巴西橡膠樹(shù)的基因組序列框架圖

田 郎 譯

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所,海南 儋州 571737)

巴西橡膠樹(shù)的基因組序列框架圖

田 郎 譯

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所,海南 儋州 571737)

巴西橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)為大戟科多年生木本植物,也是迄今為止全世界商品天然橡膠(NR)的主要來(lái)源。NR是一種具有高彈性、高可塑性及高回彈力的膠乳聚合物，自1876年以來(lái), NR在世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展中一直都起著至關(guān)重要的作用。本文報(bào)道巴西橡膠樹(shù)的基因組序列框架圖。已組裝的基因組序列大約1.1 Gb,約占整個(gè)單倍體基因組估計(jì)長(zhǎng)度(2.15 Gb)的51%。該基因組中大約有78%為重復(fù)DNA。通過(guò)基因預(yù)測(cè)共鑒定出68955個(gè)基因模型，其中12.7%為橡膠樹(shù)所特有。此外，大多數(shù)與橡膠生物合成、橡膠木材形成、病害抗性以及致敏性有關(guān)的關(guān)鍵基因也被成功鑒定。從該基因組獲得的序列信息將有助于人們進(jìn)一步培育高產(chǎn)無(wú)性系，以充分滿(mǎn)足全世界對(duì)天然橡膠不斷增長(zhǎng)的需求。

巴西橡膠樹(shù)；大戟科；天然橡膠；基因組

1 背景

橡膠是生產(chǎn)和制造5 000多種產(chǎn)品不可或缺的重要材料[1]。全世界大約有2 500種植物均能合成橡膠[2],但其中只有巴西橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)是商品天然橡膠(NR)的主要來(lái)源。該大戟科物種起源于南美亞馬孫盆地，但直到19世紀(jì)才開(kāi)始大規(guī)模用于商業(yè)開(kāi)發(fā)，不過(guò)其人工馴化栽培并非始于其南美起源地。如今，人工栽培的橡膠樹(shù)主要分布于亞洲、非洲及拉丁美洲的熱帶地區(qū)。橡膠樹(shù)大約種植7 a后可開(kāi)始收獲膠乳，其經(jīng)濟(jì)壽命約25～30 a。根據(jù)國(guó)際橡膠研究組織(www.rubberstudy.com)統(tǒng)計(jì), 2011年全球天然橡膠的產(chǎn)量將近1100萬(wàn)t,其中亞洲約占93%。在20世紀(jì)，全世界橡膠(包括天然和合成橡膠)的需求量一直呈現(xiàn)穩(wěn)步上升的態(tài)勢(shì)，預(yù)計(jì)今后還會(huì)繼續(xù)增長(zhǎng)。

NR是一種具有彈性強(qiáng)、可塑性高、回彈力強(qiáng)、 抗沖擊力強(qiáng)以及散熱性良好等諸多性能的膠乳聚合物[2]。這些優(yōu)良性能使得NR在許多產(chǎn)品的制造上難以被合成橡膠所取代，如醫(yī)用手套及飛機(jī)和卡車(chē)的重型輪胎。NR由94%的順式-1,4-聚異戊二烯和6%的蛋白質(zhì)及脂肪酸組成[3]。順式-1,4-聚異戊二烯這種生物高聚物由含5個(gè)碳的異戊烯焦磷酸(IPP)單體構(gòu)成，并在橡膠粒子的表面通過(guò)縮合反應(yīng)而生成。橡膠鏈的延伸由順式-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(CPTs)，也稱(chēng)橡膠多聚酶催化[4]，所產(chǎn)生的聚合物的分子量是決定橡膠質(zhì)量的重要因素。僅有為數(shù)不多的植物能夠大量合成高質(zhì)量NR(分子量>100萬(wàn)Da)，其中包括巴西橡膠樹(shù)以及潛在的橡膠樹(shù)替代作物銀膠菊(Partheniumargentatum) 和俗稱(chēng)橡膠草的俄羅斯蒲公英(Taraxacumkoksaghyz)[5]。

除了NR之外，當(dāng)橡膠樹(shù)進(jìn)入膠乳生產(chǎn)末期而失去生產(chǎn)價(jià)值時(shí)，它們還可作為木材加以利用。如今，橡膠木已成為東南亞的一種主要出口木材[1]。橡膠木材的天然色澤及優(yōu)良物理性質(zhì)使其非常適于制作實(shí)木地板及家具。有鑒于此，人們業(yè)已培育出了多個(gè)膠木兼優(yōu)的橡膠無(wú)性系。

橡膠樹(shù)的病害及橡膠制品的致敏性也是橡膠業(yè)關(guān)注和擔(dān)憂(yōu)的重要問(wèn)題。真菌病害，例如由病原菌Microcyclusulei引起的南美葉疫病(SALB)，以及分別由病原菌Colletotrichum、Oidium和Corynespora引起的落葉病是橡膠生產(chǎn)的主要威脅[1]。在20世紀(jì)30年代中期，SALB摧毀了整個(gè)巴西的植膠業(yè)。亞洲的橡膠園雖然尚未受到該病害的侵襲，但此病一旦在該地區(qū)爆發(fā)將會(huì)產(chǎn)生毀滅性的后果。因直接接觸某些天然橡膠制品(如橡膠手套)而引發(fā)的人體過(guò)敏反應(yīng)一直是醫(yī)學(xué)上關(guān)注的重要問(wèn)題之一。引起這類(lèi)過(guò)敏癥的過(guò)敏源主要為橡膠樹(shù)的膠乳中存在的某些蛋白質(zhì)。近年來(lái)，人們已開(kāi)始嘗試將銀膠菊作為低致敏性膠乳的生產(chǎn)來(lái)源[2]。

常規(guī)育種方法的局限性及基因組信息的匱乏和不足已嚴(yán)重地阻礙和制約巴西橡膠樹(shù)的遺傳改良。分子標(biāo)記輔助選擇通過(guò)對(duì)目標(biāo)基因型的直接選擇可有效地提高育種效率。標(biāo)記間的遺傳連鎖分析以及理想表型的遺傳定位將進(jìn)一步提高選擇的準(zhǔn)確度。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展及應(yīng)用[6-12]在一定程度上拓寬并豐富了巴西橡膠樹(shù)的基因資源。然而迄今為止，該物種的全基因組信息依然十分欠缺。之前人們的研究大都集中于轉(zhuǎn)錄組分析,但事實(shí)上,基因組的非編碼區(qū)域?qū)α私饪刂苹虮磉_(dá)的調(diào)控元件以及建立一整套更加全面的分子標(biāo)記必不可少。本文首次報(bào)道巴西橡膠樹(shù)的基因組序列框架圖,以期為該重要經(jīng)濟(jì)作物的進(jìn)一步改良提供一個(gè)良好的平臺(tái)。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因組測(cè)序及注釋

本研究對(duì)馬來(lái)西亞橡膠研究院培育的巴西橡膠樹(shù)高產(chǎn)無(wú)性系RRIM600進(jìn)行了全基因組測(cè)序，該無(wú)性系的親本組合為T(mén)jir1×PB86。巴西橡膠樹(shù)的基因組序列分布于18對(duì)染色體上[13]，通過(guò)孚耳根微顯影[14]其單倍體基因組估計(jì)約2.15 Gb。我們采用全基因組鳥(niǎo)槍法(whole-genome shotgun，WGS)并利用Roche/454, Illumina, 以及SOLiD測(cè)序平臺(tái)獲得大約43×覆蓋率的序列數(shù)據(jù)(表1)。由于大多數(shù)測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)自Roche/454平臺(tái), reads(讀取片段)相對(duì)較長(zhǎng)，尤其是鳥(niǎo)槍片段(shotgun)為單端測(cè)序,故我們選用Newbler軟件[15]進(jìn)行最后的組裝[16]。對(duì)于初步組裝的序列我們還對(duì)其進(jìn)行了重復(fù)基序的鑒定,并去除與重復(fù)區(qū)域匹配的原始測(cè)序reads，同時(shí)整個(gè)拼裝過(guò)程均采用嚴(yán)格的組裝參數(shù)。在濾除重復(fù)匹配reads之后，我們僅根據(jù)27.86Gb即大約13×覆蓋率的測(cè)序數(shù)據(jù)(表1)最終組裝獲得總長(zhǎng)為1119Mb的序列支架(scaffolds),其N(xiāo)50 scaffold長(zhǎng)度為2972bp(表2)。之后,根據(jù)154個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記[17],我們將143個(gè)scaffolds以及1325個(gè)關(guān)聯(lián)基因錨定到了巴西橡膠樹(shù)的18個(gè)連鎖群上。在已定位的scaffolds中，還鑒定出另外74個(gè)已報(bào)道過(guò)的標(biāo)記。這些標(biāo)記大部分被定位在基因間隔區(qū)。

