脂肪酸單甘油酯的酶催化合成及其表征

王楠，吳望波，張桂菊，王瑞，徐寶財(cái)

(北京工商大學(xué) 食品學(xué)院，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京, 100048)

脂肪酸單甘油酯的酶催化合成及其表征

王楠，吳望波，張桂菊*，王瑞，徐寶財(cái)*

(北京工商大學(xué) 食品學(xué)院，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京, 100048)

以癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯為原料，與甘油進(jìn)行脂肪酶催化酯交換反應(yīng)制備脂肪酸單甘油酯，產(chǎn)物為脂肪酸單甘油酯和少量脂肪酸雙甘油酯的混合物，其中脂肪酸單甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在91%以上，最高可達(dá)95.9%。隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加，脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率降低，脂肪酸單甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也降低。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)、核磁共振氫譜和紅外光譜，對(duì)柱層析分離后的脂肪酸單甘油酯進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。

脂肪酸單甘油酯；脂肪酸甲酯；酶催化合成；酯交換反應(yīng)

脂肪酸單甘油酯是全球需求量最大的非離子乳化劑，主要應(yīng)用于食品、化妝品及制藥工業(yè)，其中70%用于食品工業(yè)。脂肪酸單甘油酯的制備方法主要有化學(xué)法和酶催化法。化學(xué)法是在高溫(220～260 ℃)及堿催化劑條件下，由動(dòng)植物油脂經(jīng)甘油解反應(yīng)制得[1]。該方法反應(yīng)溫度高、能耗大，而且副反應(yīng)多，產(chǎn)品的質(zhì)量差、顏色深，所得產(chǎn)物為脂肪酸單甘油酯、雙甘油酯和三甘油酯的混合物，單甘油酯的純度一般為45%～55%[2]。酶催化法制備脂肪酸單甘油酯，反應(yīng)條件溫和、選擇性高、產(chǎn)品質(zhì)量好，是科學(xué)家們廣泛關(guān)注的研究熱點(diǎn)。酶催化法合成脂肪酸單甘油酯主要有酯化法、甘油解法、水解法和酯交換法等，其中甘油解法由于原子經(jīng)濟(jì)性高備受關(guān)注[3-4]，所得產(chǎn)物中脂肪酸單甘油酯的純度可達(dá)65%～80%[5-8]。這可以滿足一般實(shí)際應(yīng)用的需求，但是在人造黃油、起酥油、冰淇淋和奶油等食品加工中，要求脂肪酸單甘油酯的純度達(dá)到90%以上，因此需要通過高能耗、高成本的分子蒸餾進(jìn)行分離提純，以獲得高純度的脂肪酸單甘油酯[9-12]。此外，可采用基團(tuán)保護(hù)法制備高純度脂肪酸單甘油酯，即選用丙酮、硼酸等基團(tuán)保護(hù)劑將甘油的其中兩個(gè)羥基保護(hù)起來，剩余1個(gè)羥基與脂肪酸及其衍生物發(fā)生反應(yīng)，可制備純度高于90%的脂肪酸單甘油酯[13-16]。但這種方法額外增加了保護(hù)與脫除保護(hù)的過程，無疑會(huì)增加成本。

采用脂肪酸甲酯與甘油的酶催化酯交換反應(yīng)，選擇性高，可獲得高純度的脂肪酸單甘油酯[17]。本研究分別以癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯及硬脂酸甲酯為原料，叔丁醇作為反應(yīng)溶劑，在固定化脂肪酶催化作用下與甘油進(jìn)行酯交換反應(yīng)制備脂肪酸單甘油酯，并對(duì)5種脂肪酸單甘油酯進(jìn)行了提純和結(jié)構(gòu)表征。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯(純度>99%，百靈威科技有限公司)；叔丁醇、甘油(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈、丙酮(色譜純，北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心)；固定化脂肪酶(Novozyme 435，丹麥諾維信生物技術(shù)有限公司)。

