荒漠昆蟲小胸鱉甲抗凍蛋白MpAFP698對釀酒酵母的低溫保護作用

張鳳娟，孫琳潔，李素麗，馬紀

(新疆大學 生命科學與技術(shù)學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊, 830046)

荒漠昆蟲小胸鱉甲抗凍蛋白MpAFP698對釀酒酵母的低溫保護作用

張鳳娟，孫琳潔，李素麗，馬紀*

(新疆大學 生命科學與技術(shù)學院，新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆 烏魯木齊, 830046)

昆蟲抗凍蛋白作為天然無毒副作用的低溫和冷凍保護劑，在發(fā)酵菌種的保藏方面具有很好應(yīng)用前景。為了驗證荒漠昆蟲小胸鱉甲(Microderapunctipennis)抗凍蛋白MpAFP698對酵母菌的抗凍和抗低溫保護效果，對MpAFP698抗凍蛋白進行原核表達和純化，獲得了具有活性的融合抗凍蛋白MBP-MpAFP698。將質(zhì)量濃度為1、10、30 μg/mL的MBP-MpAFP698添加到釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，在-7和-20 ℃冷凍處理酵母菌液不同時間；以10 μg/mL的抗凍蛋白在4、0、-50 ℃處理酵母菌液，在-20 ℃反復凍融處理，觀察菌落形態(tài)并統(tǒng)計菌種存活率。結(jié)果表明，添加抗凍蛋白組的酵母存活率顯著優(yōu)于未加抗凍蛋白的對照組，1 μg/mL就有保護效果，10 μg/mL保護效果最好，說明昆蟲抗凍蛋白能以極低的濃度發(fā)揮低溫保護作用。

荒漠昆蟲抗凍蛋白；釀酒酵母；抗凍保護；細胞存活

抗凍蛋白(antifreeze protein，AFP)是變溫生物為適應(yīng)嚴酷的寒冷環(huán)境而產(chǎn)生的?？箖龅鞍啄軌蚪档腿芤旱谋c但不改變其熔點，從而產(chǎn)生熔點與冰點之間的溫度差值，這個差值叫做熱滯活性(thermal hysteresis activity，THA)，其大小用于指示抗凍蛋白的活性[1-2]。AFP的主要功能包括抑制冰晶生長[3-4]、改變冰晶形態(tài)和抑制重結(jié)晶[5]，并且對細胞膜也有保護作用[6-11]。不同生物的抗凍蛋白活性差異巨大，其中昆蟲抗凍蛋白的熱滯活性最高[12]。

抗凍蛋白在細胞、精液、胚胎和卵巢組織的低溫保存中的研究[13-16]顯示出良好的應(yīng)用前景。2005年劉忠淵等發(fā)現(xiàn)，赤翅甲抗凍蛋白能夠提高細菌的耐寒能力[17]。2015年Hak Jun Kim發(fā)現(xiàn)，一種北極酵母的抗凍蛋白LeIBP可以提高低溫儲藏細胞的活性，緩解重結(jié)晶所造成的低溫損傷[18]?？箖龅鞍卓梢愿淖兝鋬霭l(fā)酵面團的質(zhì)地和烘焙面包的口感[19]，其主要機制是在低溫下保護了面團中的酵母菌。

利用昆蟲抗凍蛋白作為低溫保護劑，無毒副作用，并且昆蟲抗凍蛋白由于活性高，使用濃度微量，保存的菌種無需去除保護劑的特殊處理，對食品生產(chǎn)和加工尤其有利。我們利用新疆荒漠昆蟲小胸鱉甲抗凍蛋白MpAFP698進行釀酒酵母的低溫保護研究，該蛋白已經(jīng)被證明具有很好的熱滯活性和抗凍保護功能[20]。研究的目的是找出MpAFP698在不同低溫下的保護效果，以及最低有效濃度和有效保護時間。實驗用抗凍蛋白MBP-MpAFP698是通過重組質(zhì)粒pMAL-p2X-Mpafp698在大腸桿菌表達系統(tǒng)誘導表達和純化的融合蛋白，其中MBP是麥芽糖結(jié)合蛋白。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌BL21為本實驗室保存，重組質(zhì)粒pMAL-p2X-Mpafp698為本實驗室前期構(gòu)建保存。釀酒酵母(S.cerevisiae)由新疆大學生命科學與技術(shù)學院微生物教研室提供。

