大麥麥芽非淀粉多糖的含量和分子質(zhì)量與其協(xié)定麥汁過(guò)濾速度的關(guān)系

孫軍勇，張明，陳柳，潘賀鵬，丁意，陸健*

1(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 4(江蘇省農(nóng)墾麥芽有限公司，江蘇 鹽城，224300) 5(華潤(rùn)雪花啤酒(上海)有限公司，上海，200949)

大麥麥芽非淀粉多糖的含量和分子質(zhì)量與其協(xié)定麥汁過(guò)濾速度的關(guān)系

孫軍勇1,2,3，張明4，陳柳5，潘賀鵬4，丁意3，陸健1,2,3*

1(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 4(江蘇省農(nóng)墾麥芽有限公司，江蘇 鹽城，224300) 5(華潤(rùn)雪花啤酒(上海)有限公司，上海，200949)

以17個(gè)大麥麥芽樣品為研究對(duì)象，采用協(xié)定糖化法分析了麥汁中與麥芽過(guò)濾速度相關(guān)的指標(biāo)。Pearson相關(guān)性分析表明，過(guò)濾速度與黏度極顯著負(fù)相關(guān)，與總阿拉伯木聚糖含量顯著負(fù)相關(guān)；黏度與總阿拉伯木聚糖含量極顯著正相關(guān)，與麥汁中的總β-葡聚糖含量顯著正相關(guān)。β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖分別用75%飽和度的硫酸銨和80%的乙醇沉淀后，采用凝膠過(guò)濾色譜法進(jìn)一步分析了分子量大于1 000 kDa、500～1 000 kDa、50～500 kDa及小于50 kDa的4個(gè)分子量段β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖的含量，相關(guān)性分析結(jié)果表明，分子量大于50 kDa的阿拉伯木聚糖含量與過(guò)濾速度極顯著負(fù)相關(guān)，與黏度極顯著正相關(guān)；分子量大于1 000 kDa的β-葡聚糖含量與黏度極顯著正相關(guān)，與總β-葡聚糖含量和總阿拉伯木聚糖含量相比，顯著性水平和相關(guān)系數(shù)均有較大提高，是造成協(xié)定麥汁黏度高和過(guò)濾速度慢的重要因素。

大麥麥芽；過(guò)濾速度；非淀粉多糖；分子量；黏度

大麥麥芽的非淀粉多糖主要指β-(1→3，1→4)葡聚糖(簡(jiǎn)稱(chēng)β-葡聚糖，β-glucan，BG)和阿拉伯木聚糖(Arabinoxylan，AX)，它們是大麥胚乳細(xì)胞壁的主要組成部分，分別占大麥干重的3%～5%和6%～10%[1]。β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖的含量對(duì)于啤酒生產(chǎn)過(guò)程有重要影響。長(zhǎng)久以來(lái)，β-葡聚糖一直被認(rèn)為是麥汁和啤酒過(guò)濾過(guò)程中堵塞過(guò)濾介質(zhì)的主要物質(zhì)，降低糖化收率并引起啤酒的非生物混濁[2]，很多麥芽和啤酒公司將β-葡聚糖含量作為一個(gè)關(guān)鍵控制的指標(biāo)；近十幾年的研究證明[3-4]，阿拉伯木聚糖也具有與β-葡聚糖類(lèi)似的作用，而且在麥汁和啤酒中的含量要高得多，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)大麥麥芽中阿拉伯木聚糖的研究相對(duì)較少。

大麥麥芽協(xié)定麥汁的過(guò)濾速度是釀酒師最為重視的指標(biāo)之一[5]，其決定了啤酒生產(chǎn)過(guò)程的效率，研究過(guò)濾速度的影響因素一直是啤酒行業(yè)研究熱點(diǎn)。有研究者提出[3,6]，過(guò)濾速度與β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖的總量關(guān)系不大，而與它們的分子量大小關(guān)系更為密切。目前，在國(guó)內(nèi)的啤酒生產(chǎn)和研究中，β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖的檢測(cè)都是測(cè)定其總量。在國(guó)外，DERVILLY[4]和IRAKLI[6]分別對(duì)不同分子量的阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖的分子結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行了研究，THOMAS[2]研究了制麥工藝參數(shù)和部分糖化工藝參數(shù)對(duì)阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖分子量大小的影響，而不同分子量的β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖的含量與其協(xié)定麥汁過(guò)濾速度關(guān)系的研究未見(jiàn)報(bào)道。

