無菌水將超聲處理后的溫州蜜柑汁樣品稀釋到適當(dāng)濃度并混合均勻，精確吸取1 mL稀釋液，垂直滴加在大腸菌群測試片中央，利用壓板模具使稀釋液均勻覆蓋于圓形培養(yǎng)皿面積上，靜置1 min使培養(yǎng)基凝固。將測試片置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后計數(shù)。精確量取1 mL無菌水按以上操作步驟制作空白對照。測定方法參照《3M大腸菌群測試片判讀手冊》。

1.3.3.4 殺菌率計算

低頻超聲處理后細(xì)菌、霉菌、酵母菌、大腸菌群的滅活效果用殺菌率(sterilizing rate，SR)表示，方程式如(1)所示。

(1)

式中：N0，超聲處理前樣品中目標(biāo)微生物菌群(細(xì)菌、霉菌、酵母菌、大腸菌群)菌落數(shù)，CFU/mL；NR：超聲處理后樣品中目標(biāo)微生物菌群(細(xì)菌、霉菌、酵母菌、大腸菌群)菌落數(shù)，CFU/mL。

1.3.4 可滴定酸測定

參照GB/T8210—2011《柑桔鮮果檢驗方法》中指示劑法測定[18]。精確吸取溫州蜜柑汁樣品25 mL，用蒸餾水稀釋至250 mL，搖勻。吸取稀釋后果汁10 mL，置于150 mL錐形瓶中，加1%酚酞2～3滴。用已標(biāo)定的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，30 s不褪色為終點。

1.3.5 pH值測定

使用梅特勒-托利多FE20型實驗室pH計測定。

1.3.6 可溶性固形物測定

依照GB/T8210—2011《柑桔鮮果檢驗方法》[18]中阿貝折射儀測法測定，測定結(jié)果統(tǒng)一校正到20 ℃條件下的數(shù)值。

1.3.7 光學(xué)性質(zhì)指標(biāo)測定

1.3.7.1 色值測定

使用Color i5色差儀測定寬皮柑橘汁L*、a*、b*值，各項指標(biāo)具體含義見參考文獻(xiàn)[19]。

1.3.7.2 總色差計算

通過L*、a*、b*計算得寬皮柑橘汁總色差值(ΔE)。ΔE表示溫州蜜柑汁總體色澤差異，值越大，差異程度越大，根據(jù)ΔE數(shù)值大小可分為：基本無差異(0～0.5)、細(xì)微差異(0.5～1.5)、易辨別的差異(1.5～3)、顯著差異(3.0～6.0)、極顯著差異(6.0～12.0)、不同顏色(12.0以上)，用于表示溫州蜜柑汁的顏色變化程度及褐變程度[20]。其計算公式如下：

(2)

1.3.7.3 褐變度(A420)測定

參照MEYDAV等人[21]的方法并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確量取4 mL溫州蜜柑汁樣品，加入等體積95%乙醇，并混合均勻，于4 ℃下以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min測定420 nm處的吸光度，所得吸光度即為該樣品的A420。

1.3.7.4 濁度(A660)測定

參照應(yīng)潔琦[16]的方法并加以改進(jìn)。準(zhǔn)確量取5 mL溫州蜜柑汁樣品，于4 ℃下以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min測定660 nm處的吸光度，所得吸光度即為該樣品的A660。

1.3.8 抗壞血酸(ascorbic acid; Vc)測定

參照SHINODA等人[22]的方法并加以改進(jìn)。采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測定。檢測條件：色譜柱：Waters C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Dionex)；流動相：0.05 mol/LKH2PO4(H3PO4調(diào)pH至3.5)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：245 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：25 μL。

Vc工作曲線繪制：精確稱取5 mg Vc標(biāo)準(zhǔn)品，用1 g/L草酸溶液定容至250 mL，搖勻，配制成20 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后備用。設(shè)定體積為0、10、20、30、40、60、80、100 μL的梯度進(jìn)樣序列，并在上述液相色譜條件下測定。以峰面積為橫坐標(biāo)，VC質(zhì)量為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1。

溫州蜜柑汁樣品測定：精確量取1 mL樣品，用1 g/1 000 mL草酸溶液稀釋至5 mL。于4 ℃下以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液過0.22 μm水系濾膜后待測。按上述液相條件測定樣品中VC含量(以mg/100 mL計算)。

表1 VC標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)

