急性單核細(xì)胞白血病患者分子遺傳學(xué)特征分析

劉潔+周民+晁紅穎+姜乃可+盧緒章

【摘要】 目的 綜合檢測(cè)急性單核細(xì)胞白血病（AML-M5）患者DNMT3A、FLT3-ITD、NPM1等基因突變發(fā)生情況， 初步探討AML-M5患者的分子遺傳學(xué)特征。方法 采用基因組DNA-聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序法檢測(cè)NPM1基因12號(hào)外顯子、c-KIT基因8、17號(hào)外顯子、DNMT3A熱點(diǎn)突變、CEBPA全部編碼區(qū)及FLT3基因14、15號(hào)外顯子中ITD的突變發(fā)生情況；熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)MLL重排發(fā)生情況；多重PCR檢測(cè)29種常見白血病融合基因發(fā)生情況。結(jié)果 ①82例患者異常核型檢出率為37.80%（31/82）， 其中涉及11q23者占48.39%（15/31）。15例11q23異?；颊呓?jīng)FISH檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)MLL重排陽性， 該組患者平均年齡47.1歲， 平均外周白細(xì)胞水平59.03×109/L， 經(jīng)常規(guī)化療方案誘導(dǎo)后完全緩解（CR）率40.00%（6/15）。其他異常核型占51.61%（16/31）， 平均年齡32.3歲， 平均外周白細(xì)胞水平13.41×109/L， CR率為56.25%（9/16）。正常核型51例， 平均年齡43.3歲， 平均外周白細(xì)胞水平42.74×109/L， CR率為76.47%（39/51）。不管何種染色體核型異常CR率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 正常核型患者CR率高于11q23異?；颊撸≒<0.05）。②70例進(jìn)行基因突變檢測(cè)的AML-M5患者中， 48.57%的患者具有一種及以上基因突變， 依次為FLT3-ITD（30.00%）、DNMT3A（24.29%）、NPM1（17.14%）、CEBPA（8.57%）、c-KIT（1.43%）。③正常核型中基因突變比例明顯高于11q23重排患者， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 不同基因突變發(fā)生年齡、性別及CR率有一定的差異。結(jié)論 11q23是AML-M5患者最為常見的染色體核型異常， 伴此種異常者預(yù)后不良?；蛲蛔兊目偘l(fā)生率48.75%， 以FLT3-ITD突變多見， 而CEBPA、c-KIT基因突變則是AML-M5中較少見的基因異常， 突變?cè)谡：诵突颊咧谐Ｒ姡?其與臨床特點(diǎn)及療效有一定的相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 急性單核細(xì)胞白血??；突變基因；核型

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.36.002

【Abstract】 Objective To comprehensively detect gene mutation of DNMT3A， FLT3-ITD and NPM1 in acute monocytic leukemia （AML-M5） patients， for preliminary discussion molecular genetic characteristics in AML-M5 patients. Methods Occurrence of gene mutation in exon 12 of NPM1 gene， exon 8 and exon 17 of c-KIT gene， hot spot mutation of DNMT3A， all coding regions of CEBPA， exon 14 and exon 15 of FLT3 gene were detected by genomic DNA-polymerase chain reaction （PCR） amplification product direct sequencing method. Occurrence of MLL rearrangement was detected by fluorescence in situ hybridization （FISH）， and 29 kinds of common leukemia fusion gene were detected by multiple PCR detection. Results ①82 patients had abnormal karyotype detection rate as 37.80% （31/82）， including 48.39% （15/31） of 11q23 cases. 15 patients with abnormal 11q23 all had detected MLL rearrangement by FISH， with average age as 47.1 years old， mean peripheral white blood cell level as 59.03×109/L， adn complete remission （CR） rate after induction of conventional chemotherapy regimens as 40.00% （6/15）. The other abnormal karyotype accounted for 51.61% （16/31）， wih average age as 32.3 years old， mean peripheral white blood cell level as 13.41×109/L， and CR rate as 56.25% （9/16）. There were 51 normal karyotype cases， with average age as 43.3 years old， mean peripheral white blood cell level as 42.74×109/L， CR rate as 76.47% （39/51）. There was no statistically significant difference in CR rate of all types of abnormal chromosome karyotype （P>0.05）， and the normal karyotype patients had higher CR rate than abnormal 11q23 patients （P<0.05）. ②Among 70 AML-M5 patients received gene mutations detection， 48.57% of patients had one or more than one kind of gene mutations， with FLT3-ITD （30.00%）， DNMT3A （24.29%）， NPM1 （17.14%）， CEBPA （8.57%）， and c-KIT （1.43%） in order. ③Normal karyotype had higher Gene mutation ratio than 11q23 rearrangement patients， and the difference had statistical significance （P<0.05）. Different mutations had certain differences in age， sex and CR rate. Conclusion 11q23 is most common abnormal chromosome in AML-M5 patients， and always complicated with bad prognosis. Total incidence of gene mutations is 48.75%， of which FLT3-ITD is common， while CEBPA and c-KIT gene mutations are rare genetic abnormality in AML-M5. Mutations are normal in patients with normal karyotype， and it has correlation to clinical features and curative effect.