本研究基于全基因組鳥(niǎo)槍法(WGS)策略,并完全采用新一代測(cè)序技術(shù)成功構(gòu)建巴西橡膠樹(shù)的全基因組框架圖,而其它植物中僅有少數(shù)幾種采用類(lèi)似方法獲得全基因組序列圖譜。與我們的研究方法一樣,Shulaev V等人在草莓中也是結(jié)合采用Roche/454，Illumina以及SOLiD平臺(tái)的reads(39×覆蓋率)構(gòu)建其全基因組圖譜，不過(guò)草莓基因組(240Mb)幾乎比橡膠樹(shù)小9倍，而且重復(fù)DNA的比例要小得多(22%)，在此情況下所得到的contigs/scaffolds相對(duì)要大得多[18]。然而,本研究中我們所拼裝得到的最大scaffold(531.5 kb)與大麻基因組利用Illumina和Roche/454測(cè)序數(shù)據(jù)組裝獲得的最大scaffold的長(zhǎng)度(565.9 kb)幾乎相當(dāng)[19]。橡膠基因組組裝的主要挑戰(zhàn)在于其大量重復(fù)序列的存在,這也是KFX Mayer等人在大麥基因組(5.1Gb，84%重復(fù)DNA)組裝過(guò)程中所遇到的一個(gè)難題，他們?cè)谌蚪M鳥(niǎo)槍法測(cè)序中對(duì)Illumina平臺(tái)產(chǎn)生的短reads進(jìn)行拼接僅獲得長(zhǎng)度相對(duì)較短的contigs(N50=1425 bp)[20]。不過(guò)，當(dāng)將其與BAC物理圖譜及高分辨率遺傳圖譜相結(jié)合時(shí)，依然可實(shí)現(xiàn)染色體水平上的序列重建。因此,對(duì)橡膠樹(shù)而言,下一步要做的就是結(jié)合物理圖譜或其它能夠提供更多序列毗連信息的方法以進(jìn)一步改進(jìn)其基因組拼裝的質(zhì)量。

利用基因組重復(fù)序列分析軟件RepeatModeler及RepeatMasker,在我們組裝的序列中有72.01%被鑒定為重復(fù)DNA(不包括低復(fù)雜度區(qū)域及RNA基因),由此估計(jì)重復(fù)序列約占橡膠樹(shù)基因組的78%,這與玉米(85%)[21]和大麥(84%)[20]相當(dāng)。分析還顯示,長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)類(lèi)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子為最主要的一類(lèi)轉(zhuǎn)座元件(占總重復(fù)序列的46.15%),其中又以Gypsy類(lèi)(38.20%)和Copia類(lèi)(7.38%)為最多?？偟闹貜?fù)元件中僅有不到2%為DNA轉(zhuǎn)座子。重復(fù)元件中的大部分(50.24%)與任何已知的家族均無(wú)關(guān)。

注：* 來(lái)自Illumina測(cè)序平臺(tái)的 reads 通過(guò)去除與重復(fù)區(qū)域匹配的reads進(jìn)行過(guò)濾，來(lái)自SOLiD測(cè)序平臺(tái)的 reads通過(guò)只保留長(zhǎng)度至少為50 pb的雙末端測(cè)序reads進(jìn)行過(guò)濾。

表2 巴西橡膠樹(shù)基因組組裝及注釋統(tǒng)計(jì)資料

注：*指將所有scaffolds按長(zhǎng)度從長(zhǎng)到短排序并累加，當(dāng)累加長(zhǎng)度達(dá)到所有scaffolds總長(zhǎng)度50%時(shí)最后1個(gè)scaffold的長(zhǎng)度；**指將所有scaffolds按長(zhǎng)度從長(zhǎng)到短排序并累加，當(dāng)累加長(zhǎng)度達(dá)到所有scaffolds總長(zhǎng)度50%時(shí)scaffolds的總數(shù)。

結(jié)合來(lái)自多個(gè)從頭基因預(yù)測(cè)程序以及轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)比對(duì)的證據(jù)和信息,我們采用EVidenceModeler(EVM)軟件[22]從已屏蔽的組裝序列中預(yù)測(cè)出68 955個(gè)基因模型，基因、外顯子及內(nèi)含子的平均長(zhǎng)度分別為1 332 bp、238 bp及332 bp(表2)。在已公布的137 540個(gè)橡膠樹(shù)表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)及組裝的轉(zhuǎn)錄本中，有95.4%存在于該基因組中。為了給基因模型預(yù)測(cè)及確認(rèn)提供進(jìn)一步的支持，我們還進(jìn)行了葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并利用Roche/454及Illumina測(cè)序平臺(tái)分別獲得1 085 Mb和4.89 Gb的轉(zhuǎn)錄組序列。之后這些序列被從頭組裝進(jìn)73 060個(gè)contigs(重疊群)。分析顯示，這些contigs中99%以上均與組裝的基因組序列相匹配，同時(shí)，來(lái)自Roche/454測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組讀取片段中有81%也與之相匹配。這些結(jié)果表明,我們組裝的基因組框架序列中已包含了該植物的大部分基因。

本研究借助不同數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)來(lái)自預(yù)測(cè)基因的蛋白質(zhì)序列作了進(jìn)一步的注釋,這些數(shù)據(jù)庫(kù)包括NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)，SwissPro蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)[23], InterPro 蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)[24], 以及KEGG生物學(xué)通路數(shù)據(jù)庫(kù)[25]。真核直系同源蛋白簇(KOG)[26]分析顯示,蛋白質(zhì)的數(shù)量在“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制”( 5 216個(gè)),“翻譯后修飾, 蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn), 分子伴侶”(2 886個(gè)),以及“碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝”(1 665個(gè))等功能范疇上明顯占更高比例。此外, 富含亮氨酸重復(fù)(LRR)是該基因組中最為豐富的 Pfam[27]結(jié)構(gòu)域。在預(yù)測(cè)的基因中，有6.7%含有信號(hào)肽，其中大多數(shù)被定位在質(zhì)體及細(xì)胞外結(jié)構(gòu)中。

除了蛋白質(zhì)編碼基因之外，我們還鑒定出了729個(gè)tRNA基因，其中包括12個(gè)抑制(Sup)tRNA，32個(gè)假基因，以及4個(gè)功能未定的tRNA基因。令人感興趣的是，我們還觀察到了tRNA基因成簇分布的現(xiàn)象，例如所有Sup tRNA基因僅出現(xiàn)在2個(gè)scaffolds之中(9個(gè)在scaffold 134 351中，3個(gè)在scaffold 134 362中)。另外，我們?cè)诮M裝的序列中還鑒定出了5S(113個(gè)拷貝)、5.8S(18個(gè)拷貝)、18S(11個(gè)拷貝)以及28S (21個(gè)拷貝) rRNA基因。

2.2 系統(tǒng)發(fā)生分析及種系特異性基因

利用來(lái)自17個(gè)已測(cè)序植物基因組的114個(gè)單拷貝直系同源基因簇進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，巴西橡膠樹(shù)與木薯(Manihotesculenta)共有一個(gè)最近的祖先(圖1)，這與該植物葉綠體基因組的鑒定分析結(jié)果也相一致[28]。除了大戟科之外，與之關(guān)系最為密切的已測(cè)序基因組為毛果楊(Populustrichocarpa)。與Shulaev V等人基于154個(gè)核基因所作被子植物系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果一致[18]，我們的分析結(jié)果也顯示，金虎尾目(包括楊柳科的楊屬及大戟科)與錦葵類(lèi)植物的其它成員擁有一個(gè)共同的祖先。