1.3.9 總酚含量測定

參照Folin-Ciocalteu法測定[23]，并加以改進(jìn)。將溫州蜜柑汁樣品于10 000 r/min離心20 min，精確量取上清液500 μL于25 mL具塞試管，蒸餾水稀釋至10 mL。加入0.5 mL 2 mol/L Foline-phenol試劑并充分震蕩，靜置5 min后加入5 mL濃度為5 g/100 mL的Na2CO3溶液，定容至25 mL，充分震蕩后暗室反應(yīng)30 min，在760 nm處測定最大吸光值。精確量取500 μL蒸餾水加入具塞試管，按以上操作步驟制作空白對照。

總酚工作曲線繪制：選取沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，精確稱量50 mg，用蒸餾定容至25 mL，配制成2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。用移液槍準(zhǔn)確移取0、20、40、80、100 μL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 ml具塞試管，用蒸餾水稀釋至10 mL。加入0.5 mL 2 mol/L Foline-phenol試劑并充分震蕩，靜置5 min后加入5 mL濃度為5 g/100 mL的Na2CO3溶液，定容至25 mL，充分震蕩后暗室反應(yīng)30 min，在760 nm處測定最大吸光值。以760 nm處吸光度為橫坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到總酚含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=328.38x+1.115 8(R2=0.995)，總酚含量以沒食子酸當(dāng)量表示(mg GAE/100 ml)。

1.3.10 抗氧化性測定

1.3.10.1 DPPH自由基清除能力

參照朱攀攀等人[17]的測定方法并加以修改。精確稱取39 mg DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容于100 mL容量瓶，配制成0.1 mmol/L DPPH工作液，備用。將溫州蜜柑汁于10 000 r/min離心20 min，精確量取50 μL上清液，與1.95 mL DPPH(0.1 mmol/L)工作液均勻混合后暗室反應(yīng)10 min，在517 nm處測定最大吸光值，記為A樣品。精確量取50 μL蒸餾水按以上操作步驟制作空白對照，記為A空白。DPPH自由基清除能力以下述公式表示：

(3)

1.3.10.2 鐵離子還原能力(ferric-reducing antioxidant power, FRAP)

參照朱攀攀等人[17]的測定方法并加以修改。將溫州蜜柑汁樣品于10 000 r/min離心20 min備用。精確量取50 μL樣品與2.45 mL FRAP工作液均勻混合后暗室反應(yīng)30 min，在593 nm處測定最大吸光值。精確量取50 μL蒸餾水按以上操作步驟制作空白對照。其中，F(xiàn)RAP工作液配制方法為：0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH 3.6)∶ 10 mmol/L TPTZ(溶于40 mmol/L HCl)∶20 mmol/LFeCl3=10 ∶ 1 ∶ 1(HCl體積比)。

FRAP工作曲線繪制：選取Trolox為標(biāo)準(zhǔn)品，精確稱量100 mg，用蒸餾水定容至250 mL，配制成400 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。用移液槍準(zhǔn)確移取0、25、50、75、100 μL Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，并用蒸餾水稀釋至100 μL，與4.9 mL FRAP工作液均勻混合后暗室反應(yīng)30 min，在593 nm處測定最大吸光值。以593 nm處吸光度為橫坐標(biāo)，Trolox質(zhì)量為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到FRAP標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：y=29.802x-4.106 2(R2=0.997)，抗氧化能力以Trolox當(dāng)量表示(mg TEAC/100 mL)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 低頻超聲處理對溫州蜜柑汁中微生物滅活效果的影響