【Key words】 Acute monocytic leukemia； Mutant gene； Karyotype

急性單核細(xì)胞白血?。╝cute monocytic leukemia， AML-M5）是一種特殊類型的急性髓系白血病， 表現(xiàn)為外周血及骨髓原始和幼稚單核細(xì)胞增多， 常伴有髓外浸潤(rùn)及高白細(xì)胞， 復(fù)發(fā)率高， 病程兇險(xiǎn)， 3年平均無病生存率低， 臨床預(yù)后極差[1]。既往研究表明， 11q23是AML-M5亞型中最常見的的染色體核型異常， 但此類患者的預(yù)后仍存在異質(zhì)性。近年， 隨著高通量DNA測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用與推廣， 一些熱點(diǎn)基因突變逐漸被證實(shí)與患者臨床特點(diǎn)及預(yù)后有較大相關(guān)性。本研究回顧性研究了近年來收治的82例AML-M5患者的染色體核型、MLL重排及DNMT3A、CEBPA、FLT3-ITD、NPM1、c-KIT等多基因突變與部分臨床參數(shù)間的相關(guān)性， 初步探討AML-M5患者的分子遺傳學(xué)特征及預(yù)后價(jià)值， 現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 回顧性分析2006～2016年于常州市第二人民醫(yī)院住院的82例AML-M5患者的臨床資料。其中男41例， 女41例， 平均年齡42歲。診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[2]。臨床治療采用常規(guī)化療方案。

1. 2 細(xì)胞遺傳學(xué)分析 染色體標(biāo)本制備均采用常規(guī)方法， 部分采用直接法， 部分則同時(shí)采用直接法、24 h短期培養(yǎng)法。核型分析采用R顯帶技術(shù)， 平均每例分析中期分裂相20個(gè)。核型異常的描述按人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制ISCN（2009）[3]。

1. 3 MLL重排及融合基因檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[4]， 采用FISH雙色探針進(jìn)行MLL重排檢測(cè)；參考文獻(xiàn)[5]， 采用多重PCR檢測(cè)29種常見白血病融合基因。

1. 4 基因突變檢測(cè) 取患者初診時(shí)骨髓單個(gè)核細(xì)胞1.0×107個(gè)， 用DNA抽提試劑盒（美國(guó)Gentra公司產(chǎn)品）抽提基因組DNA， 根據(jù)吸光度（A）260確定DNA產(chǎn)物濃度， 用DNA稀釋液將基因組DNA樣品稀釋至50 ng/μl。參照文獻(xiàn)[6]， 采用基因組DNA-PCR及瓊脂糖電泳方法檢測(cè)所有患者FLT3基因外顯子14、15中ITD突變及20號(hào)外顯子TKD突變， 陽性標(biāo)本進(jìn)一步測(cè)序證實(shí)；參照文獻(xiàn)[7， 8]， 分別擴(kuò)增NPM1基因第12號(hào)外顯子、DNMT3A熱點(diǎn)突變及c-KIT基因8號(hào)和17號(hào)外顯子， 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序；參照文獻(xiàn)[9]， 采用PCR分段擴(kuò)增CEBPA編碼區(qū)后進(jìn)行直接測(cè)序。測(cè)序由南京GenScrip有限公司完成， 結(jié)果與正常序列比對(duì)， 檢出突變。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 染色體核型、MLL重排與部分臨床參數(shù)間的相關(guān)性分析 82例患者異常核型檢出率為37.80%（31/82）， 其中涉及11q23者占48.39%（15/31）。15例11q23異常患者經(jīng)FISH檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)MLL重排陽性， 該組患者平均年齡47.1歲， 平均外周白細(xì)胞水平59.03×109/L， 經(jīng)常規(guī)化療方案誘導(dǎo)后完CR率40.00%（6/15）。見表1。其他異常核型占51.61%（16/31）， 平均年齡32.3歲， 平均外周白細(xì)胞水平13.41×109/L， CR率為56.25%（9/16）， 其中1例伴Ph+染色體， 初次誘導(dǎo)治療未達(dá)緩解， 最終死于重癥感染， 另見1例t（8；16）（p11；p13）患者， 該患者有乳腺癌病史， 曾反復(fù)化療， 考慮繼發(fā)性急性單核細(xì)胞白血病， 兩次誘導(dǎo)均未達(dá)緩解， 最終死于顱內(nèi)出血， 總體生存時(shí)間僅2個(gè)月。正常核型51例， 平均年齡43.3歲， 平均外周白細(xì)胞水平42.74×109/L， CR率為76.47%（39/51）。不管何種染色體核型異常CR率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 正常核型患者CR率高于11q23異?；颊撸≒<0.05）。