對(duì)13個(gè)有代表性的植物基因組(分為大戟科、雙子葉植物、單子葉植物及低等植物4組)進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該4組基因組共有一套包括7140個(gè)基因家族的核心基因，而有9516個(gè)基因家族則為大戟科組所特有(圖2a)。比較4個(gè)已測(cè)序的大戟科植物基因組(即麻風(fēng)樹(shù)、蓖麻、木薯和巴西橡膠樹(shù)),其結(jié)果顯示，共包含8748個(gè)基因的2708個(gè)基因家族為橡膠樹(shù)所特有(圖2b)。這些橡膠樹(shù)特有基因可被歸入526個(gè)GO[29]功能范疇，266個(gè)InterPro 結(jié)構(gòu)域，以及267個(gè)Pfam結(jié)構(gòu)域。最為豐富的InterPro 及Pfam結(jié)構(gòu)域是富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)及蛋白激酶。KOG分析顯示，這些基因中的大多數(shù)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞骨架，以及翻譯后修飾有關(guān)。

采用PhyML軟件并利用分布在17個(gè)已測(cè)序物種的144個(gè)單拷貝直系同源基因簇構(gòu)建基于最大似然法的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。最優(yōu)樹(shù)的尋找選用SPR(子樹(shù)修剪與嫁接)和NNI(最近鄰居互換)算法中最佳的一個(gè)。分析顯示巴西橡膠樹(shù)在分類(lèi)學(xué)上屬于錦葵類(lèi)植物,并與木薯(M.esculenta)的親緣關(guān)系更近。 采用自舉法(bootstraping) 檢驗(yàn)系統(tǒng)樹(shù)的可信度(隨機(jī)重復(fù)次數(shù)=100,隨機(jī)種子數(shù)目=7),自舉檢驗(yàn)值(bootstraping值)示于圖中每個(gè)分支的節(jié)點(diǎn)處。

a.利用OrthoMCL軟件鑒定出13個(gè)植物物種特有及共有的基因家族；b. 利用OrthoMCL軟件鑒定出4個(gè)已測(cè)序大戟科物種特有及共有的基因家族

2.3 橡膠生物合成

橡膠生物合成涉及碳固定、同化物裝載運(yùn)輸、橡膠前體物質(zhì)合成與代謝以及乳管中聚異戊二烯的儲(chǔ)存等諸多過(guò)程。蔗糖既為橡膠生物合成提供碳骨架又為合成提供能量,而乳管則是其強(qiáng)大的吸收匯[30]。本研究中,我們重構(gòu)了巴西橡膠樹(shù)橡膠生物合成的整個(gè)代謝途徑。橡膠的生物合成過(guò)程包括12個(gè)主要步驟(圖3)并涉及417個(gè)基因。我們還確證了這些來(lái)自葉片和(或)膠乳cDNA庫(kù)的基因的表達(dá)，并且在大多數(shù)基因家族中至少檢測(cè)到了1個(gè)異構(gòu)體。此外，我們將巴西橡膠樹(shù)的基因組與得自銀膠菊產(chǎn)膠樹(shù)皮組織的ESTs[31]進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有360個(gè)橡膠樹(shù)的基因與銀膠菊ESTs相匹配，其中有205個(gè)基因與最佳匹配物的序列一致性高于70%。

注:白色小框中數(shù)字為每個(gè)步驟所涉及酶與蛋白的數(shù)量,黑色小框中數(shù)字為橡膠樹(shù)中直系同源體的數(shù)量。圖3 天然橡膠生物合成的12個(gè)主要途徑示意圖

蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其表達(dá)模式與割膠和橡膠生產(chǎn)有直接關(guān)系[32]。蔗糖及單糖借助蔗糖和單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SUT和MT)被輸送進(jìn)乳管細(xì)胞溶質(zhì)，該2種蛋白質(zhì)分別由7個(gè)和30個(gè)基因編碼。β-呋喃果糖苷酶和果聚糖β-果糖甙酶能將蔗糖轉(zhuǎn)變成單糖,并且在巴西橡膠樹(shù)中發(fā)現(xiàn)大量此類(lèi)基因(31個(gè)),這充分表明該功能在橡膠生物合成中的重要性。過(guò)多的蔗糖則以果聚糖和淀粉形式被儲(chǔ)存，并能夠用作以后橡膠生物合成的碳源。果聚糖代謝包括9個(gè)酶促步驟(由54個(gè)基因編碼)，而淀粉代謝則涉及11個(gè)酶促反應(yīng)(由38個(gè)基因編碼)。碳通過(guò)醣酵解(由52個(gè)基因編碼)、可供選擇的磷酸戊糖途徑(由14個(gè)基因編碼)以及乙酰輔酶A生物合成途徑(由120個(gè)基因編碼)定向生成中間底物，用于橡膠前體物的生物合成。

用于橡膠生物合成的類(lèi)異戊二烯前體由非自主型的細(xì)胞質(zhì)甲羥戊酸途徑(MVA)以異戊烯基焦磷酸(IPP)的形式提供[33]。有人認(rèn)為自主型的質(zhì)體甲羥戊酸途徑(MEP)也能為橡膠生物合成提供IPP[34]。最近，橡膠樹(shù)實(shí)生苗的13C-標(biāo)記研究顯示，MEP途徑為類(lèi)胡羅卜素的生物合成提供IPP，但并不為橡膠生物合成提供IPP[35]。不過(guò)，MVA和MEP途徑基因的表達(dá)分析顯示，在并不產(chǎn)生大量類(lèi)胡羅卜素的成齡橡膠樹(shù)或無(wú)性系中，MEP途徑很可能是提供IPP的另一條替代途徑[8]。在巴西橡膠樹(shù)基因組中，我們鑒定出了18個(gè)和29個(gè)分別參與MVA及MEP途徑的酶基因?；罨南┍沽姿?法尼基焦磷酸, 香葉基香葉基焦磷酸，或者十一異戊二烯焦磷酸)為引發(fā)橡膠生物合成所必需[36]。這些活化物的產(chǎn)生涉及5個(gè)酶促步驟并與組裝序列中的21個(gè)基因有關(guān)。

參與類(lèi)異戊二烯聚合的橡膠聚合酶屬順式-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(CPTs)家族[37]。我們從橡膠樹(shù)的基因組中鑒定出了8個(gè)CPTs(命名為CPT 1-8)，并采用最大似然法和MEGA5.05軟件[38]推斷其進(jìn)化歷史，根據(jù)進(jìn)化關(guān)系將其分成3個(gè)類(lèi)群(圖4)。我們發(fā)現(xiàn)，第2和第3類(lèi)群中的巴西橡膠樹(shù)CPTs與其它植物的CPTs(十一異戊二烯焦磷酸合成酶及脫氫多萜醇焦磷酸合成酶)具有同源性，在這些植物中，CPTs 負(fù)責(zé)短鏈C5-異戊二烯(C55-C120)的延伸。由CPT 1-3組成的第1類(lèi)群為巴西橡膠樹(shù)所特有,該組成員的作用被證明是催化長(zhǎng)鏈C5-異戊二烯的形成[4]。這些CPTs中,僅第3類(lèi)群中的CPT 4含有內(nèi)含子,而且該CPT與其它CPT的同源性最小。小橡膠粒子(SRPP)及橡膠延伸因子(REF)是參與橡膠生物合成的另外2種關(guān)鍵蛋白質(zhì)[5]，在我們組裝的序列中分別鑒定出其10個(gè)和12個(gè)相關(guān)基因。

2.4 橡膠木材

成年橡膠樹(shù)當(dāng)進(jìn)入膠乳生產(chǎn)末期后，還可作為一種木材來(lái)源用于家具及其它產(chǎn)品的制造。木材質(zhì)量與幾個(gè)木質(zhì)纖維素基因密切相關(guān)[39]。本研究中，我們?cè)诎臀飨鹉z樹(shù)中鑒定出了127個(gè)相關(guān)基因。與擬南芥和楊樹(shù)相比,我們?cè)谙鹉z樹(shù)中鑒定出了36個(gè)纖維素合酶(CesA)編碼基因,而前2者中僅分別鑒定出10個(gè)[40]和18個(gè)[41]這樣的基因。本研究在巴西橡膠樹(shù)中也鑒定出與半纖維素生物合成有關(guān)的基因，而且α-L-巖藻糖苷酶的數(shù)量要多于α-L-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，這與楊樹(shù)相似[42]。木質(zhì)素是一種由木質(zhì)素單體組成的雜聚物，它決定著木材的質(zhì)地和硬度。分析顯示，橡膠樹(shù)基因組中參與木質(zhì)素單體生物合成的一整套基因與楊樹(shù)基因組存在最大相似性。與楊樹(shù)基因組相比，橡膠樹(shù)中咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)和肉桂醇脫氫酶(CAD)的數(shù)量明顯要少(橡膠樹(shù)和楊樹(shù)中的COMT分別為10個(gè)和41個(gè)，CAD分別為5個(gè)和24個(gè))。這可能和楊樹(shù)木材的硬度[39]與橡膠木材不同有關(guān)。本研究還鑒定出了一系列參與木質(zhì)素單體運(yùn)輸、貯藏、調(diào)動(dòng)以及其最后聚合形成木質(zhì)素的基因。