2.1.1 超聲溫度對不同微生物滅活效果的影響

超聲溫度對霉菌、酵母菌、大腸菌群以及細(xì)菌4種目標(biāo)微生物群體的滅活率均具有極顯著影響(P<0.01)，同時霉菌、酵母菌的失活率隨超聲溫度的變化趨勢呈現(xiàn)出相似性，見圖2。大腸菌群的滅活率隨超聲溫度的升高而增加，且在同等溫度水平下其滅活率均高于霉菌和酵母菌，并在超聲溫度為40 ℃時，實現(xiàn)全部滅活。霉菌與酵母菌的臨界殺菌溫度均接近30 ℃，超聲溫度為30 ℃時，細(xì)菌總數(shù)僅下降4.44%，霉菌與酵母菌的滅活率分別為14.28%、18.93%，殺菌效果不理想，該結(jié)果與CHENG研究發(fā)現(xiàn)超聲在室溫條件下殺菌效果微弱具有一致性[15]。當(dāng)超聲溫度從30 ℃增加至40 ℃，殺菌效果顯著上升，細(xì)菌總數(shù)下降66.45%，同時霉菌、酵母菌的滅活率也分別達(dá)到85.71%和95.37%，為30 ℃超聲溫度條件下的5倍。3種菌群對超聲溫度敏感程度不同，可能由于其不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致，霉菌與酵母菌細(xì)胞壁的主要成分分別為幾丁質(zhì)和葡聚糖，均表現(xiàn)出較好的機(jī)械強(qiáng)度。大腸菌群屬G-細(xì)菌，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中缺乏磷壁酸，構(gòu)成細(xì)胞壁的肽聚糖網(wǎng)結(jié)構(gòu)疏松，機(jī)械強(qiáng)度差，導(dǎo)致其較低的抗逆性[24]。

圖2 超聲溫度對溫州蜜柑汁殺菌效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on sterilizing rate of mandarin juice at 25 kHz注：同種菌群標(biāo)注不同字母表示差異顯著，相同下標(biāo)數(shù)字表示同種菌群(P<0.05)。

2.1.2 超聲功率對目標(biāo)微生物滅活效果的影響

超聲功率直接決定聲場中的能量密度，是影響超聲場中物理和化學(xué)效應(yīng)的重要因素，亦是影響殺菌效果的最重要的因素之一。超聲功率對不同目標(biāo)微生物菌群殺菌率的影響見圖3A。結(jié)果表明，超聲功率較低時，酵母菌比大腸菌群和霉菌耐受力更強(qiáng)。四種目標(biāo)菌群的滅活率隨著超聲功率的增大均曾上升趨勢，其中細(xì)菌、霉菌、酵母菌在超聲功率為800 W時達(dá)到最高滅活率分別為95.66%、83.01%、46.94%，而大腸菌群在超聲功率為640 W時，已實現(xiàn)全部滅活，同時，VALERO等人[13]研究發(fā)現(xiàn)超聲環(huán)境中，嗜溫需氧菌致死率顯著高于霉菌和酵母菌。由于酵母菌細(xì)胞壁厚度可達(dá)25 nm，能更好地抵御超聲場中的機(jī)械破壞力，從而需要更高的鈍化臨界場強(qiáng)，G-比G+更易受到超聲波的影響也已被證實[11]。

分別對3種目標(biāo)菌群在不同超聲功率下的滅活效果進(jìn)行擬合，如圖3B所示，可得到3種目標(biāo)菌群的臨界滅活功率分別為：275、263、3 W。霉菌與酵母菌的臨界滅活功率相近，這可能源于二者均屬真菌均屬，具有相似的細(xì)胞機(jī)構(gòu)與滅活機(jī)制。FURUTA等[25]學(xué)者研究強(qiáng)調(diào)了超聲場中殺菌效力對空穴效應(yīng)引起的局部壓力、溫度的驟變以及剪切力與沖擊力的依賴性[26]；羥基自由基(·OH)的產(chǎn)生以及對細(xì)胞膜的破壞作用是高頻超聲具有殺菌效力的主要原因。與霉菌和酵母菌相比，大腸菌群對化學(xué)效應(yīng)有較高的耐受力，而對機(jī)械作用相對敏感[25]，其更低的臨界功率可能是由于低頻超聲波的殺菌機(jī)理更多依賴于壓力交變、局部高溫高壓等物理力效應(yīng)而非化學(xué)效應(yīng)，同時溫州蜜柑汁中抗氧化活性成分對超聲聲場中由·OH引起的化學(xué)效應(yīng)具有削弱作用，該現(xiàn)象是凸顯物理殺菌作用的另一個原因。

A:超聲功率對殺菌率的影響；B:超聲功率殺菌效果線性擬合圖3 超聲功率對溫州蜜柑汁殺菌效果的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on microbial inactivation of mandarin juice at 25 kHz注：同種微生物菌群標(biāo)注不同字母表示差異顯著，相同下標(biāo)數(shù)字表示同種菌群 (P<0.05)。