1.1.2 主要試劑

Amylose Resin購自Biolabs 公司；低分子量標準蛋白Marker、誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)購自北京經(jīng)科公司；蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)、溶菌酶(lysozyme)、Triton X-100和所有層析介質(zhì)均為Amersham Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品；配制Column Buffer(20 mmol/L的Ttis-HCl, 200 mmol/L的NaCl,1 mmol/L的EDTA)所需的試劑和其余常用試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0·5%酵母浸出粉，0.5%氯化鈉，高壓滅菌20 min。

YEPD培養(yǎng)基：2%蛋白胨，1%酵母浸出粉，2%葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 小胸鱉甲抗凍蛋白的重組表達、純化及活性鑒定

挑取轉(zhuǎn)化有重組表達質(zhì)粒pMAL-p2X-Mpafp698的單菌落，在LB培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，二次接菌培養(yǎng)至OD600=0.5，加入終濃度為0.5 μmol/L的IPTG，誘導表達融合表達蛋白MBP-MpAFP698。其中，MBP是麥牙糖結(jié)合蛋白。經(jīng)SDS-PAGE檢測到目的蛋白后，采用直鏈淀粉樹脂(amylose resin)親和層析法純化蛋白。采用Bradford法對純化的蛋白進行定量分析。使用納升滲透壓儀(OSMOMAT 030)觀察在MBP-MpAFP698存在的情況下冰晶的形態(tài)。

1.2.2 MBP-MpAFP698處理酵母的生長曲線與形態(tài)觀察

將10 μg/mL的MBP-MpAFP698蛋白加入二次活化的200 μL釀酒酵母菌液中，以不加MBP-MpAFP698的釀酒酵母作為對照，27 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔8 h檢測OD600的吸光值，測到36 h后制作釀酒酵母生長曲線。在培養(yǎng)12、24 h時分別取出菌液通過100×高倍鏡觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 MBP-MpAFP698對釀酒酵母的低溫保護作用分析

取新鮮制備的酵母一級菌液按1%接種于YEPD培養(yǎng)基中，菌液培養(yǎng)至OD600=1.0。用無菌雙蒸水稀釋菌液1O-5倍，分別加入終質(zhì)量濃度為1、10、30 μg/mL的MBP-MpAFP698和30 μg/mL對照蛋白MBP，分別置于-7和-20 ℃下凍存。每隔24 h取出凍存管，融化后吸取100 μL在直徑9 cm的YEPD平板上均勻涂布，每組3個重復，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h，進行菌落計數(shù)。選取10 μg/mL的MBP-MpAFP698檢測在-50、0和4 ℃時其對酵母菌的保護作用，通過菌落計數(shù)測得釀酒酵母的存活率。

反復凍融處理：在釀酒酵母中添加10 μg/mL的抗凍蛋白，將菌液置于-20 ℃，每隔10 d取出100 μL涂板后，菌液放回-20 ℃繼續(xù)冷凍，反復凍融50 d。一次性凍融處理：將加入10 μg/mL 抗凍蛋白的菌液混勻，平均分裝成若干等份，每隔10 d取1份涂板，實驗進行50 d。進行菌落計數(shù)，分別觀察反復凍融和不經(jīng)反復凍融的菌液最長保存時間。

利用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0進行分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計方法為雙因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小胸鱉甲抗凍蛋白MBP-MPAFP698的原核表達與純化

將重組質(zhì)粒pMAL-p2X-Mpafp698轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在37 ℃，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導培養(yǎng)4 h后，收集菌體進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。結(jié)果表明MBP-MpAFP698蛋白在上清和沉淀中均有表達(圖1A)，其中MBP為麥芽糖結(jié)合蛋白融合標簽，其分子質(zhì)量約為43 kDa，MpAFP698蛋白分子量約為11 kDa。在約為54 kDa處出現(xiàn)1條特異的條帶，其大小與預期相符，說明MBP-MpAFP698已在大腸桿菌中得到表達。純化后的抗凍蛋白在SDS-PAGE電泳圖上顯示為單一條帶(圖1B)。使用納升滲透壓儀觀察MBP-MpAFP698對冰晶形態(tài)的影響(圖1C)，結(jié)果顯示，抗凍蛋白溶液的冰晶近似棱形，對照PBS緩沖液的近似圓形，說明MBP-MpAFP698抗凍蛋白具有改變冰晶形態(tài)的活性。