采取最大似然法并利用MEGA5.05軟件推斷其進(jìn)化歷史。去除所有包含比對(duì)空格及缺少數(shù)據(jù)的位點(diǎn)。CPT，順式-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶；UPPS，十一異戊烯焦磷酸合酶；DHDDS，脫氫多萜醇焦磷酸合酶；自舉檢驗(yàn)值(重復(fù)100次)示于圖中分支節(jié)點(diǎn)處。

2.5 病害抗性

橡膠樹(shù)高度感染真菌病害，因此抗病基因的鑒定歷來(lái)是橡膠樹(shù)的研究重點(diǎn)之一。超敏反應(yīng)(HR)是一種能引起植物組織壞死或細(xì)胞死亡從而達(dá)到限制病原菌生長(zhǎng)的早期防御機(jī)制。據(jù)報(bào)道，水楊酸和茉莉酸作為植物信號(hào)分子在引發(fā)系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)及誘導(dǎo)某些病程相關(guān)蛋白(PR)中起著關(guān)鍵作用[43]。核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)編碼抗性基因家族在植物中是最大的一類(lèi)抗性基因[44]。在巴西橡膠樹(shù)中，我們鑒定出了618個(gè)該家族成員，與水稻(Oryza sativa)中鑒定出的數(shù)量相當(dāng)。這些基因被分成6個(gè)亞類(lèi)，即toll-白細(xì)胞介素類(lèi)似受體(TIR)-NBS、卷曲螺旋(CC)-NBS、NBS、TIR-NBS-LRR、CC-NBS-LRR以及NBS-LRR，其中多數(shù)不含LRR結(jié)構(gòu)域，而與此相比，其它植物中含有LRR的類(lèi)型通常更為豐富。我們?cè)诮M裝的基因組中還鑒定出147個(gè)病程相關(guān)蛋白(PR)和96個(gè)早期防御(SAR及HR)相關(guān)基因。所有這些病害抗性基因分布在665個(gè)序列支架中，并且NBS編碼基因通常被發(fā)現(xiàn)于這群序列中(如有9個(gè)NBS-LRR基因存在于骨架序列409956中)。此外，我們還重構(gòu)了巴西橡膠樹(shù)的植物系統(tǒng)獲得性抗病性(SAR)及超敏反應(yīng)(HR)信號(hào)途徑。所有這些信息均有可能用于對(duì)植物生物脅迫的管控。

2.6 膠乳過(guò)敏源

天然橡膠膠乳(NRL)過(guò)敏癥是全球關(guān)注的一個(gè)重要醫(yī)學(xué)問(wèn)題。國(guó)際公認(rèn)的NRL過(guò)敏源有14種，分別被稱(chēng)為Hevb 1至Hevb 14(www.allergen.org)。在橡膠樹(shù)中，這些過(guò)敏源被100個(gè)基因編碼。膠乳中的大多數(shù)過(guò)敏源是含量極為豐富且與脅迫和防御相關(guān)的蛋白[45]。導(dǎo)致對(duì)天然橡膠膠乳(NRL)過(guò)敏的主要過(guò)敏源中，Hevb 6 (橡膠素)由16個(gè)基因編碼，而Hevb 5則是一個(gè)單拷貝基因。與橡膠粒子有關(guān)的Hevb 1 (REF,橡膠延伸因子)和Hevb 3 (SRPP,小橡膠粒子)分別由12個(gè)和10個(gè)基因編碼。由5個(gè)基因編碼的Hevb 4 ( 卵磷脂酶同系物)和由9個(gè)基因編碼的Hevb 13 (酯酶)也被稱(chēng)為含糖過(guò)敏源。編碼交叉反應(yīng)蛋白Hevb 8 (抑制蛋白)、Hevb 9( 烯醇酶)以及Hevb 10 (錳超氧化物歧化酶)的基因分別有6個(gè)、4個(gè)及2個(gè)。防御相關(guān)過(guò)敏源Hevb 2(β-1,3-葡聚糖酶)及Hevb 11 (幾丁質(zhì)酶)各自有11個(gè)基因。Hevb 11的結(jié)構(gòu)域分析顯示，該結(jié)構(gòu)域存在1個(gè)長(zhǎng)18～23個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，此信號(hào)肽能引發(fā)植物的系統(tǒng)傷害反應(yīng)[46]。除了上述的膠乳過(guò)敏源之外，我們還在橡膠樹(shù)中鑒定出了4類(lèi)非膠乳過(guò)敏源，即花粉過(guò)敏源、α-膨脹素、β-膨脹素以及異黃酮還原酶。

2.7 轉(zhuǎn)錄因子

巴西橡膠樹(shù)的基因組大約含有6000個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,它們分布在50個(gè)主要家族之中。轉(zhuǎn)錄因子約占巴西橡膠樹(shù)基因模型的8.5%,而其中bHLH、MYB、C3H、G2-like以及WRKY等家族的轉(zhuǎn)錄因子所占比例又大大超過(guò)其它家族。大多數(shù)植物中數(shù)量最多的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族在橡膠樹(shù)中多達(dá)752個(gè)成員。MYB是一個(gè)多樣化的轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族的轉(zhuǎn)錄因子與bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子互作從而調(diào)節(jié)次生代謝[47]及生物和非生物脅迫，在橡膠樹(shù)中該家族成員的數(shù)量也多達(dá)570個(gè)。C3H家族轉(zhuǎn)錄因子涉及花發(fā)育、胚胎發(fā)生、越冬以及葉片衰老[48]，其成員數(shù)為470個(gè)。之后為G2-like和WRKY家族的轉(zhuǎn)錄因子，它們?cè)谙鹉z樹(shù)中的成員數(shù)分別為461和445個(gè)。據(jù)報(bào)道該2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族分別參與了植物的光合調(diào)控[49]及免疫應(yīng)答[50]。此外，橡膠樹(shù)中成員數(shù)較多的轉(zhuǎn)錄因子家族還有MYB-related(397個(gè))、NAC(336個(gè))以及ERF(246個(gè))等。MADS-box基因是一類(lèi)編碼與花器官發(fā)育有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的同源異型基因。MADS-box基因被分為5類(lèi)，即Mα、Mβ、Mγ、 Mδ (即 MIKC*) 和MIKCc[51]，它們?cè)谙鹉z樹(shù)中共有112個(gè)成員。在這112個(gè)成員中有79個(gè)屬于II型MADS-box基因(Mδ和MIKCc組)，而該類(lèi)型基因在擬南芥、楊樹(shù)及水稻中的數(shù)量為54～67個(gè)。與此相比, I型的 MADS-box基因 (包括Mα、Mβ及Mγ組)在橡膠樹(shù)中的數(shù)量只有33個(gè)，而其它3個(gè)物種中則存在29～94個(gè)。此外, 巴西橡膠樹(shù)中的MADS-box基因僅有12.5%(112個(gè)中的14個(gè))以成簇形式存在,而與此相比，番木瓜的MADS-box基因中則有47% 在基因組中成簇存在[52]。

