應(yīng)用哺乳動物抗體檢測阿維菌素抗性果蠅P糖蛋白的表達

楊 敏， 羅 亮， 張 鋒， 伍一軍河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 0700; 中國科學(xué)院動物研究所,農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室/分子毒理學(xué)實驗室,北京 000

應(yīng)用哺乳動物抗體檢測阿維菌素抗性果蠅P糖蛋白的表達

楊 敏1+， 羅 亮2+， 張 鋒1， 伍一軍2*
1河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北 保定 071002;2中國科學(xué)院動物研究所,農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室/分子毒理學(xué)實驗室,北京 100101

【目的】隨著殺蟲劑阿維菌素的廣泛應(yīng)用，靶標生物對其抗性問題日益嚴重。以往的研究顯示，細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白P糖蛋白可能與抗藥性有關(guān)。但在昆蟲對阿維菌素的抗性研究中，由于目前市場上缺少專門針對昆蟲的商業(yè)化抗體，使得這一研究受限。為此，本研究嘗試應(yīng)用其他物種的抗體開展P糖蛋白的檢測?！痉椒ā恳怨墳闇y試昆蟲，以阿維菌素作為測試藥物，采用免疫印跡方法用鼠抗人P糖蛋白單克隆抗體檢測阿維菌素敏感品系與阿維菌素抗性品系果蠅中的P糖蛋白的表達水平?！窘Y(jié)果】檢測出果蠅體內(nèi)P糖蛋白的特異性表達，且無明顯非特異性條帶；與敏感品系果蠅相比，阿維菌素抗性品系果蠅P糖蛋白的表達水平明顯升高。【結(jié)論】用針對人及其他脊椎動物的P糖蛋白單克隆抗體檢測果蠅P糖蛋白的表達可行，且果蠅對阿維菌素的抗性可能與P糖蛋白的表達升高有關(guān)。

P糖蛋白； 蛋白質(zhì)印跡； 果蠅； 抗藥性

阿維菌素(avermectins)是一類由土壤阿維鏈霉素Streptomyceaavermitilis發(fā)酵而來的十六元大環(huán)內(nèi)酯類化學(xué)物，具有高效廣譜的殺蟲活性，用于80多種有害生物的防治(Lasota & Dybas,1991)。由于長期使用，很多靶標生物對阿維菌素產(chǎn)生了抗性。然而，到目前為止，害蟲對阿維菌素抗性產(chǎn)生的機制仍不清楚。以往的研究表明，一種最早在中國倉鼠卵巢細胞膜上發(fā)現(xiàn)的膜蛋白——P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)與細胞耐藥性有關(guān)(Juliano & Ling,1976)，此蛋白可以將多種外源化合物運出細胞?，F(xiàn)已在果蠅、按蚊等昆蟲中發(fā)現(xiàn)P-gp的同源物 (Gerrardetal.,1993； Wuetal.,1991)，其表達水平可能與昆蟲對一些殺蟲劑(如：阿維菌素)的抗性相關(guān) (Auradeetal.,2010； Lanning,1996; )。

為了解昆蟲對阿維菌素的抗性與P-gp的關(guān)系，本研究采用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)方法對P-gp進行檢測。蛋白質(zhì)印跡也被稱為免疫印跡(immunoblotting)技術(shù) (Towbinetal.,1979)， 具有敏感、簡便等優(yōu)點，被廣泛用于分子生物學(xué)、微生物學(xué)及免疫學(xué)等多個領(lǐng)域。然而，在昆蟲學(xué)研究中，由于缺乏專門針對昆蟲蛋白檢測的商業(yè)化抗體，限制了這一技術(shù)的應(yīng)用 (Ginanovaetal.,2015; Jonusaiteetal.,2016)。本文以果蠅 P-gp的免疫印跡方法為例，以脊椎動物蛋白質(zhì)抗體替代昆蟲抗體檢測目的蛋白(P-gp)的表達，進而研究昆蟲抗藥性的機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 果蠅來源及飼養(yǎng) 野生黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Canton-S)由美國俄勒岡健康科學(xué)研究大學(xué)(Oregon Health & Science University)的Kretzschmar教授惠贈(命名為SABM)；抗阿維菌素果蠅由中國科學(xué)院動物研究所分子毒理學(xué)實驗室用野生型果蠅汰選而成，抗藥性倍數(shù)30倍(命名為RABM)。果蠅的培養(yǎng)基配方及配制參照Bloomington提供的方法(http:∥flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/caltechfood.htm)。果蠅飼養(yǎng)溫度：(25±1) ℃；保種溫度：(18±1) ℃；光周期：16 h光照∶8 h黑暗；相對濕度：50%～70%。