本課題以國(guó)內(nèi)啤酒行業(yè)常用的11個(gè)品種大麥麥芽(共17個(gè)樣品)為研究對(duì)象，研究了硫酸銨和乙醇沉淀麥汁中非淀粉多糖的特性，并采用凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定了大麥麥芽中不同分子量的β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖的含量，通過(guò)相關(guān)性分析以明確大麥麥芽中不同分子量的非淀粉多糖的含量與過(guò)濾速度的關(guān)系，為進(jìn)一步消除其對(duì)啤酒生產(chǎn)的不利影響提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

表1 研究中用到的大麥麥芽的信息

注：以上大麥品種均為二棱大麥。

1.1.2 試劑與設(shè)備

β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，Megazyme公司；阿拉伯木聚糖標(biāo)準(zhǔn)品、剛果紅，Sigma公司；Blue Dextran 2000，上海西寶生物科技有限公司；凝膠柱填料Sepharose CL-6B，玻璃柱XK26/100，美國(guó)GE公司，分子量標(biāo)準(zhǔn)品DXT760K，DXT500K，DXT123K，DXT55K，DXT21K，American Polymer Standards Corporation；間苯三酚，沃凱公司；木糖、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、蒽酮、濃H2SO4、NaCl、(NH4)2SO4、無(wú)水乙醇、冰醋酸、濃HCl、葡萄糖等，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有公司。

EBC麥芽標(biāo)準(zhǔn)粉碎機(jī)，北京德之杰公司；YQ-PJ-8B型自動(dòng)糖化器，輕工業(yè)部西安輕機(jī)所光電公司；UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司；HAAKE落球式黏度計(jì)，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；H1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BT100恒流泵，保定蘭格恒流泵有限公司；BSZ-100自動(dòng)部分收集器，上海青浦滬西儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大麥麥芽協(xié)定糖化法(Congress Mash)

按輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《QB/T 1686—2008啤酒麥芽》[7]中6.4.4.1中的方法制備。

1.2.2 大麥麥芽常規(guī)理化指標(biāo)的測(cè)定

按文獻(xiàn)[7]中的方法進(jìn)行。

1.2.3 過(guò)濾速度和黏度的測(cè)定

過(guò)濾速度以協(xié)定糖化中30 min內(nèi)濾出的麥汁體積(V30 min)表示；黏度采用HAAKE落球式黏度計(jì)按參考文獻(xiàn)[8]中的方法進(jìn)行。

1.2.4 β-葡聚糖含量的測(cè)定方法——?jiǎng)偣t分光光度比色法

采用歐洲啤酒釀造協(xié)會(huì)(European Brewery Convention，EBC)的標(biāo)準(zhǔn)分析方法[9]中最新收錄的方法4.16.3進(jìn)行。本方法測(cè)定的是分子量大于10 kDa的高分子量部分[10]。

顯色劑：24.228 g Tris溶于800 mL蒸餾水中，用濃HCl調(diào)至pH 8.0，將0.100 g剛果紅溶解于緩沖液中，用蒸餾水定容至1 L。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：將大麥β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成0～500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法分別測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。樣品的測(cè)定：取樣品0.4 mL置于試管中，對(duì)照加入0.4 mL蒸餾水，然后給各管加入6 mL剛果紅試劑，室溫下準(zhǔn)確反應(yīng)30min，測(cè)定550 nm下的吸光度值。

1.2.5 阿拉伯木聚糖含量的測(cè)定——Douglas法[11]

顯色劑：1 g間苯三酚，用5 mL無(wú)水乙醇溶解，再依次加入110 mL冰醋酸、1 mL 17.5 g/L的葡萄糖、2 mL濃HCl，搖勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：將木糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成20～200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法分別測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。麥汁樣品的測(cè)定：取樣品溶液0.1 mL，加入1.9 mL蒸餾水，置于具塞刻度試管中，對(duì)照加入2 mL蒸餾水，然后給各管加入10 mL間苯三酚顯色劑，振蕩均勻后于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)25 min，冷卻至室溫，于552 nm下比色。