2.2 MBP-MpAFP698對釀酒酵母生長的影響

在利用抗凍蛋白進行釀酒酵母低溫保護實驗之前，需要先評估抗凍蛋白作為防凍劑是否影響釀酒酵母的生長。培養(yǎng)液中加入10 μg/mL抗凍蛋白的實驗組和不加抗凍蛋白的對照組酵母生長曲線顯示，2條生長曲線幾乎重合(圖2A)，表明抗凍蛋白對酵母在常溫條件下的培養(yǎng)與對照組無差異，即對酵母生長無影響。在培養(yǎng)12 h和24 h后，在高倍顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，2組之間沒有顯示差異(圖2B)。

圖2 在釀酒酵母菌液中添加或不添加抗凍蛋白培養(yǎng)12 h和24 h后的酵母形態(tài)Fig.2 Morphology of S. cerevisiae after culturing for 12 h and 24 h with or without MBP-MpAFP698

2.3 不同濃度MBP-MpAFP698對釀酒酵母在-7 ℃和-20 ℃的保護作用

將不同濃度的MBP-MpAFP698作為抗凍保護劑添加到酵母菌液中，置于-7 ℃和-20 ℃凍存處理，每天涂板進行菌落計數(shù)，計算細胞存活率(圖3)。結(jié)果表明，在-7 ℃處理2 d時，實驗組的平均存活率為85%，而對照組約40%。在處理的第4天，實驗組的存活率平均為40%，對照組僅為5%(圖3A)。在-20 ℃處理2 d時，實驗組的平均存活率為60%，而對照組為30%。在處理的第4天，實驗組的存活率平均為25%，對照組為0(圖3B)。表明MBP-MpAFP698對釀酒酵母在-7和-20 ℃都有顯著的保護效果(在-7 ℃，F(xiàn)3,21=6.3，P<0.05；在-20 ℃，F(xiàn)3,21=7.253，P<0.05)。實驗結(jié)果也顯示，隨著在低溫下處理時間的延長，各組之間也有顯著差異(在-7 ℃，F(xiàn)7,21=27.187，P<0.05；在-20 ℃，F(xiàn)7,21=68.793，P<0.05)。比較不同濃度MBP-MpAFP698的保護效果，從圖3A和圖3B可以看出，10 μg/mL的保護效果好于其他濃度，從而確定最佳保護濃度為10 μg/mL。實驗結(jié)果也顯示，濃度為1 μg/mL時MBP-MpAFP698也有顯著的保護效果，說明荒漠昆蟲抗凍蛋白具有極高的活性。

圖3 不同濃度MBP-MpAFP698對釀酒酵母在-7 ℃(A)和-20 ℃(B)的抗凍保護效果Fig.3 Antifreeze protective effect of MBP-MpAFP698 at different concentrations on S. cerevisiae at -7 ℃(A) and -20 ℃(B)

2.4 MBP-MpAFP698對釀酒酵母在-50、0和4 ℃保存的影響

選取濃度為10 μg/mL的抗凍蛋白檢測其在-50 ℃時的保護效果(圖4A)。結(jié)果表明，處理第2天實驗組存活率為60%，經(jīng)過反復凍融保存期長達7天以上，而對照組第2天存活率約為30%，在第4天存活率接近0。實驗組與對照組存活率差異顯著(F1,7=11.811,P<0.05)，表明10 μg/mL MBP-MpAFP698抗凍蛋白在-50 ℃對酵母仍有顯著的保護效果。處理組和對照組平板培養(yǎng)的菌落生長結(jié)果顯示，抗凍蛋白組的菌落數(shù)顯著多于對照組(圖4B)。

A- -50 ℃時對酵母存活率的統(tǒng)計;B-在處理第1、2、3天時菌落生長觀察，每個培養(yǎng)皿上標注1表示添加10 μg/mL MBP-MpAFP698，標注2是添加10 μg/mL MBP對照蛋白圖4 10 μg/mL MBP-MpAFP698在-50 ℃對釀酒酵母的抗凍保護效果Fig.4 Antifreeze protective effect of MBP-MpAFP698 at 10 μg/mL on S. cerevisiae at -50 ℃

