植物乳桿菌還原形成不同粒徑納米硒的培養(yǎng)條件及其生物活性分析

張羽竹，王冰宜，曾梓敖，徐若蕓，李 軍，樊明濤,，魏新元,

（1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.西北農林科技大學生命科學學院，陜西 楊凌 712100）

硒是機體正常生命活動所必需的微量元素，在維持氧化還原平衡[1]、免疫調節(jié)[2]、拮抗重金屬[3]、抑制癌癥[4]、保護DNA和染色體免受氧化損傷[5]等方面發(fā)揮著重要作用。硒主要以無機化合態(tài)硒、有機硒及無機單質硒形式存在，能以一種或者多種形態(tài)進入生物體。不同形態(tài)的硒，其毒性存在差異，其中無機化合態(tài)硒毒性最高，其次為有機態(tài)硒，單質硒毒性最弱。單質納米硒因其低細胞毒性和高生物學活性受到了人們的廣泛關注[6-9]。

目前，納米硒的合成方法主要有3 種，分別為物理法[10-11]、化學法[12-13]以及生物法[14-16]。物理、化學法合成的納米硒，不僅價格昂貴，而且存在不安全因素如刺激性的化學物質，因此，應用受到限制[17]。而生物法合成的納米硒，由于經過生物體的轉化，不僅大大減少了其對機體的毒性，而且能更方便被機體吸收和利用，更好地發(fā)揮硒的生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)，許多微生物具有還原亞硒酸鈉合成納米硒的功能[18-28]。

乳酸菌為一類常見的食品發(fā)酵微生物，其安全性和益生性已得到廣泛認可，許多乳酸菌被報道具有生物合成納米硒的功能。Radhika Rajasree等[22]利用嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌將硒離子還原為納米硒。Yang Jingpeng等[23]利用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌制備富硒乳酸菌時，發(fā)現(xiàn)細胞周圍存在納米硒。Xu Chunlan等[24]發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌393在厭氧條件下能將亞硒酸鈉轉化為納米硒。此外，發(fā)酵乳桿菌[25]、羅伊氏乳桿菌[26]、短乳桿菌[27]以及布氏乳桿菌[28]等也具有將無機硒還原成納米硒的能力。因此，由于其益生性，乳酸菌可作為合成生物源納米硒的良好載體和轉化體，作為食品添加劑進行補硒。

納米顆粒的粒徑與其生物學活性具有相關性。研究發(fā)現(xiàn)[29]，當大多數(shù)納米化學物質的粒徑減小時，其化學、物理和生物學性質會發(fā)生改變。Qi Lifeng等[30]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖納米顆粒的粒徑越小，對腫瘤細胞的抑制作用越強。Huang Bo等[31]用化學合成法制得不同粒徑的納米硒，并發(fā)現(xiàn)納米硒對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基、單態(tài)氧和一氧化氮自由基的清除效率與粒徑有關，粒徑越小，清除效率越高。還有研究表明，納米硒對于谷胱甘肽轉移酶活性的影響具有粒徑效應[32]。

為探究基本培養(yǎng)條件對乳酸菌納米硒粒徑形成的影響，并分析不同粒徑納米硒顆粒的生物學活性差異，本研究選用常見的益生乳酸菌——植物乳桿菌作為實驗菌株，分析培養(yǎng)條件對納米硒粒徑的影響，并在此基礎上探究其粒徑與體外抑菌活性和抗氧化活性的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

本實驗室保存的植物乳桿菌13 株，編號分別為WZ1、WZ2、WZ3、WZ4、WZ5、WZ6、WZ7、WZ8、WZ9、WZ10、WZ11、WZ12、WZ13。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、檸檬酸三銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、吐溫-80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4·H2O 0.05 g、蒸餾水1 000 mL。

改良MRS固體培養(yǎng)基：1 000 mL MRS液體培養(yǎng)基中加入碳酸鈣10 g、瓊脂15～20 g。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母菌粉5 g、氯化鈉10 g、蒸餾水1 000 mL。

LB固體培養(yǎng)基：1 000 mL LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15～20 g。

1.1.3 試劑

亞硒酸鈉、3,3’-二氨基聯(lián)苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、硝酸、高氯酸、鹽酸、無水乙醇、0.2 mmol/L DPPH、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、磷酸鹽緩沖液（pH 6.6，0.2 mol/L）、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵等。

1.2 儀器與設備

ZEN3600納米激光粒度儀 英國Malvern Instruments Limited公司；HS-840μ型水平層流單人凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司；UVmini-1240紫外分光光度計 日本島津公司；pH計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 富硒植物乳桿菌的篩選