1.2.6 麥汁中非淀粉多糖的沉淀

1.2.6.1 不同飽和度的硫酸銨沉淀非淀粉多糖

在16支具塞刻度試管中分別加入5 mL麥汁，根據(jù)文獻(xiàn)[12]加入硫酸銨粉末，加塞振蕩使其充分溶解，使硫酸銨的飽和度分別為20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%。將各刻度試管放4℃冰箱靜置過(guò)夜，10 000×g離心30 min，棄上清液，沉淀用5 mL蒸餾水復(fù)溶，得到沉淀后的非淀粉多糖溶液。用前述的1.2.4剛果紅法和1.2.5Douglas法分別測(cè)定β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖的含量。

1.2.6.2 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀非淀粉多糖

分別取5 mL麥汁加入到具塞刻度試管中，加入不同體積的乙醇與麥汁混勻，使乙醇的體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%，4 ℃冰箱過(guò)夜，10 000×g離心30 min，棄去上清，加5 mL蒸餾水復(fù)溶，得到沉淀后的非淀粉多糖溶液，用前述的1.2.4剛果紅法和1.2.5Douglas法分別測(cè)定β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖的含量。

1.2.7 麥汁中不同分子量段的非淀粉多糖含量的測(cè)定——凝膠過(guò)濾色譜法

1.2.7.1 凝膠過(guò)濾色譜柱的校準(zhǔn)[13-14]

填料為Sepharose CL-6B，柱子尺寸為100 cm×2.6 cm，填料高度為90 cm。流動(dòng)相為0.05 mol/L NaCl；流速為100 mL/h；分子量標(biāo)準(zhǔn)品上樣濃度為500 mg/L；上樣量為8 mL。使用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，每6 min收集1管，采用蒽酮-硫酸法[15]測(cè)定每管洗脫液中的總糖含量，確定每個(gè)分子量標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間，根據(jù)出峰時(shí)間和流速計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品的有效分配系數(shù)(Kav值)，以Kav值為橫坐標(biāo)，分子量標(biāo)準(zhǔn)品重均分子量的log值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.7.2 麥汁中不同分子量段的非淀粉多糖含量的測(cè)定[16]

于具塞刻度試管中加入50 mL的協(xié)定麥汁，分別加入一定體積的無(wú)水乙醇或者一定量的硫酸銨粉末，混勻，于4℃冰箱過(guò)夜，10 000×g離心30 min，離心棄上清，沉淀用一定體積的蒸餾水復(fù)溶，過(guò)0.45 μm膜，取8 mL上樣于凝膠過(guò)濾色譜柱(26 mm×90 mm)，流動(dòng)相為0.05 mol/L NaCl；流速為100 mL/h；自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，每6 min收集1管。取0.4 mL加入6 mL剛果紅試劑，按照1.2.4剛果紅法測(cè)定各管中的β-葡聚糖含量；取2 mL加入10 mL間苯三酚顯色劑，按照1.2.5 Douglas法測(cè)定各管中的阿拉伯木聚糖含量。

1.2.8 數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析采用SPSS19.0進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨和乙醇沉淀麥汁中非淀粉多糖的研究

目前檢測(cè)麥汁和啤酒中阿拉伯木聚糖含量的方法主要有氣相色譜法[17-18]，地衣酚鹽酸法[19]，Douglas法(間苯三酚法)[20]等，其中Douglas法與氣相色譜法具有較好的相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)為0.949)[21]，該測(cè)定方法較方便、快速，因此采用Douglas法檢測(cè)麥汁中的阿拉伯木聚糖含量。但無(wú)論是氣相色譜法還是Douglas法，均不是直接測(cè)定樣品中阿拉伯木聚糖的含量，而是利用強(qiáng)酸將阿拉伯木聚糖水解成阿拉伯糖和木糖后，再測(cè)定2種單糖的含量，通過(guò)計(jì)算得到阿拉伯木聚糖的含量。由于阿拉伯木聚糖在大麥的發(fā)芽過(guò)程中部分被內(nèi)源木聚糖酶水解[1]，因此麥汁中存在著阿拉伯糖和木糖的單體形式，這將導(dǎo)致結(jié)果偏高，已有的文獻(xiàn)[17-18, 20]均存在同樣的問(wèn)題，因此需要找到一種方法將麥汁中以多糖形式存在的阿拉伯木聚糖分離出來(lái)，準(zhǔn)確測(cè)定阿拉伯木聚糖含量。

硫酸銨[22-23]和乙醇[24-27]均被用來(lái)沉淀麥汁和啤酒中的非淀粉多糖，但是不同的文獻(xiàn)中采用硫酸銨的飽和度和乙醇的體積分?jǐn)?shù)均不同。因此，按照1.2.6中的方法，采用不同飽和度的硫酸銨和不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀麥汁中的非淀粉多糖，測(cè)定沉淀中的β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖的含量，以研究它們對(duì)大分子非淀粉多糖的沉淀效果。