立式恒溫振蕩器(IS-RSV1)，蘇州精騏有限公司；高效液相色譜(Agilent1200)，安捷倫科技有限公司；電子天平(BSA423S)，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet iS10)，賽默飛世爾科技有限公司)；核磁共振儀(AV300 MHz，德國 Bruker 公司)；三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC7890/7000B，安捷倫科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 脂肪酸單甘油酯的合成

50 mL具塞錐形瓶中，依次加入5 g脂肪酸甲酯和一定量的甘油、叔丁醇，其中底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(脂肪酸甲酯相對(duì)于叔丁醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù))為30%，底物摩爾比(脂肪酸甲酯與甘油的摩爾比)為1∶5，再加入Novozyme 435脂肪酶，酶添加量(相對(duì)于脂肪酸甲酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù))為7%，待體系混合均勻，置于立式恒溫振蕩器，設(shè)置反應(yīng)溫度55 ℃、振蕩器轉(zhuǎn)速220 r/min，開始反應(yīng)，并分別于反應(yīng)開始后10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、1 h、1.5 h、2 h、4 h取樣進(jìn)行液相色譜分析。

反應(yīng)結(jié)束后，過濾，回收脂肪酶，濾液中加入50 mL乙醇/蒸餾水(40∶10，v/v)，用30 mL正己烷萃取3次，合并正己烷相，旋蒸除去溶劑，回收未反應(yīng)的脂肪酸甲酯。乙醇/水相用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相，旋蒸，得白色粉末狀固體，用液相色譜(HPLC)分析脂肪酸單甘油酯和脂肪酸雙甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.2 脂肪酸單甘油酯的提純

柱層析分離方法參照文獻(xiàn)[18-19]。稱取30 g硅膠加入100 mL石油醚中，然后裝入玻璃層析柱(φ3 cm×40 cm)，稱取2 g脂肪酸單甘油酯樣品溶于石油醚，并加入層析柱中。先后采用不同比例的石油醚∶乙酸乙酯(體積比分別為5∶1, 1∶1)進(jìn)行梯度洗脫，依次得到脂肪酸雙甘油酯和脂肪酸單甘油酯，旋蒸除去溶劑，待分析。

1.2.3 脂肪酸單甘油酯的液相色譜分析

采用高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器(HPLC-RID)對(duì)原料脂肪酸甲酯及反應(yīng)中生成的脂肪酸單甘油酯、脂肪酸雙甘油酯進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；分析條件：柱溫為35 ℃，流動(dòng)相為乙腈/丙酮(1∶1，v/v)，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)器溫度為40 ℃。

1.2.4 脂肪酸單甘油酯的表征

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)(GC-MS)分析：EI全掃描，He作為載氣。進(jìn)樣器溫度50 ℃，檢測(cè)器溫度250 ℃，總流量22 mL/min，進(jìn)樣量為1.0 μL，分流比20∶1，隔墊吹掃流量3 mL/min，離子源溫度230 ℃。溶劑延遲時(shí)間4 min；掃描范圍40～500 amu。升溫程序：從50 ℃以30 ℃/min的速度升到220 ℃，再以2 ℃/min升到250 ℃保持5 min，再以15 ℃/min升溫到290 ℃。

核磁共振氫譜(1H-NMR)分析：將5種脂肪酸單甘油酯樣品用氘代氯仿配成相應(yīng)的溶液，采用Bruker AV300MHz核磁共振譜分析儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

紅外光譜(IR)分析：采取KBr壓片法，取脂肪酸單甘油酯樣品與KBr混勻壓成薄片，采用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行紅外光譜分析，測(cè)試波數(shù)范圍4 000～400 cm-1。

2 結(jié)果和討論

2.1 脂肪酸單甘油酯的合成

癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯分別與甘油進(jìn)行酶催化反應(yīng)合成脂肪酸單甘油酯，反應(yīng)體系中原料脂肪酸甲酯及生成的脂肪酸單甘油酯和脂肪酸雙甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨反應(yīng)時(shí)間的變化如圖1～圖5所示。