2. 2 多重PCR檢測(cè)及DNMT3A、CEBPA、FLT3-ITD、NPM1、c-KIT基因突變分析 82例患者中75例進(jìn)行了多重PCR檢測(cè)， 異常檢出率為32.00%（24/75）， 伴MLL重排患者21例， 發(fā)生率28.00%（21/75）， 另有1例檢測(cè)到BCR/ABL融合基因。70例患者進(jìn)行了基因突變檢測(cè)， 總的突變發(fā)生率為48.57%（34/70）。其中， 15例伴有11q23/MLL重排者， 突變檢出率為13.33%（2/15）；16例其他異常核型患者突變發(fā)生率為43.75%（7/16）；51例正常核型者突變檢出陽性病例25例（49.02%）。正常核型患者基因突變發(fā)生率明顯高于11q23重排患者（P<0.05）。突變發(fā)生率依次為FLT3-ITD（30.00%）、DNMT3A（24.29%）、NPM1（17.14%）、CEBPA（8.57%）、c-KIT（1.43%）。FLT3-ITD突變主要發(fā)生于正常核型組， 在首次化療后獲得完全緩解者10例。17例患者檢出DNMT3A突變， 其中3例同時(shí)合并FLT3突變， 4例與NPM1突變共存， 4例同時(shí)具有DNMT3A、FLT3、NPM1突變。DNMT3A突變陽性患者染色體核型以正常核型為主（94.12%）， 1例為單體核型， 所有11q23/MLL重排患者中均未檢測(cè)到DNMT3A突變。12例患者檢出NPM1突變陽性， 合并FLT3突變陽性者6例， 染色體核型均為正常核型， 其中9例患者早首次誘導(dǎo)化療后獲得完全緩解。6例患者具有CEBPA突變陽性， 正常核型伴CEBPA突變者4例， 1例為Ph+核型， 1例同時(shí)合并NPM1、DNMT3A突變陽性， 3例同時(shí)合并FLT3突變陽性。其中4例患者在首次誘導(dǎo)化療后獲得完全緩解。僅1例患者檢測(cè)到c-KIT突變。見表2。

3 討論

3. 1 細(xì)胞遺傳學(xué) 細(xì)胞遺傳學(xué)異常是決定AML患者臨床特點(diǎn)和預(yù)后的重要指標(biāo)之一。國(guó)外報(bào)道M5患者染色體核型異常率為48.8%～71.2%， 本組結(jié)果顯示有染色體核型異常者占37.80%（31/82）， 與報(bào)道相近。11q23異常導(dǎo)致MLL基因發(fā)生重排， 在M5中的發(fā)生率較高， 有該核型異常的惡性血液病完全緩解率低， 生存期短[10]。本組所有發(fā)生核型異常的患者與11q23相關(guān)的為48.39%（15/31）， 國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道80% 11q23異常的病例為M5， 進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。本組伴11q23異常的完全緩解率40.00%（6/15）， 低于所有患者的平均緩解率65.85%（54/82）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析伴11q23缺失的患者CR率與核型正?；颊弑容^差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 進(jìn)一步驗(yàn)證了伴11q23異常的患者預(yù)后較差。伴t（8；16）（p11；p13）易位的AML是一種非常罕見的白血病亞型， 發(fā)生率<1%， 總結(jié)國(guó)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)[11， 12]， 此類患者主要表現(xiàn)為急性粒-單核細(xì)胞白血?。ˋML-M4）或M5， 女性多見， 平均年齡約60歲， 大部分患者繼發(fā)于單一實(shí)體腫瘤（57%）， 其中以乳腺癌最多見， 常規(guī)化療往往無效， 生存期短， 預(yù)后極差。與國(guó)外報(bào)道一致， 本組研究中發(fā)現(xiàn)1例該核型異常， 繼發(fā)于乳腺癌， 為61歲中老年女性， 兩次誘導(dǎo)均未達(dá)緩解， 最終死于顱內(nèi)出血， 總體生存時(shí)間僅2個(gè)月。Ph染色體和BCR-ABL融合基因是CML患者的特征性異常， 既往文獻(xiàn)報(bào)道也出現(xiàn)在0.9%～3.0% AML患者中[13]， 本組研究中發(fā)現(xiàn)1例Ph+患者， 占1.22%， 與之前的報(bào)道相仿。Ph+AML緩解率低， 預(yù)后差， 生存期短， 治療上尚無統(tǒng)一的方案， 目前認(rèn)為化療聯(lián)合TKI， 并在CR后盡早行allo-HSCT是改善患者生存的唯一有效途徑[14]。本組研究中該患者初次常規(guī)方案誘導(dǎo)未緩解， 最終死于重癥感染， 需要更多樣本、多中心的研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。