不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇和不同飽和度的硫酸銨沉淀的阿拉伯木聚糖的含量分別見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀的阿拉伯木聚糖含量Fig.1 Contents of arabinoxylan precipitated by different ethanol concentrations

圖2 不同飽和度的硫酸銨沉淀的阿拉伯木聚糖含量Fig.2 Contents of arabinoxylan precipitated by different levels of ammonium sulfate saturation

從圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，沉淀中的阿拉伯木聚糖含量逐漸上升，在80%時(shí)最高為985 mg/L。而圖2中，90%飽和度的硫酸銨沉淀的阿拉伯木聚糖含量最高為333 mg/L，80%乙醇沉淀出的阿拉伯木聚糖含量是90%飽和度的硫酸銨沉淀的阿拉伯木聚糖含量的5.03倍，所以選擇80%的乙醇沉淀麥汁中的阿拉伯木聚糖，并將其作為總阿拉伯木聚糖(total arabinoxylan，TAX)含量。

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀的β-葡聚糖含量Fig.3 Contents of β-glucan precipitated by different ethanol concentrations

不同飽和度的硫酸銨沉淀的β-葡聚糖的含量分別見(jiàn)圖2和圖4。圖2中，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)，沉淀中的β-葡聚糖含量最高為102 mg/L；圖4中，硫酸銨的飽和度為75%時(shí)，沉淀中的β-葡聚糖含量最高為107 mg/L。數(shù)據(jù)說(shuō)明，75%飽和度的硫酸銨沉淀的β-葡聚糖含量比75%的乙醇沉淀的量略高，但差異不大；但75%的乙醇沉淀的阿拉伯木聚糖含量(876 mg/L)是75%飽和度的硫酸銨沉淀的含量(174mg/L)的2.96倍，綜合考慮，選擇75%飽和度的硫酸銨沉淀麥汁中的β-葡聚糖。

圖4 不同飽和度的硫酸銨沉淀的β-葡聚糖含量Fig.4 Contents of β-glucan precipitated by different levels of ammonium sulfate saturation

乙醇沉淀法的主要機(jī)理[28]是多糖溶液加入乙醇后，介電常數(shù)降低，多糖溶解度降低從而產(chǎn)生沉淀，這種方法幾乎適用于所有水溶性多糖，但其特異性不高，導(dǎo)致對(duì)不同多糖的分離選擇性較差。硫酸銨沉淀法的主要機(jī)理[29]是多糖溶液中加入硫酸銨后，兩價(jià)離子與水分子產(chǎn)生水合，爭(zhēng)奪多糖表面的水分子，使得多糖非極性基團(tuán)相互吸引而聚集沉淀。上述沉淀機(jī)理的差異可能是造成兩種沉淀方法測(cè)得非淀粉多糖含量有差異的原因。

2.2 大麥麥芽常規(guī)理化指標(biāo)的分析

17個(gè)大麥麥芽樣品的常規(guī)理化指標(biāo)分析結(jié)果見(jiàn)表2，其中進(jìn)口大麥麥芽9個(gè)樣品，國(guó)產(chǎn)大麥麥芽8個(gè)樣品。

表2 大麥麥芽的常規(guī)理化指標(biāo)

17個(gè)樣品中，國(guó)產(chǎn)大麥麥芽的總蛋白和α-氨基氮含量普遍高于進(jìn)口大麥麥芽，浸出率普遍低于進(jìn)口大麥麥芽，其他指標(biāo)差異不大。

2.3 大麥麥芽協(xié)定麥汁與過(guò)濾速度相關(guān)的指標(biāo)的分析

17個(gè)大麥麥芽樣品與過(guò)濾速度相關(guān)的5個(gè)指標(biāo)的分析數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性分析結(jié)果分別見(jiàn)表4和表5。

表3中，17個(gè)麥芽樣品β-葡聚糖含量普遍較低，除8號(hào)樣外，其他16個(gè)樣品的總β-葡聚糖含量均低于國(guó)際上建議的控制標(biāo)準(zhǔn)250 mg/L[30]。3#、4#、5#、6#、7#、8#和15#麥芽的過(guò)濾速度V30min均小于200 mL，過(guò)濾速度偏慢。相對(duì)于其他樣品，這7個(gè)樣品的總阿拉伯木聚糖和黏度偏高，目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有總阿拉伯木聚糖含量的控制標(biāo)準(zhǔn)。