2.1.3 樣品處理量對目標(biāo)微生物滅活效果的影響

由圖4可知，樣品處理量對大腸菌群的殺菌率無影響，而對霉菌、酵母菌以及細(xì)菌總數(shù)的滅活率影響顯著(P<0.05)，3者的殺菌率隨處理量的上升呈下降趨勢，當(dāng)樣品處理量由50 mL增長至250 mL時，霉菌、酵母菌以及菌落總數(shù)的滅活率分別下降了17.06%、23.23%、15.25%。超聲場的不均勻性以及動態(tài)變化性應(yīng)該是導(dǎo)致該現(xiàn)象產(chǎn)生的主要原因，栗星等人[27]的研究也得到相似結(jié)論。樣品量的增加使得橘汁分布于不同強(qiáng)度的場強(qiáng)中，可能造成殺菌效果不均一現(xiàn)象的產(chǎn)生。

圖4 樣品處理量對溫州蜜柑汁殺菌效果的影響Fig.4 Effect of sample volumes on sterilizing rate of mandarin juice at 25 kHz注：同種微生物菌群標(biāo)注不同字母表示差異顯著，相同下標(biāo)數(shù)字表示同種菌群 (P<0.05)。

2.2 超聲聯(lián)合中溫技術(shù)的殺菌效力探究

圖5、圖6分別為在4 ℃與40 ℃的超聲溫度條件下，超聲時間對細(xì)菌、霉菌、酵母菌、大腸菌群滅活率的影響。在4 ℃的超聲條件下，4種目標(biāo)菌群殺菌率在超聲初期均呈現(xiàn)出滯后現(xiàn)象，并在處理時間達(dá)到30 min后，存活率急劇下降，超聲處理50 min后霉菌、酵母菌、大腸菌群與細(xì)菌總數(shù)的殺菌率分別達(dá)到54.54%、53.04%、47.50%、42.5%，該結(jié)果與王文宗、CHO等人[12, 28]的研究結(jié)果呈現(xiàn)出相似趨勢，但滯后時間相對較長，差異可能是由于殺菌體系不同導(dǎo)致，相較于模擬體系，橘汁成分的復(fù)雜性以粘滯阻力的差異，對超聲效果產(chǎn)生了一定的消減作用，超聲聯(lián)合中溫(40 ℃)技術(shù)的殺菌效果如圖6A所示。結(jié)果表明，超聲殺菌效力的滯后得以顯著改善，超聲處理30 min后，大腸菌群實現(xiàn)全部滅活，霉菌與酵母菌的殺菌率也分別達(dá)到84.76%和96.57%。在此基礎(chǔ)上，分別對4 ℃、40 ℃條件下殺菌效力進(jìn)行擬合(見圖5B、圖6B)，以探究中溫條件對超聲殺菌技術(shù)的輔助作用。相較于4 ℃，3種微生物菌群在40 ℃的超聲條件下，臨界殺菌分縮短了5.8、3.0和9.9 min，試驗證實中溫環(huán)境能有效的緩解超聲處理的滯后效應(yīng)，同時，超聲殺菌的滯后現(xiàn)象可聯(lián)合超高壓，脈沖電泳等技術(shù)得以緩解[29]。

A：超聲時間對殺菌率的影響；B：超聲時間殺菌效果線性擬合圖5 4 ℃時超聲時間對溫州蜜柑汁殺菌效果的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on microbial inactivation of mandarin juice at 25 kHz and 4 ℃注：同種微生物菌群標(biāo)注不同字母表示差異顯著，相同下標(biāo)數(shù)字表示同種菌群(P<0.05)。

A：超聲時間對殺菌率的影響；B：超聲時間殺菌效果線性擬合圖6 40 ℃時超聲時間對溫州蜜柑汁殺菌效果的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on microbial inactivation of mandarin juice at 25 kHz and 40 ℃注：同種微生物菌群標(biāo)注不同字母表示差異顯著，相同下標(biāo)數(shù)字表示同種菌群(P<0.05)。

2.3 低頻超聲技術(shù)對溫州蜜柑汁品質(zhì)的影響

2.3.1 殺菌方式對糖酸成分的影響

基于單因素試驗結(jié)果，選取超聲頻率25 kHz，超聲溫度為50 ℃，超聲功率為720 W，超聲時間為40 min，樣品處理量為150 mL的工藝條件處理溫州蜜柑汁，并比較分析低頻超聲波對橘汁品質(zhì)的影響。由表2可知，與巴氏殺菌橘汁相比，超聲處理后橘汁中可滴定酸、可溶性固形物、pH值沒有顯著差異(P>0.05)，表明超聲處理技術(shù)不會影響橘汁的基本酸甜口感，CHENG，應(yīng)潔琦等人[15-16]的研究與本文的研究結(jié)果具有一致性。