2.8 植物激素生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

分析顯示, 巴西橡膠樹(shù)中存在為數(shù)眾多的植物激素生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因。被子植物基因組通常都含有較大比例的生長(zhǎng)素信號(hào)通路相關(guān)基因,已鑒定出的基因家族達(dá)12個(gè)。不過(guò)，與其它植物相比，橡膠樹(shù)中有些生長(zhǎng)素基因家族成員明顯減少，尤其是生長(zhǎng)素上調(diào)小RNA(SAUR)及生長(zhǎng)素(IAA)阻遏蛋白家族成員的數(shù)量顯著少于楊樹(shù)、擬南芥及水稻。赤霉素-20-氧化酶是赤霉素生物合成中的一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶，在巴西橡膠樹(shù)中共鑒定出5個(gè)直系同源基因，而蓖麻及水稻中僅存在1個(gè)這樣的基因。乙烯響應(yīng)元件結(jié)合因子(ERF)在橡膠樹(shù)中共有246個(gè)直系同源基因，該數(shù)量大大多于其它植物。ERF轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量的增加可能與橡膠樹(shù)中特定的乙烯依賴(lài)途徑有關(guān)。12-氧-植物二烯酸還原酶(OPR7)是茉莉酸生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶，在橡膠樹(shù)中存在13個(gè)編碼基因。一氧化氮合成酶參與一氧化氮的生物合成，而一氧化氮在很多植物抗病防御機(jī)制中起著特別重要的作用。在擬南芥、蓖麻、楊樹(shù)以及水稻中，一氧化氮合成酶基因是一個(gè)高度保守的單拷貝基因，但在巴西橡膠樹(shù)種卻有4個(gè)拷貝。

2.9 光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及生物鐘相關(guān)基因

光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與生物鐘相互聯(lián)系并對(duì)植物的生理活動(dòng)具有十分重要的影響。光是最重要的環(huán)境信號(hào)之一，來(lái)自環(huán)境的光信號(hào)作用于植物內(nèi)在的計(jì)時(shí)機(jī)制,即生物鐘使植物的生理節(jié)奏與環(huán)境的晝夜及季節(jié)性變化相一致[53]。與楊樹(shù)和擬南芥相比,巴西橡膠樹(shù)中涉及光感受及晝夜節(jié)律的基因數(shù)明顯增加,數(shù)量多達(dá)154個(gè),而楊樹(shù)和擬南芥中的數(shù)量分別僅有77和66個(gè)。這些結(jié)果表明，環(huán)境信號(hào)強(qiáng)烈參與橡膠樹(shù)生理活動(dòng)及機(jī)能的調(diào)控。

2.10 F-box蛋白質(zhì)

F-box蛋白質(zhì)是SCF(Skp1p-cullin-F-box)蛋白質(zhì)復(fù)合體的組成部分，在植物中SCF復(fù)合物廣泛參與泛素/26S蛋白酶體途徑所介導(dǎo)的蛋白質(zhì)選擇性降解[54]。F-box蛋白質(zhì)在其N(xiāo)-端存在一個(gè)保守F-box結(jié)構(gòu)域(40-50個(gè)氨基酸)。據(jù)報(bào)道,這類(lèi)蛋白質(zhì)參與植物眾多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié),如葉片衰老、開(kāi)花、分枝、光敏素與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及自交不親和等[55]。巴西橡膠樹(shù)基因組中含有655 個(gè)F-box基因,而該家族基因在釀酒葡萄(Vitisvinifera)、番木瓜 (Caricapapaya)、毛果楊、擬南芥 (Arabidopsisthaliana)以及水稻中的數(shù)量分別為315、198、425、897以及971個(gè)[56]。這一結(jié)果頗令人感興趣，因?yàn)榕c人們的預(yù)期正好相反,一年草本生植物的F-box基因家族其基因數(shù)量較之木本的多年生植物反而出現(xiàn)了明顯的擴(kuò)張[55]。

2.11 類(lèi)胡蘿卜素

類(lèi)胡蘿卜素在光捕獲、光保護(hù)、光形態(tài)建成、脂質(zhì)過(guò)氧化以及植物的很多發(fā)育過(guò)程中都起著至關(guān)重要的作用[57]。類(lèi)胡蘿卜素在包括橡膠膠乳中的弗萊-威士林粒子(即FW粒子)在內(nèi)的幾乎所有類(lèi)型質(zhì)體中都有所發(fā)現(xiàn)，而正是FW粒子的存在使得有些橡膠無(wú)性系的膠乳呈現(xiàn)出黃色。盡管膠乳中類(lèi)胡蘿卜素的作用尚不十分確定和清楚，但它可能是乳管中異戊烯焦磷酸(IPP)的一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)匯。有人認(rèn)為，在膠乳類(lèi)胡蘿卜素含量低的橡膠無(wú)性系中，來(lái)自2C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑(MEP)的IPP被用于順式-聚異戊二烯的合成[8]。分析顯示，橡膠樹(shù)中涉及類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑的基因數(shù)量(48個(gè))較之?dāng)M南芥基因組中相關(guān)基因的數(shù)量(28個(gè))明顯增多。八氫番茄紅素合成酶和八氫番茄紅素脫氫酶是催化類(lèi)胡蘿卜素生物合成中第一個(gè)關(guān)鍵步驟的酶，它們?cè)谙鹉z樹(shù)中的數(shù)量高度增加，基因數(shù)分別達(dá)5個(gè)和9個(gè)，而在擬南芥中均為單拷貝基因。這些觀察結(jié)果表明，橡膠樹(shù)具有更加有效的類(lèi)胡蘿卜素生物合成機(jī)制，而類(lèi)胡蘿卜素在該植物中的合成可能有著多方面的作用和功能。

3 結(jié)論

鑒于天然橡膠生產(chǎn)及其可持續(xù)性在世界工業(yè)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展中的重要作用和地位,橡膠樹(shù)基因組序列框架圖的構(gòu)建無(wú)疑為大戟科植物研究增添了一份寶貴的資料，而這也將有力促進(jìn)和加速橡膠樹(shù)分子育種的開(kāi)展及基因資源的開(kāi)發(fā)利用。我們的觀察顯示，巴西橡膠樹(shù)的基因組中存在較大比例的重復(fù)序列(大約78%)，這有可能緣于該植物非同源重組率及外顯子重排事件的增加[58]，并由此也降低了后代遺傳純度的一致性。大量重復(fù)序列的存在及染色體水平上的信息的缺乏是巴西橡膠樹(shù)基因組組裝的主要障礙。來(lái)自全基因組的信息以及與目標(biāo)基因連鎖或相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記的鑒定將有助于通過(guò)分子育種實(shí)現(xiàn)一些重要性狀的遺傳改良，從而有力地促進(jìn)天然橡膠生產(chǎn)的發(fā)展。與木本植物楊樹(shù)、桉樹(shù)及草本模式植物擬南芥相比，全基因組信息的開(kāi)發(fā)利用將特別有助于橡膠樹(shù)在膠乳產(chǎn)量,木材開(kāi)發(fā),抗病性,以及降低膠乳致敏性等關(guān)鍵領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展。

4 方法

4.1 基因組測(cè)序及組裝

從巴西橡膠無(wú)性系RRIM600的嫩葉中提取高質(zhì)量染色體DNA。按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)制備鳥(niǎo)槍(Shotgun)及雙末端(Paired-end,PE)法測(cè)序文庫(kù)。之后,分別采用Illumina、Roche/454以及SOLiD測(cè)序儀產(chǎn)生高質(zhì)量的讀取片段(reads)。Illumina 測(cè)序文庫(kù)包括200 bp及500 bp PE，Roche/454 測(cè)序文庫(kù)包括shotgun、8 kb PE以及20 kb PE, SOLiD 測(cè)序文庫(kù)為2 kb PE。

采用2個(gè)為新一代測(cè)序數(shù)據(jù)的從頭組裝而設(shè)計(jì)的軟件[59],即CLC Workbench (CLC bio, Denmark)和Newbler (version 2.3)進(jìn)行序列初步組裝,該2個(gè)組裝軟件各自采用不同的輸入數(shù)據(jù)內(nèi)容及組裝策略。借助基于de Bruijn圖的短序列拼接算法，從經(jīng)過(guò)質(zhì)量修剪的Illumina 200bp reads生成CLC組裝的basic contigs,所有經(jīng)過(guò)修剪的Illumina reads、Roche/454 reads以及SOLiD reads則用于contigs(重疊群)的延伸和連接。Newbler 組裝的組裝參數(shù)設(shè)定為:大的或復(fù)雜的基因組，reads限定到某一個(gè)contig中，最小重疊長(zhǎng)度50bp，最小重疊一致性95%。每個(gè)組裝軟件初步組裝的序列中，長(zhǎng)度≥200bp的Contigs被留下用于進(jìn)一步分析。