從表4的統(tǒng)計(jì)分析可以看出，17個(gè)麥芽樣品的總阿拉伯木聚糖含量的平均值為924 mg/L，是總β-葡聚糖含量平均值的5.78倍，并且過(guò)濾速度、總阿拉伯木聚糖和總β-葡聚糖的變異系數(shù)較大。表5的相關(guān)性分析顯示，過(guò)濾速度與總阿拉伯木聚糖含量的相關(guān)系數(shù)為-0.572(P<0.05)，與黏度的相關(guān)系數(shù)為-0.626(P<0.01)，與總β-葡聚糖含量沒(méi)有相關(guān)性(P>0.05)，但是黏度與總β-葡聚糖含量顯著相關(guān)(P<0.05)，總β-葡聚糖通過(guò)影響?zhàn)ざ鹊拇笮￠g接影響過(guò)濾速度。

表5中，過(guò)濾速度與總阿拉伯木聚糖含量、總β-葡聚糖含量和黏度的顯著性水平和相關(guān)系數(shù)均不高，為進(jìn)一步明確不同分子量非淀粉多糖的影響，將采用凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定不同分子量段的非淀粉多糖的含量，并進(jìn)行相關(guān)性分析，以明確具體是哪一分子量段的非淀粉多糖影響過(guò)濾速度和黏度。

表3 大麥麥芽協(xié)定麥汁與過(guò)濾速度相關(guān)理化指標(biāo)的分析

注：*TBG表示采用剛果紅法測(cè)定的協(xié)定麥汁中總β-葡聚糖(total β-glucan，TBG)的含量，TAX表示用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇沉淀的總阿拉伯木聚糖含量。

表4 17個(gè)大麥麥芽協(xié)定麥汁與過(guò)濾速度相關(guān)理化指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析表

表5 協(xié)定麥汁與過(guò)濾速度有關(guān)各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

注：*表示P<0.05，**表示在P<0.01，***表示P<0.001

2.4 凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定非淀粉多糖的分子量

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

按照1.2.7的方法測(cè)得標(biāo)樣Blue Dextran 20、DXT760K、DXT500K、DXT123K、DXT55K和DXT21K的出峰時(shí)間分別為96、126、138、168、186、216 min，以Kav值為橫坐標(biāo)，重均分子量Mw的lg值為縱坐標(biāo)，得到分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為lg(Mw)=-3.213 7Kav+6.3493，R2=0.995 2。

2.4.2 協(xié)定麥汁中不同分子量非淀粉多糖含量的測(cè)定

首先采用80%的乙醇沉淀麥汁中的非淀粉多糖，過(guò)0.45 μm膜后，取8 mL上樣后的凝膠過(guò)濾色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定協(xié)定麥汁中不同分子量非淀粉多糖的含量Fig.5 Determination of content of different molecular weight non-starch polysaccharide in congress mashby gel filtration charomatography

由圖5可知，利用Douglas法測(cè)定分部收集的樣品中的阿拉伯木聚糖含量的OD552值在正常范圍之內(nèi)，而利用剛果紅法檢測(cè)β-葡聚糖的OD550值非常低，影響了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。由于采用凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定非淀粉多糖的分子量時(shí)對(duì)樣品濃度存在很大的稀釋作用，如果樣品中非淀粉多糖濃度過(guò)低，經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾色譜柱分離后，柱后分部收集的樣品中難以準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)。在制備凝膠過(guò)濾色譜柱分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)，所用標(biāo)準(zhǔn)品的上樣濃度為500 mg/L，而表2中的17個(gè)麥芽樣品協(xié)定麥汁中總β-葡聚糖的含量均小于500 mg/L，這可能是造成檢測(cè)β-葡聚糖的OD550值偏低的原因。

在本文2.1的結(jié)論中，75%飽和度的硫酸銨沉淀中β-葡聚糖含量最高，并且含有較低的阿拉伯木聚糖含量，因此采用75%飽和度的硫酸銨沉淀麥汁中的β-葡聚糖，在復(fù)溶時(shí)通過(guò)少加蒸餾水的辦法來(lái)濃縮麥汁中的β-葡聚糖。濃縮5倍前后凝膠過(guò)濾色譜圖的效果對(duì)比見(jiàn)圖6。