將13 株植物乳桿菌活化后分別制成種子液（OD600nm為0.8左右），按2%（V/V）接種量接入亞硒酸鈉質量濃度為10 μg/mL的MRS培養(yǎng)液中，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株的生長情況，選擇生長旺盛的菌株進行下一步研究。

1.3.2 亞硒酸鈉質量濃度對植物乳桿菌生長的影響

將初步選擇的菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，分別按2%接種量接入不同亞硒酸鈉質量濃度的MRS培養(yǎng)液中（分別為0、20、40、60、80、100、120 μg/mL），35 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，各取1 mL發(fā)酵液，采用10 倍系列稀釋后涂布，35 ℃培養(yǎng)至菌落清晰可見，通過平皿計數(shù)法確定活菌數(shù)。

1.3.3 適宜亞硒酸鈉質量濃度的確定

乳酸菌能還原亞硒酸鈉生成單質硒，不同生成量的單質硒可使菌體呈現(xiàn)不同程度的紅色，生成單質硒越多，菌體沉淀所顯示的紅色越深，因此，可以通過沉淀顏色確定適宜的亞硒酸鈉質量濃度[33-34]。將初步選擇的菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，按2%接種量接入含不同質量濃度亞硒酸鈉（分別為0、20、40、60、80、100、120 μg/mL）的MRS培養(yǎng)液試管中，35 ℃培養(yǎng)24 h，觀察試管中菌體沉淀顏色，確定適宜的亞硒酸鈉質量濃度。

1.3.4 培養(yǎng)條件對納米硒粒徑以及硒含量的影響

通過單因素試驗分析培養(yǎng)液初始pH值、溫度、接種量、亞硒酸鈉質量濃度以及脅迫時間對納米硒粒徑以及硒含量的影響。初始pH值的影響：設置溫度35 ℃、接種量2%、亞硒酸鈉質量濃度80 μg/mL、脅迫時間5 h，培養(yǎng)液初始pH值為4.0、6.8和8.0分別進行單因素試驗；溫度的影響：設置初始pH 6.8、接種量2%、亞硒酸鈉質量濃度80 μg/mL、脅迫時間5 h，溫度為25、35 ℃和45 ℃分別進行單因素試驗；接種量的影響：設置初始pH 6.8、溫度35 ℃、亞硒酸鈉質量濃度80 μg/mL、脅迫時間5 h，接種量為1%、2%和4%分別進行單因素試驗；亞硒酸鈉質量濃度的影響：設置初始pH 6.8、溫度35 ℃、接種量2%、脅迫時間5 h，亞硒酸鈉質量濃度為60、80 μg/mL和100 μg/mL分別進行單因素試驗；脅迫時間的影響：設置初始pH 6.8、溫度35 ℃、接種量2%、亞硒酸鈉質量濃度80 μg/mL，脅迫時間為5、12 h和19 h分別進行單因素試驗。

1.3.5 納米硒顆粒的制備與粒徑測定

1.3.6 納米硒顆粒硒含量的測定

采用混合酸消化法[36]處理納米硒顆粒，并進行一定改進。精確稱取0.500 g硒顆粒，加10 mL硝酸-高氯酸混合酸（9∶1），冷消化過夜。置于沸水浴中加熱，并及時補加硝酸。當溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙產生時，再繼續(xù)加熱至剩余體積為2 mL左右。冷卻，再加5 mL 6 mol/L鹽酸溶液，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn)。將溶液準確稀釋至100 mL，取20 mL加蒸餾水至35 mL作為反應樣。

采用DAB比色法[37]測定納米硒顆粒中的硒含量，根據(jù)測定的OD值，通過標準曲線得到納米顆粒的硒含量。

1.3.7 不同粒徑納米硒顆粒生物活性的分析

1.3.7.1 納米硒顆粒的選擇

為分析不同粒徑納米硒顆粒的生物學活性，根據(jù)制得納米硒粒徑，參考連續(xù)性變數(shù)資料整理方法[38]進行分組，從中選擇幾種具有差異性的硒納米顆粒，在調整最終硒質量濃度一致的條件下，分別對不同粒徑納米硒的體外抑菌活性和抗氧化活性進行分析。