1.1.2 主要試劑與抗體 阿維菌素(含93% abamectin B1a、7% B1b)購自中農(nóng)大生物技術(shù)公司，苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine)、抑肽酶(aprotinin)、亮肽素(leupeptin)和胃蛋白酶抑制劑(pepstatin)及麗春紅等試劑購自美國Sigma公司，ECL發(fā)光液購自碧云天生物技術(shù)研究所，丙烯酰胺購自東京化成工業(yè)株式會社，甲叉雙丙烯酰胺和過硫酸銨購自美國Merck公司，PVDF膜購自美國Millipore公司。小鼠抗人的P-gp單克隆抗體(C219)(一抗)購自Merck公司，羊抗鼠IgG 抗體(二抗)購自北京康為世紀生物科技有限公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要實驗儀器 5417R型臺式控溫離心機(德國Eppendorf公司),梅特勒—托利多xs10專業(yè)型分析天平(瑞士梅特勒—托利多公司)，人工氣候箱(寧波江南儀器廠)，ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

果蠅麻醉系統(tǒng)：二氧化碳透氣板、二氧化碳氣槍(美國LabScientific公司)和二氧化碳氣瓶。

1.2 方法

1.2.1 果蠅組織總蛋白提取 取40頭果蠅成蟲置冰上用二氧化碳麻醉，立即加入適量裂解液(20 mmol·L-1Tris-HCl, pH 7.5, 1% CHAPS, 150 mmol·L-1NaCl, 10% glycerol, 1 mmol·L-1Na3VO4, 0.1 mmol·L-1PMSF及蛋白酶抑制劑——抑肽酶、亮肽素和胃蛋白酶抑制劑的混合物)，冰上靜置10 min，玻璃勻漿器上下勻漿30次左右，離心(500g)3 min，取上清，再離心(16000g, 4 ℃)10 min,收集上清液作為測定樣品。參照Bradford (1976)和Lowryetal.(1951)的方法測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 制備凝膠，分離膠質(zhì)量濃度為10%，濃縮膠質(zhì)量濃度為5%。電泳條件：濃縮膠中電壓80 V，分離膠中電壓150 V，當指示劑溴酚藍到達距凝膠下緣1 cm處停止電泳。

1.2.3 免疫印跡反應(yīng) 停止電泳后取下凝膠，將與凝膠尺寸相當?shù)臑V紙和PVDF膜及海綿塊按照凝膠、濾紙、膜和海綿的順序放好，在轉(zhuǎn)移緩沖液(20 mmol·L-1Tris，192 mmol·L-1甘氨酸，15%甲醇，0.5% SDS)中浸泡20 min后開始轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印電流250 mA，時間90～120 min。轉(zhuǎn)印完后將PVDF膜用含5%脫脂奶粉的PBST 溶液(PBS溶液, 0.05% Tween-20，pH 7.5)封閉1 h，再用一抗(小鼠抗人P-gp抗體)反應(yīng)2 h。然后在PBST溶液中漂洗3次， 每次10 min，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗(羊抗鼠IgG)，室溫搖蕩1 h，再用PBST溶液漂洗3次，每次10 min，加入新配制的ECL混合液，均勻覆蓋，立即上機檢測，照相并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)查閱資料，筆者分析、篩選了不同來源的P-gp抗體，其中多為針對小鼠、大鼠和人的抗體。將小鼠P-gp的氨基酸序列與其相對應(yīng)的果蠅P-gp的氨基酸序列進行比較，發(fā)現(xiàn)其P-gp的全部氨基酸序列相似性為43%(通過GenBank登錄號NM_057483.4和M33581.1可查閱具體序列)。但就抗原表位而言， 一種針對人和小鼠等脊椎動物的P-gp的兔源多克隆抗體(美國Abcam公司，貨號ab98322)的抗原表位序列(863～912位氨基酸)與果蠅的相似性為42%(表1)；另一種抗人及其他哺乳動物(小鼠、大鼠、靈長類等)P-gp的小鼠來源的單克隆抗體(C219)，抗原表位的N端氨基酸序列(VQAALD)及C端氨基酸序列(VQEALD)與果蠅很接近，相似性為83.3%(表2)。根據(jù)抗體所針對的蛋白質(zhì)抗原表位氨基酸序列的相似程度，本研究選擇小鼠抗人的P-gp單克隆抗體(C219)作為檢測果蠅P-gp表達的抗體。

表1 兔抗人P-gp多克隆抗體所針對的抗原表位蛋白序列在果蠅和人類中的比較Table 1 Comparison of the antigen epitope sequences for the rabbit anti-P-glycoprotein polyclonal antibody between Drosophila and human

表2 小鼠抗人P-gp單克隆抗體(C219)所針對的P-gp抗原表位蛋白序列在各物種間的比較Table 2 Comparison of antigen epitope sequences for the mouse anti-P-glycoprotein monoclonal antibody among the species