圖6 采用75%飽和度的硫酸銨沉淀濃縮β-葡聚糖的凝膠過(guò)濾色譜圖Fig.6 Profile of gel filtration chromatogram of β-glucan before and after precipitation and concentration by 75% saturated ammonium sulfate

圖6的結(jié)果證明，采用75%飽和度的硫酸銨將β-葡聚糖濃縮5倍后的樣品，柱后分部收集的樣品中β-葡聚糖的OD550值達(dá)到了正常范圍。

最終，確定檢測(cè)麥汁中不同分子量段的2種非淀粉多糖含量的方法為：采用75%飽和度的硫酸銨沉淀麥汁中的β-葡聚糖并濃縮5倍后上樣于凝膠過(guò)濾色譜，按照1.2.4剛果紅法測(cè)定各管中的β-葡聚糖濃度；采用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇沉淀麥汁中的阿拉伯木聚糖，按照1.2.5 Douglas法測(cè)定各管中的阿拉伯木聚糖的濃度。

2.5 不同分子量段的非淀粉多糖與大麥麥芽過(guò)濾速度和黏度的關(guān)系

2.5.1 不同分子量段的阿拉伯木聚糖與大麥麥芽過(guò)濾速度和黏度的關(guān)系

采用2.4確定的樣品前處理和凝膠過(guò)濾色譜法分別測(cè)定17個(gè)大麥麥芽樣品的協(xié)定麥汁中不同分子量段的β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖的含量，以進(jìn)一步研究非淀粉多糖的分子量大小與過(guò)濾速度的關(guān)系，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6，相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 協(xié)定麥汁中不同分子量段阿拉伯木聚糖的含量

注：a是分子量大于1000 kDa的AX，b是分子量500～1000 kDa的AX，c是分子量50～500 kDa的AX，d是分子量小于50 kDa的AX。

表7 過(guò)濾速度和黏度與不同分子量段阿拉伯木聚糖的相關(guān)性分析

注：*表示P<0.05，**表示在P<0.01，***表示P<0.001。

由表7可知，分子量大于1 000 kDa、分子量500～1 000 kDa和分子量500～50 kDa的阿拉伯木聚糖含量與過(guò)濾速度均顯著相關(guān)(P<0.001)，而分子量小于50kDa的阿拉伯木聚糖含量與過(guò)濾速度沒(méi)有相關(guān)性。由表4中可知，總阿拉伯木聚糖含量與過(guò)濾速度的相關(guān)系數(shù)僅為-0.572(P<0.05)，而經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾色譜分離得到的分子量大于50 kDa的3個(gè)分子量段的阿拉伯木聚糖含量與過(guò)濾速度的相關(guān)系數(shù)分別提高到-0.768、-0.710及-0.755，且均為極顯著相關(guān)(P<0.001)，顯著性水平和相關(guān)系數(shù)均大幅提高，說(shuō)明總阿拉伯木聚糖中分子量大于50 kDa段的部分是影響協(xié)定麥汁過(guò)濾速度和黏度的重要因素。

2.5.2 不同分子量段的β-葡聚糖與大麥麥芽過(guò)濾速度和黏度的關(guān)系

17種麥芽協(xié)定麥汁中4個(gè)分子量段的β-葡聚糖含量見(jiàn)表8，相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表9。由表9可知，各個(gè)分子量段的β-葡聚糖含量和麥汁過(guò)濾速度沒(méi)有顯著的相關(guān)性(P>0.05)，分子量大于1 000 kDa段的β-葡聚糖與黏度極顯著相關(guān)(P<0.001)，而表3中總β-葡聚糖含量與黏度只是顯著相關(guān)(P<0.05)，并且相關(guān)系數(shù)由總β-葡聚糖的0.490提高到分子量大于1 000 kDa段的0.622，顯著性水平和相關(guān)系數(shù)均有較大提高。分子量大于1 000 kDa段的β-葡聚糖是影響協(xié)定麥汁黏度的重要因素，其通過(guò)影響協(xié)定麥汁的黏度間接影響了過(guò)濾速度。