1.3.7.2 抑菌活性

雞群突然出現(xiàn)發(fā)病癥狀，由于雞群日齡較小，養(yǎng)殖戶并沒有考慮雞傳染性法氏囊病。出現(xiàn)發(fā)病癥狀后，患病雞表現(xiàn)為精神萎靡不振，進食量逐漸下降，雙翅下垂，羽毛雜亂，多只患病雞擁擠扎堆?；疾‰u臨床癥狀主要表現(xiàn)為腹瀉，大部分患病雞腹瀉物為黃色粥樣稀便，之后糞便逐漸變成白色，呈水樣經過，由于腹瀉嚴重，患病雞后軀之體被腹瀉物嚴重污染，嚴重導致泄殖腔堵塞。腹瀉時間延長，患病雞身體出現(xiàn)明顯脫水癥狀，全身皮膚干燥，眼窩向內凹陷，最終衰竭死亡

為確定不同納米硒粒徑與抑菌活性的相關性，將不同粒徑的納米硒顆粒分別與4 種常見的食源性致病菌鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）以及單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）進行共同培養(yǎng)，通過測定實驗菌株經過一定脅迫時間后菌懸液在600 nm波長處OD值評價其抑菌性能。

具體為：將實驗菌菌液以2%接種量接入LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對數(shù)后期，然后稀釋成107CFU/mL的菌液，分別加入到含不同粒徑納米硒顆粒（最終硒質量濃度一致）的LB試管中作為處理組，同時以加入對應體積生理鹽水設置對照組，35 ℃恒溫培養(yǎng)。于0、3、6、9、12、15 h取樣，于600 nm波長處測定菌液OD值。

1.3.7.3 抗氧化活性

分別稱取不同粒徑的納米硒顆粒溶于10 mL蒸餾水，制成最終硒質量濃度一致的納米硒溶液，待用。DPPH自由基清除率的測定參照楊靖鵬等[39]的方法，ABTS陽離子自由基清除率的測定參照Wootton等[40]的方法，總還原力的測定參照Lin等[41]的方法。

羥自由基的測定參照Li Shengyu等[42]的方法進行一定修改。分別吸取9 mmol/L FeSO4、9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液和1 mL納米硒溶液于試管中，加入1 mL 9 mmol/L H2O2溶液混勻后，37 ℃水浴30 min，于510 nm波長處測定各溶液的吸光度A1。以等體積蒸餾水代替H2O2作為本底組，測定其吸光度A2，以等體積乙醇代替納米硒溶液作為空白組，測定其吸光度A0。按下式計算清除率：

1.4 數(shù)據(jù)分析

運用Minitab 18進行數(shù)據(jù)處理與顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 富硒植物乳桿菌的篩選結果

表1 13 株植物乳桿菌在含10 μg/mL亞硒酸鈉MRS培養(yǎng)液中的生長情況Table 1 Growth rates of 13 strains of L. plantarum in MRS medium containing 10 μg/mL Na2SeO3

如表1所示，菌株WZ1、WZ2、WZ3、WZ7、WZ8、WZ9、WZ10和WZ11均能在含硒培養(yǎng)液中生長，其中WZ1、WZ2、WZ8生長旺盛，因此選取該3 株菌進行進一步研究。

2.2 亞硒酸鈉質量濃度對植物乳桿菌生長的影響

表2 亞硒酸鈉質量濃度對植物乳桿菌生長的影響Table 2 ffect of different concentrations of sodium selenite on L. plantarum growth

表2 亞硒酸鈉質量濃度對植物乳桿菌生長的影響Table 2 ffect of different concentrations of sodium selenite on L. plantarum growth

亞硒酸鈉質量濃度/（μg/mL）1.48±0.19 1.31±0.24 1.92±0.18 20 1.37±0.16 1.35±0.11 1.90±0.13 40 1.32±0.13 1.34±0.18 1.93±0.22 60 1.36±0.21 1.38±0.12 1.93±0.11 80 1.53±0.12 1.39±0.13 1.98±0.15 100 1.34±0.18 1.26±0.21 1.89±0.32 120 1.23±0.13 1.24±0.17 1.78±0.30菌落數(shù)/（108 CFU/mL）WZ1 WZ2 WZ8 0

由表2可以看出，當亞硒酸鈉質量濃度不高于80 μg/mL時，3 株植物乳桿菌生長狀況受硒的影響較少，其中WZ8生長狀況最好；在亞硒酸鈉質量濃度為80 μg/mL時，菌落數(shù)均達到了峰值，WZ1為（1.53±0.12）×108CFU/mL，WZ2為（1.39±0.13）×108CFU/mL，WZ8為（1.98±0.15）×108CFU/mL。

2.3 適宜亞硒酸鈉質量濃度的確定

表3 不同質量濃度亞硒酸鈉下菌體沉淀的顏色變化Table 3 Color of bacterial cell precipitates at different concentrations of Na2SeO3