為了檢驗MBP-MpAFP698在0 ℃以上是否對酵母菌也有保護作用，將添加抗凍蛋白和對照蛋白MBP的菌液分別置于0 ℃和4 ℃處理，每隔5天涂板培養(yǎng)，進行菌落計數(shù)(圖5)。結(jié)果顯示，隨著處理時間的延長，存活率逐漸下降，實驗組與對照組顯著差異(在0 ℃,F1,5=12.349,P<0.01; 在4 ℃,F1,5=7.993,P<0.01)?？梢钥闯鲈? ℃和4 ℃抗凍蛋白MBP-MpAFP698對酵母的保護效果顯著。

圖5 10 μg/mL MBP-MpAFP698抗凍蛋白在4 ℃和0 ℃對釀酒酵母的低溫保護效果Fig.5 Low temperature protective effect of MBP-MpAFP698 at 10 μg/mL on S. cerevisiae at 4 ℃ and 0 ℃

2.5 MBP-MpAFP698在-20 ℃抗重結(jié)晶保護作用

分別以常用抗凍保護劑甘油和MBP蛋白作為對照，以10 μg/mL MBP-MpAFP698作為處理組，在-20 ℃進行反復凍融和一次凍融處理，分析MBP-MpAFP698抗重結(jié)晶的效果。結(jié)果表明，在兩種處理條件下，抗凍蛋白的保護效果均高于對照組甘油和MBP蛋白。其中一次凍融組抗凍蛋白和甘油的保護效果都分別好于反復凍融組。處理20 d時，一次性凍融處理中抗凍蛋白組的存活率是78%，甘油組是40%；在反復凍融處理中，抗凍蛋白組的存活率是50%，甘油組是30%(圖6)。在2種條件下，MBP-MpAFP698的保護效果都顯著高于甘油及對照蛋白(F3,15=11.84,P<0.01)，表明抗凍蛋白的抗重結(jié)晶保護效果顯著，存活天數(shù)在50 d以上。

圖6 MBP-MpAFP698對酵母菌在-20 ℃反復凍融的保護效果Fig.6 Protective effect of MBP-MpAFP698 on S. cerevisiae at -20 ℃ with repeated freeze-thaw

3 討論

目前抗凍蛋白的應(yīng)用多處于實驗室研究階段，不能夠獲得充足有活性的抗凍蛋白可能是主要原因，而以原材料提取抗凍蛋白的方法成本極大。利用基因工程方法為昆蟲抗凍蛋白的應(yīng)用提供了可能。本研究采用大腸桿菌原核表達體系，及Amylose Resin親和層析純化獲得了較純的融合抗凍蛋白MBP-MpAFP698，通過納升滲透壓儀觀察抗凍蛋白的冰晶形態(tài)，冰晶呈細棱狀，結(jié)果與抗凍蛋白的冰晶形態(tài)效應(yīng)一致[21], 說明重組表達的MBP-MpAFP698蛋白具有較高活性。

抗凍蛋白作為抗凍保護劑，不但效果好而且無毒性[22]，我們對酵母生長曲線的研究表明小胸鱉甲抗凍蛋白對酵母生長無不良影響?？箖龅鞍鬃鳛槔ハx的天然抗凍保護劑，無毒無害，可作為一種新型食品添加劑，為今后抗凍蛋白作為防凍劑在菌種保存中的應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。