圖1 癸酸單甘油酯的合成Fig.1 The synthesis of glycerol monocaprate

圖2 月桂酸單甘油酯的合成Fig.2 The synthesis of glycerol monolaurate

圖3 肉豆蔻酸單甘油酯的合成Fig.3 The synthesis of glycerol monomyristate

圖4 棕櫚酸單甘油酯的合成Fig.4 The synthesis of glycerol monopalmitate

圖5 硬脂酸單甘油酯的合成Fig.5 The synthesis of glycerol monostearate

從圖1-圖5可以看出，反應(yīng)剛開始時(shí)脂肪酸甲酯和甘油的反應(yīng)速率很快，30 min時(shí)反應(yīng)體系中脂肪酸單甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)即可達(dá)50%左右。之后反應(yīng)速率降低，1 h后反應(yīng)達(dá)到平衡，脂肪酸甲酯、脂肪酸單甘油酯及脂肪酸雙甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本保持不變。反應(yīng)達(dá)到平衡后反應(yīng)體系中脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率及脂肪酸單甘油酯和雙甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。經(jīng)過后處理回收未反應(yīng)的脂肪酸甲酯，產(chǎn)物中脂肪酸單甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也見表1。

表1 脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率及脂肪酸單甘油酯和雙甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

從表1中可知，癸酸甲酯的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到了76.2%，硬脂酸甲酯的轉(zhuǎn)化率最低為69.3%。反應(yīng)達(dá)到平衡后，體系中癸酸單甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為73.1%，而癸酸雙甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為3.1%；硬脂酸單甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低為63.3%，而硬脂酸雙甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.1%。以上數(shù)據(jù)表明，在脂肪酸甲酯與甘油的酶催化酯交換反應(yīng)中，選擇性高，脂肪酸單甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均可達(dá)91%以上，其中癸酸單甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為95.9%。不同的碳鏈長(zhǎng)度對(duì)脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率及反應(yīng)的選擇性均有一定的影響，碳鏈越長(zhǎng)，脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率越低，所得的脂肪酸單甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也越低[20]。

2.2 脂肪酸單甘油酯的表征

酶催化反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)后處理回收未反應(yīng)的月桂酸甲酯，所得產(chǎn)物為脂肪酸單甘油酯和少量脂肪酸雙甘油酯的混合物。按照1.2.2部分的方法經(jīng)柱層析分離提純，除去脂肪酸雙甘油酯，得脂肪酸單甘油酯純品，采用GC-MS和1HNMR、IR進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

2.2.1 GC-MS分析

5種脂肪酸單甘油酯的GC-MS分析結(jié)果如圖6所示。

A-癸酸單甘油酯；B-月桂酸單甘油酯；C-肉豆蔻酸單甘油酯；D-棕櫚酸單甘油酯；E-硬脂酸單甘油酯圖6 脂肪酸單甘油酯的GC-MS總離子流圖Fig.6 GC-MS total ion chromatorgraphy of fatty acid monoglycerides

從圖6可以看出，癸酸單甘油酯的保留時(shí)間為7.77 min，峰面積百分比為99.6%；月桂酸單甘油酯的保留時(shí)間為9.53 min，峰面積百分比為99.6%；肉豆酸單甘油酯的保留時(shí)間為12.20 min，峰面積百分比為99.7%；棕櫚酸單甘油酯的保留時(shí)間為16.09 min，峰面積百分比為99.7%；硬脂酸單甘油酯的保留時(shí)間為20.66 min，峰面積百分比為99.3%。

癸酸單甘油酯(EI-MSm/z)：215.1，173.1，155.1，134，98；月桂酸單甘油酯(EI-MSm/z)：243.1，201.1，183.1，134，98；肉豆酸單甘油酯(EI-MSm/z)：271，229.1，211.1，134，98；棕櫚酸單甘油酯(EI-MSm/z)：299.1，257.1，239.2，134，98；硬脂酸單甘油酯(EI-MSm/z)：327.1，285.1，267.2，134，98。EI-MS碎片離子峰符合脂肪酸單甘油酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。