3. 2 分子生物學(xué) AML的起病、發(fā)展及預(yù)后除了與染色體核型異常有關(guān)外， 還與一些基因突變有關(guān)， 如FLT3、NPM1、CEBPA等， 近年來發(fā)現(xiàn)越來越多的基因與預(yù)后具有相關(guān)性， 并將其應(yīng)用到白血病的發(fā)病機(jī)制中。

NPM1和FLT3-ITD突變是AML患者中最常見的基因異常， 國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果[15-17]發(fā)現(xiàn)FLT3-ITD和NPM1在AML的發(fā)生率分別為20%～35%和1/3， 以M5多見， 正常核型中表達(dá)較高， 其中NPM1在女性患者中多見， 且FLT3-ITD突變和AML患者的較差的預(yù)后相關(guān)而NPM1突變通常與更好的預(yù)后相關(guān)。本研究檢測(cè)到的FLT3和NPM1突變率為30.00%和17.14%， 核型均以正常核型多見， NMP1突變女性患者占66.67%（8/12）， 與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致。FLT3突變和NPM1突變患者初始誘導(dǎo)治療后CR率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 因未作總體生存率（OS）和無病生存率（DFS）統(tǒng)計(jì)， 提示預(yù)后依據(jù)不足。

關(guān)于c-KIT， 其在AML中則有較高的表達(dá)， 陽性率在23%～87%[18]， 本組研究?jī)H檢測(cè)到1例c-KIT突變， 遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道的范圍， 但多數(shù)研究認(rèn)為c-KIT表達(dá)以M5最低， 支持本次的結(jié)果。CEBPA突變則主要集中在正常核型的AML患者中， 多集中在M1、M2型， 本次檢測(cè)到CEBPA總突變率8.57%（6/70）， 在正常核型中的突變率為7.84%（4/51）， 低于國(guó)內(nèi)相關(guān)的報(bào)道， 但與國(guó)外大宗研究報(bào)道相近[19-21]。值得注意的是， 國(guó)外的研究顯示CEBPA突變患者具有較高的OS和DFS， 作者同樣發(fā)現(xiàn)其具有較高的CR率（66.67%）， 但由于隨訪時(shí)間短以及部分失訪， 未作OS和DFS統(tǒng)計(jì)。

AML患者中DNMT3A突變頻率高于任何一種其他血液系統(tǒng)疾病， 而AML患者中又以M5頻率最高， 在本研究中， 共發(fā)現(xiàn)17例DNMT3A突變患者， 突變頻率24.29%， 與此前學(xué)者的研究結(jié)果相近。DNMT3A還與高齡、高白細(xì)胞、NPM1突變、FLT3突變及IHDI/2突變密切相關(guān)[22-25]。同時(shí)Ribeiro等[20]研究證實(shí)DNMT3A突變可作為提示AML患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。但本次研究發(fā)現(xiàn)伴DNMT3A突變者初次誘導(dǎo)緩解后CR率達(dá)70.59%， 與未突變組相比CR率無明顯差異， 反而較FLT3突變組CR率高。

本研究回顧性分析了AML-M5患者細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)特征， 其與臨床特點(diǎn)及療效有一定的相關(guān)性。基因突變?cè)诎籽“ˋML-M5發(fā)生過程中起著重要作用， 需進(jìn)一步研究和證實(shí)及尋找具有預(yù)后意義的基因， 從而制定更詳細(xì)的危險(xiǎn)分層及治療方案， 進(jìn)一步改善患者預(yù)后及生存。

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