研究不同質(zhì)量濃度MBP-MpAFP698(1、10、30 μg/mL)在-20 ℃和-7 ℃對釀酒酵母的凍存保護效果表明，不同濃度的抗凍蛋白對酵母菌都有較好的保護效果，當濃度為10 μg/mL時保護效果最佳，這說明抗凍蛋白的保護作用和濃度沒有線性關(guān)系，這與REGAND的研究結(jié)果相類似[23]。我們前期研究結(jié)果顯示MBP-MpAFP698蛋白可以顯著地改善冷凍小鼠肝臟等器官的細胞形態(tài)，并且在酵母中誘導表達的MpAFP698蛋白和外源添加的MpAFP698蛋白對酵母菌在-7 ℃和-20 ℃有較好的低溫保護效果[24-25]。QADDER等人用赤翅甲抗凍蛋白(DAFPs)研究其對牛精液的耐凍性和生育能力時使用的蛋白濃度也為10 μg/mL[26]，并且效果顯著，而使用魚類typeⅢAFP對小鼠卵巢組織進行低溫儲藏時，Jung Ryeol Lee等人發(fā)現(xiàn)蛋白濃度為20 mg/mL時卵泡的凋亡率與對照組相比差異顯著[27]，與這些低溫保護劑相比，昆蟲抗凍蛋白在較低的10 μg/mL就有較高的低溫保護效果，提示昆蟲抗凍蛋白的熱滯活性是魚類抗凍蛋白的數(shù)千倍，雖然由于實驗條件不同，不宜簡單比較，但確實表明昆蟲抗凍蛋白的超高活性[28～30]。在此基礎(chǔ)上，選取濃度10 μg/mL分別在4和0 ℃進行菌種保存實驗，結(jié)果表明在短時間內(nèi)實驗組與對照組差異顯著，長期0 ℃和4 ℃低溫，對細胞會造成寒害，此時抗凍蛋白發(fā)揮保護作用。我們之前研究表明小胸鱉甲抗凍蛋白可降低小鼠血細胞在4 ℃的溶血率[24]，表明其還具有非結(jié)冰的低溫保護作用。

在證明抗凍蛋白具有酵母抗凍保護作用的基礎(chǔ)上，我們進一步探討了其在-20 ℃對酵母的抗重結(jié)晶保護效果。反復凍融是細胞凍存中經(jīng)常面臨的問題，與常規(guī)低溫保護劑甘油相比，小胸鱉甲昆蟲抗凍蛋白MBP-MpAFP698顯示了很高的抗重結(jié)晶保護作用。文獻報道，植物抗凍蛋白主要具有抗重結(jié)晶活性，而昆蟲抗凍蛋白主要具有很高熱滯活性[28-30]，本文首次證明，昆蟲抗凍蛋白也具有極強的抗重結(jié)晶活性，這對抗凍蛋白的應(yīng)用具有重要意義。

通過低溫冷藏實驗發(fā)現(xiàn)小胸鱉甲昆蟲抗凍蛋白MBP-MpAFP698的濃度在10 μg/mL就對酵母菌有較好的低溫保護作用，在4、0、-7、-20和-50 ℃都具有顯著的保護效果，并且抗凍蛋白作為冷凍添加劑對細胞的生長的沒有影響，而反復凍融實驗也證明昆蟲抗凍蛋白具有極強的抗重結(jié)晶活性。研究結(jié)果為開發(fā)新一代低溫保護劑提供了理論基礎(chǔ)。

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Cryoprotective effect of antifreeze protein MpAFP698 from the desertinsectMicroderapunctipennison yeastSaccharomycescerevisiae

ZHANG Feng-juan, SUN Lin-jie, LI Su-li, MA Ji*

(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering,College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046，China)

Antifreeze proteins as non-toxic cryoprotective agents have extensive prospect in fermentation strain preservation. To test the cryoprotective effect of antifreeze protein MpAFP698 from the desert beetleMicroderapunctipennisonS.cerevisiae, antifreeze protein MpAFP698 was prokaryotic expressed and purified. Fusion protein MBP-MpAFP698 with high activity was obtained. 1, 10, 30 μg/mL of MBP-MpAFP698 were added toS.cerevisiaeand then treated at -7 and -20 ℃ for different time lengths; in other experiments yeast cells were treated at 4, 0, -50 ℃ for different time lengths with 10 μg/mL MpAFP698 as well as repeated freeze-thaw at -20 ℃. The morphology and survival rate of the yeast cells after these treatments were observed or calculated. The results showed that the survival rate ofS.cerevisiaewith the protection of MBP-MpAFP698 were significantly better than the control group without MBP-MpAFP698. Even the concentration of 1g/mL showed protective effect, and 10g/mL showed the best protective effect, indicating that insect antifreeze protein can function as cyroprotective agent at very low concentrations. This result lay a foundation for the development of efficient protective agent at low temperatures.

desert insect antifreeze protein;Saccharomycescerevisiae; antifreeze protection; cell survival

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705007

碩士研究生(馬紀教授為通訊作者，E-majiuci@xju.edu.cn)。

國家自然科學基金(31360527)

2016-11-21,改回日期：2017-01-05