采用RepeatModeler(version 1.0.4) 軟件包[60],并按默認(rèn)參數(shù)對(duì)2個(gè)組裝軟件初步拼裝的序列進(jìn)行重復(fù)序列的從頭識(shí)別。我們分別從CLC及Newbler軟件的初步組裝序列中鑒定出2323個(gè)和1520個(gè)重復(fù)模塊。之后，通過(guò)BLASTX相似性搜索(采用E-值界限10-5)，從來(lái)自該2個(gè)初步組裝序列的重復(fù)文庫(kù)中篩選與NR(non-redundant,非冗余)、KEGG以及TrEMBL[61]蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中未分類(lèi)重復(fù)序列相關(guān)的潛在基因家族,并將其合并為一個(gè)含有3771個(gè)重復(fù)序列的巴西橡膠樹(shù)特異性重復(fù)文庫(kù)。以重復(fù)序列的出現(xiàn)頻率為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)該巴西橡膠樹(shù)重復(fù)文庫(kù)進(jìn)行篩選，凡是每一個(gè)初裝序列中出現(xiàn)100次以上的重復(fù)序列被保留下來(lái)，并將其組合成一個(gè)巴西橡膠樹(shù)高頻重復(fù)文庫(kù)，用于軟件RepeatMasker (version 3.2.9)[62]的輸入。之后將其用于鑒定和屏蔽Newbler初步組裝序列中的重復(fù)區(qū)域，但不包括序列中的低復(fù)雜度區(qū)域和RNAs。將已屏蔽重復(fù)的Newbler初步組裝序列作為模板用以篩選通過(guò)Illumina平臺(tái)產(chǎn)生的與重復(fù)序列相關(guān)的測(cè)序reads。在進(jìn)行篩選之前，Illumina reads已經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制且所有測(cè)序堿基位的質(zhì)量值≥25的reads被保留下來(lái),其中200 bp測(cè)序文庫(kù)的read長(zhǎng)度為100 bp，500 bp的雙末端測(cè)序文庫(kù)其正向和反向read長(zhǎng)度分別為85 bp和75 bp。采用BOWTIE (version 0.12.7)軟件將每一個(gè)經(jīng)過(guò)質(zhì)量篩選的高質(zhì)量Illumina read的前50 bp與Newbler初步組裝的序列進(jìn)行比對(duì)，允許的錯(cuò)配堿基不超過(guò)3個(gè)。與重復(fù)區(qū)域匹配的成對(duì)或非成對(duì)reads均從read數(shù)據(jù)集中排除。就通過(guò)SOLiD平臺(tái)產(chǎn)生的測(cè)序reads而言,其質(zhì)量控制首先是將SOLiD reads與已經(jīng)SOAP軟件[63]校正的Illumina 200 bp reads用較早版本CLC軟件初步拼裝所得到的序列進(jìn)行比對(duì)，任何種類(lèi)的匹配錯(cuò)誤(包括彩色空隙、單核苷酸差異，或者插入缺失)允許出現(xiàn)2個(gè)。兩條reads都匹配的SOLiD 成對(duì)reads其對(duì)應(yīng)的參考序列被分離出來(lái)，并將其作為一個(gè)read對(duì)。將所有兩端讀長(zhǎng)至少達(dá)到50 bp的read對(duì)保留于read數(shù)據(jù)集中。

利用所有Roche/454 reads、部分挑選出的Illumina reads(包括來(lái)自200 bp測(cè)序文庫(kù)的成對(duì)或非成對(duì)reads和來(lái)自500 bp測(cè)序文庫(kù)的成對(duì)reads)以及SOLiD 成對(duì)reads，并采用Newbler組裝軟件獲得最終的基因組組裝序列(表1)。從TIGR植物重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)及TIGR玉米重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其它植物的重復(fù)序列文庫(kù)，并且核糖體DNA序列已從這些數(shù)據(jù)庫(kù)中被去除。將巴西橡膠樹(shù)特異性重復(fù)文庫(kù)與TIGR植物重復(fù)序列數(shù)據(jù)庫(kù)合并為RepeatMasker的輸入重復(fù)文庫(kù)，以鑒定和屏蔽最終拼裝所得contigs中的重復(fù)區(qū)域，但不包括其所含低復(fù)雜度區(qū)域及RNAs基因。采用 BOWTIE程序(version 0.12.7)[64]將每一個(gè)基因組測(cè)序reads的前50 bp比對(duì)到最終的基因組拼裝序列上,同時(shí)利用TopHat (version 1.1.4)軟件[65]將通過(guò)Roche/454平臺(tái)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序reads與最終的基因組拼裝序列進(jìn)行比對(duì)，以評(píng)估編碼區(qū)域的完整性和覆蓋度。

為了鑒定帶有細(xì)胞器來(lái)源的contigs，采用BLASTN搜索程序?qū)⑵囱b序列與巴西橡膠樹(shù)葉綠體基因組序列進(jìn)行相似性比對(duì)，同時(shí)，還通過(guò)BLASTX程序?qū)⑵囱b序列與來(lái)自豆目植物細(xì)胞器基因組，巴西橡膠樹(shù)、麻風(fēng)樹(shù) (Jatropha curcas)和木薯的葉綠體基因組，以及蓖麻(Ricinuscommunis)、西瓜(Citrulluslanatus)和西葫蘆(Cucurbitapepo)線(xiàn)粒體基因組的蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)分析。源于細(xì)菌污染的contigs則通過(guò)搜索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定并將其從最終的拼裝序列中去除。

4.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

從巴西橡膠樹(shù)的葉片中分離總RNA。按試劑盒使用說(shuō)明書(shū)步驟，將分離得到的mRNA隨機(jī)打斷后，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA片段并用其構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，之后采用Illumina和Roche/454平臺(tái)測(cè)序。利用CLC Workbench組裝軟件并通過(guò)拼接Illumina reads獲得最初的轉(zhuǎn)錄組序列。將來(lái)自Illumina轉(zhuǎn)錄組組裝的Contigs切割成最大1999 bp的短片段,并與Roche/454轉(zhuǎn)錄組測(cè)序reads相結(jié)合，用于Newbler組裝程序的輸入用以?xún)?yōu)化EST數(shù)據(jù)。最后,通過(guò)對(duì)非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTX搜索(E-值界限10-5)對(duì)轉(zhuǎn)錄組組裝序列的Contigs進(jìn)行注釋,并以此檢測(cè)轉(zhuǎn)錄組的完整性及多樣性。

4.3 基因組注釋

利用EVidenceModeler(EVM；version r03062010)軟件，通過(guò)整合來(lái)自轉(zhuǎn)錄組比對(duì)、蛋白質(zhì)比對(duì)以及基因從頭預(yù)測(cè)的證據(jù)最終完成橡膠樹(shù)已屏蔽基因組的基因模型預(yù)測(cè)。利用PASA (version r09162010)[66]和Exonerate(version 2.2.0)[67]軟件將來(lái)自橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)錄組組裝的Contigs與其基因組序列進(jìn)行比對(duì)。采用GMAP (version 20100727)程序[69]將從PlantGDB數(shù)據(jù)庫(kù)[68]獲得的植物唯一轉(zhuǎn)錄本(PUTs)與基因組進(jìn)行比對(duì)。利用AAT(version 1.52)[70]及BLAT(version 34)[71]軟件將從PlantGDB數(shù)據(jù)庫(kù)所獲基因組測(cè)序計(jì)劃的植物蛋白質(zhì)序列與組裝的橡膠樹(shù)基因組進(jìn)行比對(duì)。將來(lái)自橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)錄組組裝的Contigs作為訓(xùn)練集，用以訓(xùn)練從頭預(yù)測(cè)軟件Fgenesh[72]。之后，將基于轉(zhuǎn)錄組比對(duì)的PASA預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)一步作為訓(xùn)練集并用以訓(xùn)練從頭開(kāi)始的基因預(yù)測(cè)軟件Augustus (version 2.5)[73]、 GlimmerHMM (version 3.0.1)[74]以及SNAP(version 2010-07-28)[75]。此外，在結(jié)構(gòu)注釋過(guò)程中,我們還一并使用了用擬南芥訓(xùn)練的從頭預(yù)測(cè)軟件GeneMarkHMME (version 3)[76]及用甜瓜(Cucumis melo)訓(xùn)練的從頭預(yù)測(cè)軟件Geneid (version 1.4.4)[77]進(jìn)行橡膠樹(shù)的基因模型預(yù)測(cè)。最后,利用EVM軟件整合來(lái)自不同方法及軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果以獲得基因的一致性序列。綜合考慮各種預(yù)測(cè)方法的可信度及有效性等因素，我們以橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)錄組比對(duì)的PASA預(yù)測(cè)結(jié)果作為最高標(biāo)準(zhǔn)，將各種來(lái)源證據(jù)的權(quán)重人工設(shè)置為，橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)錄組組裝：PASA 1，Exonerate 0.5；植物PUTs:GMAP 0.2；植物蛋白質(zhì):AAT 0.2,BLAT 0.2；基因從頭預(yù)測(cè)：Fgenesh 0.6,Augustus 0.5,SNAP 0.3,GlimmerHMM 0.3,Geneid 0.2,GeneMarkHMME 0.2。