如表3所示，菌體沉淀顏色與亞硒酸鈉質量濃度呈正相關：隨著亞硒酸鈉質量濃度增加，菌體沉淀顏色逐漸變濃。有研究[43]表明，乳酸菌將富集的一部分硒轉化為有機硒，用于生命活動，而另一部分則轉化為零價態(tài)的單質硒，單質硒的存在使菌體沉淀呈現(xiàn)紅色。隨著亞硒酸鈉質量濃度的增加，菌株的富硒量會隨之增加，菌株的生物量則會減少[44]。但從益生效果以及機體吸收利用的角度考慮，應在保證菌株生物量的前提下獲得較多的單質硒，故選擇菌體沉淀為粉色時的濃度較為適宜。從菌體沉淀的顏色變化中選擇使其呈現(xiàn)粉色對應的為亞硒酸鈉適宜質量濃度，即WZ1、WZ2、WZ8適宜的亞硒酸鈉質量濃度均為80 μg/mL。因此，結合表2與表3，選擇WZ8為實驗菌株，亞硒酸鈉質量濃度為80 μg/mL進行下一步研究。

2.4 培養(yǎng)條件對納米硒粒徑及其硒含量的影響

表4 培養(yǎng)條件對納米硒粒徑以及硒含量的影響Table 4 ffects of different culture conditions on the size and selenium content of nanoparticles

表4 培養(yǎng)條件對納米硒粒徑以及硒含量的影響Table 4 ffects of different culture conditions on the size and selenium content of nanoparticles

注：表中數(shù)值均為，同一因素同列字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

因素 編號 水平 粒徑/nm 硒質量分數(shù)/%初始pH A1 4.0 322.23±83.88a 0.277±0.002d A2 6.8 239.20±41.29a 0.230±0.004e A3 8.0 481.76±33.78b 0.406±0.002f溫度/℃B1 25 442.07±42.23a 0.262±0.002d B2 35 477.20±43.60a 0.421±0.001e B3 45 844.97±15.43b 0.157±0.001f接種量/%C1 1 298.00±86.78a 0.422±0.003d C2 2 743.33±50.50b 0.643±0.023e C3 4 141.26±29.62c 0.527±0.002f亞硒酸鈉質量濃度/（μg/mL）D1 60 137.93±68.97a 0.446±0.002d D2 80 206.90±34.49ab 0.513±0.009e D3 100 270.27±35.14b 0.670±0.004f E1 5 180.18±52.50a 0.128±0.014d E2 12 423.07±4.55b 1.062±0.050e E3 19 458.63±67.15b 0.618±0.013f脅迫時間/h

如表4所示，pH 4.0和pH 6.8條件下產生的納米硒粒徑之間不存在顯著性差異，但它們均與pH 8.0條件下的納米硒粒徑之間存在顯著性差異。當起始pH值為8.0時，納米硒粒徑最大；起始pH值為6.8時，粒徑最小。納米硒顆粒的硒含量隨著培養(yǎng)液起始pH值變化而改變，兩兩之間存在顯著差異。

植物乳桿菌WZ8在25 ℃和35 ℃條件下還原亞硒酸鈉形成硒顆粒，粒徑無顯著差異，二者與45 ℃條件下形成的粒徑之間存在顯著差異。45 ℃形成的納米硒粒徑幾乎是另外兩種溫度條件下的2 倍。不同培養(yǎng)溫度下，納米硒顆粒的硒含量之間存在顯著差異，其中35 ℃條件下的納米顆粒中硒含量最高。

3 種接種量形成的納米硒，其粒徑以及硒含量兩兩之間均具有顯著差異；當接種量為2%時得到納米硒粒徑最大，接種量為4%時則最?。划斀臃N量為2%時，納米顆粒硒含量最高，接種量為1%時最低。

只有60 μg/mL和100 μg/mL亞硒酸鈉質量濃度下形成的納米硒粒徑之間存在顯著性差異；而不同亞硒酸鈉質量濃度下形成的納米顆粒硒含量之間均具有顯著差異，隨著培養(yǎng)體系中的亞硒酸鈉質量濃度增加，納米硒粒徑增大，其顆粒中的硒含量也隨之增加。

脅迫12 h和19 h形成的納米硒粒徑之間無顯著差異，但均與脅迫5 h之間存在顯著性差異，其中脅迫19 h的粒徑最大，脅迫5 h的粒徑最小。不同脅迫時間下，WZ8還原形成納米顆粒的硒含量間均具有顯著差異，脅迫12 h的硒含量最高。