2.2.21H-NMR分析

5種脂肪酸單甘油酯樣品的1H-NMR分析結(jié)果如圖7所示。

A-癸酸單甘油酯；B-月桂酸單甘油酯；C-肉豆蔻酸單甘油酯；D-棕櫚酸單甘油酯；E-硬脂酸單甘油酯圖7 脂肪酸單甘油酯的1H-NMR圖Fig.7 1H-NMR spectra of fatty acid monoglycerides

癸酸單甘油酯 (CDCl3，300 MHz)，δ：0.884 (t，J = 13.2 Hz，3H，CH3)，1.268 (m，12H， 6CH2)，1.632 (m，2H，CH2)，2.356 (t，J = 15.3 Hz，2H，CH2CO)，3.602 (dd，J = 6.0，5.7 Hz，1H，CHOH)，3.705 (dd，J = 3.9，3.9 Hz，1H，CHOH)，3.938 (m，1H，CHOH)，4.179 (m，2H，CH2OCO)。

月桂酸單甘油酯 (CDCl3，300MHz)，δ：0.886 (t，J = 13.2 Hz，3H，CH3)，1.264 (m，16H，8CH2)，1.634 (m，2H，CH2)，2.357 (t，J = 15.0 Hz，2H，CH2CO)，3.604 (dd，J = 5.7，5.7 Hz，1H，CHOH)，3.707 (dd，J = 3.9，3.9 Hz，1H，CHOH)，3.940 (m，1H，CHOH)，4.181 (m，2H，CH2OCO)。

肉豆蔻酸單甘油酯 (CDCl3，300MHz)，δ：0.882 (t，J = 13.2 Hz，3H，CH3)，1.258 (m，20H，10CH2)，1.627 (m，2H，CH2)，2.351 (t，J = 15.0 Hz，2H，CH2CO)，2.566 (bs，2H，OH)，3.596 (dd， J=6.0，5.7 Hz，1H，CHOH)，3.700 (dd，J=3.9，3.9 Hz，1H，CHOH)，3.933 (m，1H，CHOH)，4.171 (m，2H，CH2OCO)。

棕櫚酸單甘油酯 (CDCl3，300MHz)，δ：0.888 (t，J = 13.2 Hz，3H，CH3)，1.263 (m，24H，12CH2)，1.637 (m，2H，CH2)，2.205 (bs，2H，OH)，2.361 (t，J = 15.0 Hz，2H，CH2CO)，3.609 (dd，J=6.0，5.7 Hz，1H，CHOH)，3.689 (dd，J = 3.9，3.9 Hz，1H，CHOH)，3.944 (m，1H，CHOH)，4.185 (m，2H，CH2OCO)。

硬脂酸單甘油酯 (CDCl3，300MHz)，δ：0.890 (t，J = 13.2 Hz，3H，CH3)，1.264 (m，28H，14CH2)，1.639 (m，2H，CH2)，2.362 (t，J = 15.0 Hz，2H，CH2CO)，3.612 (dd， J = 5.7，5.7 Hz，1H，CHOH)，3.714 (dd，J = 3.9，3.9 Hz，1H，CHOH)，3.947 (m，1H，CHOH)， 4.188 (m，2H，CH2OCO)。

從圖7可以看出，5種脂肪酸單甘油酯的1H NMR譜非常相似，這是因?yàn)樗鼈兊幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)相似，由長(zhǎng)碳鏈的?；透视蛢刹糠纸M成，如圖8所示。?；兼溕腺|(zhì)子的化學(xué)位移位于0.882～2.362 ppm之間，而甘油部分質(zhì)子的化學(xué)位移位于3.596～4.188 ppm之間。其中甘油部分2號(hào)碳原子為手性碳， 1和3號(hào)碳原子上的2個(gè)質(zhì)子不等價(jià)，因此3號(hào)碳原子上的2個(gè)質(zhì)子分別表現(xiàn)出兩個(gè)二重峰(dd)，但是1號(hào)碳原子上的2個(gè)質(zhì)子表現(xiàn)出多重峰(m)。甘油部分的2個(gè)游離羥基為活潑氫，存在質(zhì)子交換反應(yīng)，肉豆蔻酸單甘油酯和棕櫚酸單甘油酯的譜圖中出現(xiàn)羥基質(zhì)子的寬峰，而其他3種脂肪酸單甘油酯的譜圖中沒有觀察到明顯的羥基質(zhì)子峰，可能是與羰基附近的亞甲基質(zhì)子峰發(fā)生了重疊。上述結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13, 15]。