為了確保質(zhì)量和精確的注釋,除了常用的功能注釋程序外,我們還設(shè)置了人工校對(duì)及若干驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。采用BLASTP程序?qū)?lái)自預(yù)測(cè)基因的蛋白質(zhì)序列與數(shù)據(jù)庫(kù)Swiss-Prot、TrEMBL、PlantGDB、UniRef100、NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)、STRING (version 8.3)[78]以及KEGG GENES進(jìn)行相似性比對(duì)(E-值界限10-5)，從而得到相應(yīng)的功能注釋?；陂_(kāi)放閱讀框(ORFs)的功能篩查其長(zhǎng)度覆蓋率及相似性均至少達(dá)到70%。對(duì)未經(jīng)完整ORFs得到注釋的序列，則進(jìn)一步通過(guò)掃描InterPro、PANTHER[79]、PRINTS[80]、PROSITE[81]patterns、Pfam以及SMART[82]等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域檢測(cè)，隨后與已經(jīng)得到明確注釋的序列模板(如擬南芥和蓖麻)進(jìn)行比對(duì)得到相關(guān)功能信息。之后,基于相互最佳匹配法并借助Pathway Studio (Ariadne Genomics Inc.)軟件從嚴(yán)格審核的植物特定數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找直系同源物，并以此對(duì)功能注釋作進(jìn)一步的分類(lèi)。利用Pathway Studio功能類(lèi)別及KEGG直系同源評(píng)估獲得酶的EC分類(lèi)號(hào)。根據(jù)STRING及GENES數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTP匹配片段獲得其KO分類(lèi)號(hào)。從InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索結(jié)果獲得蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的GO分類(lèi)號(hào)。通過(guò)蛋白質(zhì)與PlantRefSeq、KEGG、Swiss-Prot以及InterPro數(shù)據(jù)庫(kù)的比較進(jìn)行人工審核校對(duì)。超過(guò)10 000條蛋白質(zhì)的相應(yīng)功能得到人工注釋。鑒定百分率、序列比對(duì)可靠性得分(bit-score)以及長(zhǎng)度覆蓋率的比較連同其它分析通過(guò)計(jì)算機(jī)的綜合處理分析最終使一個(gè)特定ORF的推定功能得到可靠認(rèn)定。

利用TRNAscan-SE v.1.23軟件包且EufindRNA檢測(cè)軟件按非嚴(yán)格設(shè)置(Int Cutoff=-32.1)鑒定所組裝的基因組序列中的tRNA 基因[83]。采用BLASTN 2.2.24軟件，通過(guò)與擬南芥及水稻所含5S、5.8S、18S及28S rRNA的比對(duì)鑒定rRNA基因(長(zhǎng)度覆蓋率至少為80%，序列一致性至少達(dá)到50%[84])。利用SignalP 4.0軟件預(yù)測(cè)和鑒定基因組中的信號(hào)肽[85]。

4.4 巴西橡膠樹(shù)基因家族的鑒定和注釋

利用CLC軟件并采用合適的模板序列鑒定與橡膠及木質(zhì)纖維素生物合成、系統(tǒng)獲得性抗性、超敏反應(yīng)、病程相關(guān)蛋白、過(guò)敏源、轉(zhuǎn)錄因子、植物激素代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物鐘及光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、F-box以及類(lèi)胡蘿卜素生物合成等相關(guān)的基因。通過(guò)在PlantGDB、UniProtKB/TrEMBL以及Plant_refseq蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTX搜索(E-值<10-5)對(duì)鑒定的基因作進(jìn)一步注釋。

4.5 NBS-LRR基因家族的鑒定和注釋

采用BLASTP程序(E-值<10-5)從PlantGDB、NCBI以及TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索與擬南芥NBS-LRR(核苷酸結(jié)合位點(diǎn)—富含亮氨酸重復(fù)序列)蛋白質(zhì)相似且覆蓋率大于90%的巴西橡膠樹(shù)蛋白質(zhì)，并通過(guò)與NCBI保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域匹配加以進(jìn)一步確認(rèn)。之后，利用數(shù)據(jù)庫(kù)Pfam、InterPro及HMMPanther對(duì)這些來(lái)自橡膠樹(shù)基因組的已注釋基因模型進(jìn)行結(jié)構(gòu)域掃描和搜索，并分別獲得相應(yīng)的模體及ID號(hào)，其中包括：TIR[PF01582、IPR000157]，NBS[PF0931、IPR002182]，TIR-NBS [PF01582、PF00931、IPR000157、IPR002182]，NBS-LRR[PF0931、PF00560、PF07723、PF07725及PTHR23155:SF236]，TIR-NBS-LRR[PF01582、PF0931、PF00560、PF07723、PF07725、IPR000157、IPR002182、IPR001611、IPR011713及PTHR23155:SF300]，CC-NBS-LRR[PTHR23155: SF231]，以及三種類(lèi)型的LRR，如LRR_1[PF00560、IPR001611]、LRR_2[PF07723]以及LRR_3[PF07725、IPR011713]。利用COILS 程序預(yù)測(cè)和鑒定[86]卷曲螺旋(CC)結(jié)構(gòu)域。通過(guò)合并分析、人工驗(yàn)證及片段匹配度的檢驗(yàn)，我們從巴西橡膠樹(shù)中鑒定出了618個(gè)NBS-LRR基因。

4.6 橡膠生物合成相關(guān)基因與銀膠菊ESTs的比較

將來(lái)自巴西橡膠樹(shù)與橡膠生物合成相關(guān)的基因翻譯成蛋白質(zhì)序列，并用作查詢(xún)序列與銀膠菊ESTs[GenBank:GW775573-GW 787311]作TBLASTN比對(duì)分析。所得結(jié)果采用E-值界限10-5進(jìn)行甄別和過(guò)濾。

4.7 通路重建

利用Resnet-Plant 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)及代謝通路數(shù)據(jù)庫(kù)(Metabolic Pathway Databases，MPW)[87]并借助Pathway Studio software軟件(Ariadne Genomics Inc.)重建巴西橡膠樹(shù)的代謝通路。Resnet-Plant 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)集成了從擬南芥AraCyc 4.0數(shù)據(jù)庫(kù)引入的303條代謝通路信息，每條代謝通路體現(xiàn)為一系列不同功能類(lèi)群的蛋白質(zhì)(酶)及一組相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)。數(shù)據(jù)庫(kù)中的每一個(gè)功能類(lèi)群可包含數(shù)量不限并具有相應(yīng)酶活性編碼序列的蛋白質(zhì)成員。同一功能類(lèi)群中通常包含若干行使酶活功能所必需的催化及調(diào)節(jié)亞基的旁系同源物。