表8 大麥麥芽協(xié)定麥汁中不同分子量段β-葡聚糖的含量

注：e是分子量大于1000 kDa的BG，f是分子量500～1000 kDa的BG，g是分子量50～500 kDa的BG，h是分子量小于50 kDa的BG。

表9 過(guò)濾速度和黏度與各分子量段β-葡聚糖含量的相關(guān)性分析

注：*表示P<0.05，**表示在P<0.01，***表示P<0.001

3 結(jié)論

(1)乙醇和硫酸銨沉淀麥汁中非淀粉多糖的特性不同。不同飽和度的硫酸銨沉淀的阿拉伯木聚糖含量明顯低于不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀的阿拉伯木聚糖含量，80%的乙醇沉淀出的阿拉伯木聚糖含量最高，75%飽和度的硫酸銨沉淀的β-葡聚糖含量最高。

(2)通過(guò)體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇沉淀協(xié)定麥汁中的阿拉伯木聚糖，75%飽和度的硫酸銨沉淀協(xié)定麥汁中的β-葡聚糖，采用凝膠過(guò)濾色譜可以測(cè)定不同分子量段的非淀粉多糖的含量。

(3)17個(gè)大麥麥芽樣品的數(shù)據(jù)分析表明，分子量大于50 kDa的阿拉伯木聚糖含量與協(xié)定麥汁的過(guò)濾速度和黏度均極顯著相關(guān)(P<0.001)，是造成過(guò)濾速度慢和黏度高的重要因素；分子量大于1 000 kDa的β-葡聚糖含量與黏度極顯著相關(guān)(P<0.01)，與過(guò)濾速度沒(méi)有相關(guān)性(P>0.05)，這部分β-葡聚糖通過(guò)影響協(xié)定麥汁黏度從而間接影響了過(guò)濾速度。

[1] BRIGGSD E,BOULTONC A,BROOKESP A,et al.Brewing:Science and Practice[M].Boca Raton,USA:CRC Press, 2004:136-142.

[2] SADOSKYP T.Effects of malting and mashing conditions on the molecular weights of arabinoxylan and beta-glucan in wort[D].North Dakota:North Dakota State University, 2008.

[3] 李胤.阿拉伯木聚糖溶解、降解機(jī)制的研究及酸性木聚糖酶基因的克隆、表達(dá)[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2006:14-30.

[4] DERVILLYG,LECLERCQC,ZIMMERMANND,et al.Isolation and characterization of high molar mass water-soluble arabinoxylans from barley and barley malt[J].Carbohydrate Polymers,2002,47(2):143-149.

[5] 金昭.基于蛋白質(zhì)組學(xué)的江蘇啤酒大麥麥芽過(guò)濾性能缺陷研究[D].無(wú)錫:江南大學(xué),2014:2-4.

[6] IRAKLIM,BILIADERISC G,IZYDORCZYKM S.Isolation,structural features and rheologicalproperties of water-extractable β-glucansfrom different Greek barley cultivars[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2004,84:1 170-1 178.

[7] 中華人民共和國(guó)國(guó)家發(fā)展和改革委員會(huì)QB/T1686—2008啤酒麥芽[S].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2008:3-5.

[8] 管敦儀.啤酒工業(yè)手冊(cè)(中冊(cè))[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1982:131-140.

[9] Europen Brewery Convention Analysis Committee. Analytica-EBC[M].Nurnberg,Germany:Verlag Hans Carl Getranke-Fachverlag,2010:73-75.

[10] ANDERSON I W.The effect of β-glucan molecular weight on the sensitivity of dye binding assay procedures for β-glucan estimation[J].Journal of the Institute of Brewing,1990,96(5):323-326.

[11] DOUGLASS G.A rapid method for the determination of pentosans in wheat flour[J].Food Chemistry,1981,7:139-145.

[12] Amersham Biosciences.Gel filtration principleand method[M]. Uppsala, Sweden: Amersham Biosciences,2002:107-108.

[13] 彭紅,林鹿,鄧海波,等.凝膠過(guò)濾層析分離纖維低聚糖[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(2):137-140.

[14] 陳海華,許時(shí)嬰,王璋.亞麻籽膠中酸性多糖和中性多糖的分離純化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2004,30(1):96-100.

[15] 郭藹光,郭澤坤.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:高等教育出版社,2007:132-135.

[16] DERVILLY G,LECLERCQ C,ZIMMERMANN D.Isolation and characterization of high molar mass water-soluble arabinoxylans from barley and barley malt[J].Carbohydrate Polymers,2002,47(2):143-149.

[17] SCHWARZP B,HANJ Y.Arabinoxylan content of commercial beers[J].Journal of the American Society of Brewing Chemists,1995,53(4): 157-159.