用Western blotting技術(shù)測定了P-gp在阿維菌素抗性品系(RABM)和敏感品系(SABM)果蠅中的表達情況，結(jié)果顯示，RABM品系的P-gp表達量比SABM品系高出大約2倍(圖1)，說明果蠅對阿維菌素的抗性可能與其體內(nèi)P-gp表達水平升高有關(guān)。

3 討論

昆蟲組織與脊椎動物組織的免疫印跡技術(shù)的步驟基本一致，主要涉及蛋白質(zhì)提取、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)等。但昆蟲組織P-gp膜蛋白有一定的特殊性，在進行免疫印跡檢測時需注意以下問題。

首先，由于大部分昆蟲表皮含有堅硬的幾丁質(zhì)，有可能因蛋白質(zhì)提取不充分而檢測不出目的蛋白。在實際操作中，可先將昆蟲在提取液中浸泡10 min，使幾丁質(zhì)軟化，再使用勻漿器或均質(zhì)器盡量將組織充分勻漿。本實驗中所測定的P-gp是一種膜蛋白，操作過程中要保持低溫(如冰上操作)，并在提取液中加入蛋白酶抑制劑，以防止樣品在制備過程中降解。

A：用蛋白質(zhì)免疫印跡反應(yīng)檢測2種品系果蠅中的P-gp表達，一抗為小鼠抗人P-gp抗體(C219)，二抗為羊抗鼠IgG，GAPDH為上樣量控制蛋白；B：對A圖進行量化處理的結(jié)果。*表示差異顯著(P<0.05)。A： P-gp levels in whole SABM and RABM flies determined by Western blotting using the C219 anti-P-gp antibody， GAPDH was used as a loading control; B： The histogram shows the densitometric quantification of data presented in the figure A. *indicate significant difference (P<0.05). 圖1 阿維菌素抗性品系(RABM)與敏感品系(SABM)果蠅中的P糖蛋白(P-gp)表達水平Fig.1 P-glycoprotein (P-gp) expression in abamectin resistant (RABM) and sensitive (SABM) adult Drosophila

其次，目前市場上尚無專門針對昆蟲P-gp的抗體，在沒有條件制備抗體時，需要尋找合適的抗體替代品。選用抗體時，需查看抗體所針對物種的目標蛋白質(zhì)的抗原表位氨基酸序列與昆蟲對應(yīng)的待檢測蛋白質(zhì)的氨基酸序列的相似性。為了保證效果，應(yīng)選擇與所針對的蛋白質(zhì)抗原表位序列相似性高的抗體。隨著技術(shù)的進步，新的制備抗體的方法正逐漸產(chǎn)生，除采用哺乳動物血清制備抗體的常規(guī)方法外，最近有報道可利用細菌批量生產(chǎn)抗體(Naetal.,2016)，有條件的實驗室可進行嘗試。

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(責任編輯:楊郁霞)

Expression level of P-glycoprotein in avermectin-resistantDrosophilamelanogasterby using the anti-human antibody

YANG Min1+, LUO Liang2+, ZHANG Feng1, WU Yijun2*
1CollegeofLifeSciences,HebeiUniversity,Baoding,Hebei071002,China;2StateKeyLaboratoryofIntegratedManagementofPestInsectsandRodents/LaboratoryofMolecularToxicology,InstituteofZoology，ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China

【Aim】 With the widespread application of avermectin, the resistance of target organisms is becoming a more and more serious problem. Previous studies suggest that the membrane transporter P-glycoprotein (P-gp) overexpression is essential for resistance of cancer cells to chemotherapeutic drugs. However, insecticide resistance study was limited, partly because suitable commercial insect antibodies were not available. 【Method】 In this study, we used anti-human antibody for the detection of P-gp in insects. The expression of P-gp was detected by immunoblotting in the avermectin-sensitive and avemectin-resistant strains ofDrosophilamelanogaster, using mouse anti-human P-gp monoclonal antibody (C219) as the primary antibody. 【Result】 The expression of P-gp in the avermectin-resistant strain ofDrosophilawas higher than that in the avermectin-sensitive strain with no obvious nonspecfic bands detected. 【Conclusion】 The expression level of P-gp inDrosophilamay be related to the avermectin resistance. In addition, it is feasible to use anti-human antibody to detect the P-gp level in insects.

P-glycoprotein; Western blotting analysis;Drosophila; resistance

2016-06-06 接受日期(Accepted)： 2016-10-18

國家自然科學(xué)基金項目(31272365)

+共同第一作者。 楊敏， 女， 碩士研究生。 研究方向： 分子毒理學(xué)； 羅亮， 男， 博士研究生。 研究方向： 昆蟲分子毒理學(xué)

*通信作者(Author for correspondence), E-mail: wuyj@ioz.ac.cn

10. 3969/j.issn.2095-1787.2017.02.011