表2 殺菌方式對溫州蜜柑汁糖酸含量的影響

注：同列肩標(biāo)不同字母表示列組間有顯著差異(P<0.05)。

2.3.2 殺菌方式對溫州蜜柑汁光學(xué)性質(zhì)的影響

色澤是消費者衡量果汁整體品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)，亦是影響消費者購買欲的最重要的因素之一，同時也是反映果汁新鮮度以及衛(wèi)生狀況的重要指標(biāo)。色澤取決于果汁中天然色素的種類和含量，同時酶活、微生物活動均對其具有影響，感官評價法是評定果汁色澤最直觀的方法，但通常利用儀器設(shè)備能更客觀的評價果汁的光學(xué)性質(zhì)，常見評價指標(biāo)有色值、總色差、褐變度、濁度等。低頻超聲技術(shù)對溫州蜜柑汁光學(xué)特性的影響見表3。實驗結(jié)果表明，相較于巴氏殺菌，低頻超聲波能顯著改善橘汁亮度水平，進(jìn)而提升橘汁的商業(yè)價值。與之同時，低頻超聲技術(shù)對橘汁黃色色澤的保留與提升作用更為顯著(P<0.05)，超聲波產(chǎn)生的·OH引發(fā)呈色物質(zhì)的氧化還原反應(yīng)與異構(gòu)化可能是導(dǎo)致該變化的原因，空穴效應(yīng)對果汁色澤改變的影響作用已被證實[30]。低頻超聲處理對橘汁懸浮穩(wěn)定性體現(xiàn)出顯著的改善作用，溫州蜜柑汁濁度水平顯著提升，橘汁平均粒徑的降低是導(dǎo)致該現(xiàn)象產(chǎn)生的重要原因，同時超聲處理可達(dá)到抑制果膠甲酯酶的活性效果，有效抑制果膠的降解反應(yīng)，使溫州蜜柑汁穩(wěn)定性得以提升[31]。粒徑減小引起溫州蜜柑汁對光的吸收與折射性能的改變，是引發(fā)總色差顯著增加的潛在因素，同時超聲處理滅活酶和去除溶解氧的作用可抑制酶促褐變的發(fā)生，保持橘汁色澤的穩(wěn)定性，BHAT等[32]學(xué)者研究表明，超聲波技術(shù)引發(fā)的檸檬汁、橙汁色澤的微小改變不能被肉眼分辨。

表3 殺菌方式對溫州蜜柑汁光學(xué)性質(zhì)的影響

注：同列肩標(biāo)不同字母表示列組間有顯著差異(P<0.05)。

2.3.3 殺菌方式對溫州蜜柑汁活性成分及抗氧化性的影響

柑橘作物富含VC、酚酸、黃酮、黃酮醇等多種活性成分，被證實具有抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、預(yù)防心腦血管疾病以及消炎的作用[33]，酚類化合物是柑橘中主要抗氧化成分，VC也具有潛在抗氧化性[34]。低頻超聲波對橘汁活性成分與抗氧化性的影響如表4所示，低頻超聲波作為一種非熱加工技術(shù)，對熱敏性營養(yǎng)成分具有更好的保留效果，超聲處理橘汁VC含量顯著高于巴氏殺菌橘汁。超聲波產(chǎn)生的空穴效應(yīng)具有消除溶解氧的作用，能有效的抑制VC的有氧降解，降低脫氫抗壞血酸的積累水平，以脫氫抗壞血酸為底物的VC的無氧降解也受到間接抑制[35]。低頻超聲技術(shù)具有提升橘汁抗氧化能力的潛力， DPPH自由基清除能力比熱殺菌橘汁提高了9.7%，聲化學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的·OH在酚類等活性物質(zhì)的苯環(huán)結(jié)構(gòu)上已有羥基基團(tuán)的臨位或者對位添加，對該物質(zhì)抗氧化能力的增強(qiáng)作用已有報道[36]，同時低頻超聲技術(shù)的提取效應(yīng)引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)含物流出以及束縛態(tài)酚類物質(zhì)的釋放是引起總酚含量顯著上升的重要原因[10]。抗氧化活性成分含量的提升與活性的增強(qiáng)是橘汁營養(yǎng)價值提升的重要體現(xiàn)。