[18] DEBYSER W,DERDELINCKX G,DELCOUR J A.Arabinoxylan and arabinoxylanhydrolysing activities in barley malts and worts derived from them[J].Journal of Cereal Science,1997,26(1):67-74.

[19] 李胤,陸健,顧國(guó)賢.啤酒中戊聚糖的測(cè)定——地衣酚-鹽酸法[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(9):35-38.

[20] KANAUCHIM, ISHIKURAW, BAMFORTHC W.β-glucans and pentosans and their degradation products in commercial beers[J].Journal of the Institute of Brewing,2011,117(1):120-124.

[21] 李利民,朱永義,宮俊華,等.谷物中戊聚糖含量測(cè)定方法的比較研究[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,19(3):64-66.

[22] CYRAN M, IZYDORCZYK M S, MACGREGOR A W.Structural characteristics of water-extractable nonstarch polysaccharides from barley malt[J].Cereal Chemistry,2002,79(3):359-366.

[23] IZYDORCZYK M S,MACRI L J,MACGREGOR A W.Structure and physicochemical properties of barley non-starch polysaccharides-I. Water extractable β-glucans and arabinoxylans[J].Carbohydrate Polymers,1998,35:249-258.

[24] VIETOR R J,ANGELINO G F,VORAGEN A G J.Structural features of arabinoxylans from barley and malt cell wall material[J].Journal of Cereal Science,1992,15(3):213-222.

[25] DERVILLYA G,LECLERCQB C,ZIMMERMANNB D Isolation and characterization of high molar mass water-soluble arabinoxylans from barley and barley malt[J]. Carbohydrate Polymers,2002,47(2):143-149.

[26] HANJ Y. Structural characteristics of arabinoxylan in barley, malt, and beer[J].Food Chemistry,2000,70(2):131-138.

[27] VIETOR R J,VORAGEN A G J,ANGELINO GF.Composition of non-starch polysaccharides in wort and spent grain from brewing trials with malt from a good malting quality barley and a feed barley[J].Journal of the Institute of Brewing,1993,99(3):243-248.

[28] 張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1987:179-182.

[29] 伍志春,房燕麗,趙兵,等.溶劑萃取法從褐藻浸提液中分離提取褐藻糖膠[J].過(guò)程工程學(xué)報(bào),2002,2(2):127-131.

[30] ROURKET O.Malt specifications and brewing performance[J].The Brewer International, 2002,2(10):27-30.

Relationship between content and molecular weight of non-starch polysaccharides in barley malt and filtration rate of congress wort

SUN Jun-yong1,2,3, ZHANG Ming4, CHEN Liu5, PAN He-peng4, DING Yi3, LU Jian1,2,3*

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, JiangnanUniversity, Wuxi 214122, China) 3(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 4(Jiangsu NongkenMalting Co. Ltd., Yancheng 224300, China) 5(China Resources Snow Brewery(Shanghai) Co. Ltd., Shanghai 200949, China)

Several parameters associated with filtration rate of 17 barley malt samples were analyzed by Congress mash. Pearson correlation analysis showed that the filtration rate was significantly negatively correlated with viscosity and total arabinoxylan content. Viscosity was significantly positively correlated with total arabinoxylan content and total β-glucan content. After precipitation with 75% saturated ammonium sulfate and 80% ethanol respectively, solutions of β-glucan and arabinoxylan were injected to gel filtration chromatography column to analyze the contents of β-glucan and arabinoxylan with molecular weight greater than 1 000 kDa, 500-1 000 kDa, 50-500 kDa and less than 50 kDa. The results showed that, contents of arabinoxylan with molecular weight greater than 50 kDa were highly significantly negatively correlated with filtration rate and significantly positively correlated with viscosity., Content of β-glucan with molecular weight greater than 1 000 kDa were highly significantly positively correlated with viscosity. Compared with the total β-glucan and total arabinoxylan, the level of significance and coefficients of above correlation were greatly improved, which were main contributors to the high viscosity and slow filtration rate.

barley malt; filtration rate; non-starch polysaccharides; molecular weight; viscosity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704007

博士研究生(陸健教授為通訊作者，E-mail：jlu@jiangnan.edu.cn)。

江蘇省產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目(BY2016022-04)；國(guó)家高技術(shù)發(fā)展(863)計(jì)劃(2013AA102109)；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃(111計(jì)劃)資助項(xiàng)目(111-2-06)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助

2016-09-09，改回日期：2016-10-30