利用Pathway Studio初步重建的代謝通路表征為一系列不同功能類(lèi)群的人工審核蛋白質(zhì)。該重建過(guò)程實(shí)際上也相當(dāng)于一個(gè)在代謝網(wǎng)絡(luò)中填補(bǔ)空缺的過(guò)程。帶有橡膠基因組標(biāo)識(shí)的蛋白質(zhì)在Resnet-Plant 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋并去除非橡膠蛋白質(zhì)之后，有311個(gè)功能類(lèi)群不存在任何與其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)成員。利用根據(jù)BLASTP結(jié)果采用雙向最佳匹配法鑒定出的直系同源蛋白質(zhì),并通過(guò)對(duì)已組裝橡膠基因組DNA序列的TBLASTN分析人工鑒定自動(dòng)注釋未能發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。填補(bǔ)橡膠代謝網(wǎng)絡(luò)中的空缺首先是從GenBank及UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)下載能執(zhí)行所缺失酶蛋白功能的蛋白質(zhì)序列，然后將其作為查詢(xún)序列用于TBLASTN分析。這些用于查詢(xún)的蛋白質(zhì)序列或者來(lái)自擬南芥基因組，或者是來(lái)自其它植物或細(xì)菌基因組。通過(guò)與擬南芥AraCyc數(shù)據(jù)庫(kù)的比較，鑒定僅僅存在于水稻RiceCyc或楊樹(shù)PoplarCyc數(shù)據(jù)庫(kù)中的代謝通路。擬南芥AraCyc數(shù)據(jù)庫(kù)中所缺少的代謝通路采用手動(dòng)方式添加到Pathway Studio的巴西橡膠數(shù)據(jù)庫(kù)中。MPW數(shù)據(jù)庫(kù)也被用于橡膠生物合成途徑的重建。

4.8 將序列支架錨定到連鎖群

根據(jù)已公布的連鎖圖譜[17]，將組裝的scaffolds錨定和定位到橡膠樹(shù)的18個(gè)連鎖群。所用154個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記序列均得自公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)。通過(guò)標(biāo)記序列與所有scaffolds之間的 BLAST相似性分析對(duì)各個(gè)scaffolds進(jìn)行鑒定，而所在scaffold上的基因模型也因此得以鑒定并被錨定在連鎖群的相應(yīng)位置。當(dāng)某個(gè)scaffold上存在一個(gè)以上標(biāo)記時(shí)，基因則有可能被錨定在正確的位置上，也有可能在其它位置，其定位不確定。位于scaffolds上的其它額外標(biāo)記則通過(guò)全部scaffolds對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST相似性分析進(jìn)行鑒定。

4.9 特有及共有基因簇分析

采用OrthoMCL軟件[88]鑒定和估算大戟科植物以及不同植物類(lèi)群間旁系和直系同源基因簇的數(shù)量。采用標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置(BLASTP, E-值<10-5)計(jì)算序列的多對(duì)多相似性。

4.10 系統(tǒng)發(fā)生分析

采用17個(gè)已測(cè)序的植物基因組,即萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、江南卷柏(Selaginellamoellendorfii)、玉米(Zeamays)、水稻、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、葡萄、番木瓜、擬南芥、毛果楊、麻瘋樹(shù)、蓖麻、巴西橡膠樹(shù)、木薯、野草莓(Fragariavesca)、大豆(Glycinemax)以及黃瓜(Cucumissativus)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。采用BLAST算法及E-值界限10-5對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多對(duì)多的相似性比較，并從該BLAST分析結(jié)果計(jì)算鑒定百分率。利用OrthoMCL軟件鑒定內(nèi)旁系同源基因、直系同源基因以及共直系同源基因。通過(guò)尋找某一物種內(nèi)的所有成對(duì)蛋白質(zhì)確定潛在的內(nèi)旁系同源基因?qū)?，這些成對(duì)蛋白質(zhì)之間的序列匹配度高于或等于它們中的任一蛋白質(zhì)與其它物種中所有蛋白質(zhì)間的匹配度。通過(guò)尋找存在于2個(gè)物種間的所有成對(duì)蛋白質(zhì)確定所有潛在的直系同源基因?qū)?，這些成對(duì)蛋白質(zhì)之間的序列匹配度等于或高于二者中的任一蛋白質(zhì)與另一物種中任何其它蛋白質(zhì)間的匹配度,也即該成對(duì)的2個(gè)蛋白質(zhì)互為最佳匹配蛋白質(zhì)。潛在的共直系同源基因?qū)σ餐ㄟ^(guò)尋找兩個(gè)物種間的所有成對(duì)蛋白質(zhì)加以確定，某一物種中的內(nèi)旁系同源基因通過(guò)與另一物種中的內(nèi)旁系同源基因間的直系同源關(guān)系而結(jié)為共直系同源基因?qū)?。?duì)采用MCL程序?qū)ν椿蜻M(jìn)行聚類(lèi)分析，所有存在內(nèi)旁系及直系同源關(guān)系的蛋白質(zhì)被歸入同一類(lèi)，共產(chǎn)生57 250個(gè)同源基因簇。去除不包括所有17個(gè)物種的同源基因簇后，共得到1 364個(gè)基因簇。通過(guò)選留至少在該17種植物的14個(gè)成員中均存在單拷貝的同源基因簇對(duì)其進(jìn)一步過(guò)濾，最后獲得144個(gè)單拷貝直系同源基因簇。利用ClustalX軟件進(jìn)行序列比(采用Gonnet系列矩陣，空位開(kāi)放罰分=10，空位延伸罰分=0.1)，之后采用Gblocks軟件從比對(duì)結(jié)果中提取保守序列區(qū)。最后，按最大似然法并利用PhyML軟件[89]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。采用SPR(子樹(shù)修剪與嫁接)和NNI(最近鄰居互換)算法中最佳的一種尋找最優(yōu)樹(shù)。通過(guò)自舉分析(Bootstrapping)檢驗(yàn)系統(tǒng)樹(shù)的可信度(隨機(jī)重復(fù)100次,隨機(jī)種子數(shù)目為7)。

4.11 基因的實(shí)驗(yàn)確認(rèn)

利用RNeasy Mini Kit (Qiagen)試劑盒并按照使用說(shuō)明書(shū)從巴西橡膠無(wú)性系RRIM 600的嫩葉和膠乳中分離總RNA。之后，采用試劑盒SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Invitrogen)合成cDNA第一鏈。以cDNA為模板并采用基因特異性引物對(duì)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將純化的PCR產(chǎn)物克隆到pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen)或pJET1.2/blunt (Fermentas)載體中并測(cè)序。與橡膠生物合成、木質(zhì)素生物合成、病害抗性、過(guò)敏源、轉(zhuǎn)錄因子以及植物激素生物合成相關(guān)的基因均按以上步驟擴(kuò)增、克隆和測(cè)序。

4.12 數(shù)據(jù)的可得性

該全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序計(jì)劃已提交到DDBJ/EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，其GenBank登錄號(hào)：AJJZ00000000。本文所描述的版本為第一版。組裝的轉(zhuǎn)錄本也已提交到NCBI轉(zhuǎn)錄組鳥(niǎo)槍組裝數(shù)據(jù)庫(kù)，其GenBank登錄號(hào)：JT914190-JT981478。該橡膠基因組游覽器可供下載和使用[90]。

本項(xiàng)目受馬來(lái)西亞高等教育部頂尖大學(xué)計(jì)劃(APEX)資助,由馬來(lái)西亞理科大學(xué)、中國(guó)南開(kāi)大學(xué)泰達(dá)生物技術(shù)研究院、美國(guó)夏威夷大學(xué)、美國(guó)Ariadne Genomics公司、丹麥CLC bio公司、南非德班理工大學(xué)、美國(guó)德克薩斯A&M大學(xué)等機(jī)構(gòu)共同完成。Ahmad Yamin Abdul Radman等所有署名作者均已閱讀并同意本論文的最終稿。

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(全文譯自BMC Genomics 2013，14:75)

Draft genome sequence of the rubber treeHeveabrasiliensis

Translated by TIAN Lang

RubberResearchInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Danzhou,Hainan571737

Heveabrasiliensis,a member of the Euphorbiaceae family,is the major commercial source of natural rubber (NR).NR is a latex polymer with high elasticity,flexibility,and resilience that has played a critical role in the world economy since 1876.Here,we report the draft genome sequence of H.brasiliensis.The assembly spans～1.1 Gb of the estimated 2.15 Gb haploid genome.Overall,78% of the genome was identified as repetitive DNA.Gene prediction shows 68,955 gene models, of which 12.7% are unique to Hevea.Most of the key genes associated with rubber biosynthesis,rubberwood formation,disease resistance,and allergenicity have been identified.The knowledge gained from this genome sequence will aid in the future development of high-yielding clones to keep up with the ever increasing need for natural rubber.

Heveabrasiliensis; Euphorbiaceae; Natural rubber; Genome

2016-04-16

田 郎(1961-)，男，侗族，湖南新晃人，碩士，副研究員，現(xiàn)從事植物組織培養(yǎng)及分子生物學(xué)研究工作。

S

A

1001-2117(2017)02-0101-15