表4 殺菌方式對溫州蜜柑汁營活性成分及抗氧化性的影響

注：同列肩標(biāo)不同字母表示列組間有顯著差異(P<0.05)。

3 結(jié)論

低頻超聲波基于聲化學(xué)效應(yīng)，應(yīng)用于果汁加工領(lǐng)域產(chǎn)生有效的殺菌效果，超聲溫度和超聲功率均為影響效果的主要因素。不同微生物菌群對低頻超聲波具有不同的敏感度，在超聲溫度為40 ℃超聲時間為30 min的處理條件下，霉菌、酵母菌、與大腸菌群的臨界滅活功功率分別為 275、263、3 W，在該超聲溫度下，3種目標(biāo)菌群的臨界滅活時間分別為11.92、15.37、3.18 min，霉菌和酵母菌在超聲處理過程中表現(xiàn)出相近的耐受程度與變化趨勢，而大腸菌群對超聲最為敏感。溫州蜜柑汁經(jīng)超聲溫度50 ℃，超聲功率720 W，樣品處理量為150 mL，處理40min后，霉菌、酵母菌、大腸菌群滅活率分別達(dá)到99.43%、99.29%、100%、同時總殺菌率為99.65%，符合國標(biāo)中關(guān)于果蔬汁菌落總數(shù)安全限量(<100 CFU/100 mL)的要求。與傳統(tǒng)熱殺菌相比，低頻超聲技術(shù)在達(dá)到理想殺菌效果的同時，對溫州蜜柑汁的綜合品質(zhì)表現(xiàn)出一定的提升作用：懸浮穩(wěn)定性提升3倍；VC保留水平及總酚含量分別提高5.2%、3.3%；抗氧化能力提升9.7%；亮度以及黃色色值顯著提升。本研究結(jié)果證實了低頻超聲波技術(shù)在寬皮柑橘汁加工領(lǐng)域具有適用性及可行性，可以實現(xiàn)商業(yè)殺菌要求以及提升活性成分與營養(yǎng)成分保留率的需求。但處理時間較長是超聲技術(shù)在實際生產(chǎn)應(yīng)用中的技術(shù)瓶頸，超聲與中溫技術(shù)及其他非熱技術(shù)聯(lián)合運用可能有助于提高殺菌效果，解決該技術(shù)問題，也為超聲技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用于果汁殺菌領(lǐng)域提供了研究思路。在此研究基礎(chǔ)上，對不同種類微生物失活機(jī)制的系統(tǒng)研究也是非常必要和迫切。同時，探索超聲與其他殺菌技術(shù)如高壓脈沖、超高壓、紫外輻照等聯(lián)合殺菌的效果及對果汁品質(zhì)和貯藏特性的影響，通過考察關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，建立完善可靠的品質(zhì)預(yù)測模型對指導(dǎo)果蔬汁加工具有實際的指導(dǎo)意義。

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Effect of ultrasound treatment on microbial inactivation and mandarin (Citrusunshiu) juice quality at 25 kHz based on sonochemistry

LI Shen,MA Ya-qin*，LI Nan-nan,ZHANG Zhen

(Citrus Research Institute, Southwest University, National Citrus Engineering Research Center, Chongqing 400712, China)

The effect of ultrasound with 25 kHz frequency on inactivation of characteristic microorganism (germs, mold, yeast, coliform) and quality of mandarin (Citrusunshiu) juice was systematically studied. The results showed that ultrasonic time, ultrasonic temperature and ultrasonic power had highly significant effects (P<0.01) on microbial inactivation in mandarin juice based on single-factor experiment. The optimum ultrasonic sterilization condition was treatment with 720 W of ultrasonic power at 50 ℃ for 40 min. The effects of pasteurization and ultrasound on the quality of mandarin juice were comparatively analyzed. The yields of sugar and acids in juice treated by ultrasound showed non-significant changes (P>0.05). The yields of ascorbic acid and total phenolics, as well as antioxidant capacity in mandarin juice were higher (P<0.05) after ultrasonic treatment compared with pasteurization. The results exhibited that low frequent ultrasound had a potential effect on the improvements of qualities of mandarin juice.

Citrusunshiu; low frequency ultrasound; microbial inactivation; quality

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705018

碩士研究生(馬亞琴博士為通訊作者,E-mail：myaya211@163.com)。

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)柑橘產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-27-05B)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項(XDJK2015B004)

2016-08-14，改回日期：2016-09-21