癸酸單甘油酯n=6，月桂酸單甘油酯n=8，肉豆蔻酸單甘油酯n=10，棕櫚酸單甘油酯n=12，硬脂酸單甘油酯n=14圖8 脂肪酸單甘油酯的結(jié)構(gòu)式Fig.8 Structure of fatty acid monoglycerides

2.2.3 紅外光譜分析

A-癸酸單甘油酯；B-月桂酸單甘油酯；C-肉豆蔻酸單甘油酯；D-棕櫚酸單甘油酯；E-硬脂酸單甘油酯圖9 脂肪酸單甘油酯紅外光譜圖Fig.9 IR spectra of fatty acid monoglycerides

3 結(jié)論

以脂肪酶Novozyme 435為催化劑，采用癸酸甲酯、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯、棕櫚酸甲酯和硬脂酸甲酯等脂肪酸甲酯為原料，與甘油進(jìn)行酶催化酯交換反應(yīng)制備相應(yīng)的脂肪酸單甘油酯。原料脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率69.2%～76.2%，隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加，轉(zhuǎn)化率降低，即反應(yīng)活性降低。生成物為脂肪酸單甘油酯和少量脂肪酸雙甘油酯的混合物，其中脂肪酸單甘油酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在91%以上，最高可達(dá)95.9%。經(jīng)柱層析分離得到的五種脂肪酸單甘油酯純品，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)、核磁共振氫譜及紅外光譜對(duì)其進(jìn)行純度分析和結(jié)構(gòu)表征。

脂肪酸甲酯與甘油的酶催化酯交換反應(yīng)，速率快，反應(yīng)1h就達(dá)到平衡；另外反應(yīng)選擇性高，生成脂肪酸單甘油酯的選擇性高于90%，不經(jīng)分子蒸餾提純即可獲得高純度的脂肪酸單甘油酯。但是，目前脂肪酸甲酯的轉(zhuǎn)化率較低，是下一步研究工作亟待解決的問題。

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Enzymatic synthesis and characterization of monoglycerides

WANG Nan, WU Wang-bo, ZHANG Gui-ju*, WANG Rui, XU Bao-cai*

(School of Food and Chemical Engineering, Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Monoglycerides were prepared by the transesterification of fatty acid methyl esters such as methyl caprate, methyl laurate, methyl myristate, methyl palmitate and methyl stearate with glycerol in the presence of Novozyme 435 lipase as catalyst. The product is a mixture of monoglycerides and a small amount of diglycerides, which contained monoglycerides above 91%, and up to 95.9%. With the increase of carbon chain length, the conversion of fatty acid methyl esters decreased, and the content of monoglycerides in the products also decreased. After being purified by column chromatography, the final products was characterized by Gas chromatography - mass spectrometry (GC-MS), H nuclear magnetic resonance (1H NMR) and infrared spectra (IR).

fatty acid monoglycerides; fatty acid methyl ester; enzymatic synthesis; transesterification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705001

碩士研究生，助理實(shí)驗(yàn)師(張桂菊副教授和徐寶財(cái)教授為通訊作者,E-mail：zhangguiju@th.btbu.edu.cn；xubaoc@btbu.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金(21676003，21403010)；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAE03B01)；北京市教委科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(KZ201510011010)；北京市教委市屬高校創(chuàng)新能力提升計(jì)劃項(xiàng)目(TJSHG201510011020)

2016-12-06，改回日期：2017-01-06