綜上，植物乳桿菌WZ8在還原形成納米硒顆粒時，顆粒的粒徑及其硒含量均受到培養(yǎng)條件的影響。其中菌株的接種量對納米硒粒徑影響最大；而當培養(yǎng)溫度、亞硒酸鈉質量濃度以及脅迫時間改變時，納米硒粒徑的變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性：隨著培養(yǎng)溫度的升高、亞硒酸鈉質量濃度增加以及脅迫時間的延長，納米硒粒徑增大。而不同培養(yǎng)條件下形成的納米顆粒的硒含量各不相同，各因素不同水平之間，顆粒中的硒含量兩兩間均存在顯著差異。

2.5 納米硒顆粒的選擇

參考連續(xù)性變數(shù)資料整理方法[38]，根據(jù)制得納米硒粒徑，將其分為5 組，如表5所示。結合納米硒粒徑分布及其差異顯著性，分別從各組中選擇一份樣品，編號為（按粒徑從小到大排列）E1、D3、E2、C2（粒徑分布如圖1所示）。在控制培養(yǎng)體系最終硒含量一致的條件下，對它們的體外抑菌性以及抗氧化性進行了測定。

表5 不同粒徑納米硒顆粒的分組Table 5 Grouping of selenium nanoparticles with different sizes

圖1 為所選擇的幾種代表性納米硒的粒徑分布。樣品E1粒徑分布約為74～238 nm，平均粒徑為（180.18±52.50）nm；樣品D3粒徑分布約為43～295 nm，平均粒徑為（270.27±35.14）nm，樣品E2粒徑分布約為164～439 nm，平均粒徑為（423.07±4.55）nm；樣品C2粒徑分布約為288～778 nm，平均粒徑為（743.33±50.50）nm。

圖1 4 種納米硒粒徑分布Fig. 1 Size distribution of four selenium nanoparticles

2.6 不同粒徑納米硒顆粒生物學活性分析

2.6.1 抑菌活性

圖2 不同粒徑納米硒顆粒的抑菌活性Fig. 2 Antimicrobial activities of selenium nanoparticles with different sizes

如圖2所示，不同粒徑納米硒顆粒對鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及單核細胞性李斯特菌的抑制作用相似，均為E1＞D3＞E2＞C2。結合納米硒粒徑可知，納米硒粒徑越小，其對4 種指示菌的抑制作用越明顯。

2.6.2 抗氧化活性

圖3 不同粒徑納米硒顆粒的抗氧化活性Fig. 3 Antioxidant activities of selenium nanoparticles with different sizes

不同粒徑的納米硒顆粒，其清除自由基的能力以及總還原力不同（圖3）。4 種納米硒顆粒清除ABTS陽離子自由基和羥自由基的能力，兩兩之間存在顯著差異，其中E1對ABTS陽離子自由基清除能力最強，E2則對羥自由基清除能力最強。由納米硒的DPPH自由基清除率可知，除E2、C2外，其余兩兩間存在顯著差異，其中E1的DPPH自由基清除率約為E2或C2的3 倍；另外，除D3與C2、E2與C2外，其余兩兩間的總還原力存在顯著差異。綜上，納米硒的抗氧化活性與其粒徑存在一定的相關性。

3 討論與結論

研究結果表明，培養(yǎng)液起始pH值、培養(yǎng)溫度、接種量、亞硒酸鈉質量濃度以及脅迫時間等均會影響植物乳桿菌WZ8還原形成的納米硒粒徑。體外抑菌實驗的結果表明，不同粒徑納米硒顆粒對4 種食源性致病菌的抑制作用不同，粒徑較小的納米硒顆粒對同一致病菌的抑制作用較強。這與Pal等[45]的研究結果一致。其原因可能是當接觸的表面積一定時，粒徑較小的納米硒顆粒在細菌細胞上的結合位點更多，故對細菌生長的抑制作用更強?？寡趸钚詫嶒灠l(fā)現(xiàn)，不同粒徑的納米硒顆粒的總還原力及其對自由基的清除力存在差異，相較于粒徑較大的納米硒顆粒，粒徑較小的顆粒對自由基的清除力以及總還原力較強。此結果與Huang Bo等[31]報道一致。其原因可能是納米硒粒徑越小，用于與自由基電子交換的原子越多，對自由基的清除效率就越高。但不同粒徑納米硒的羥自由基清除率呈現(xiàn)波動，可能是由納米顆粒表層聚合物所引起。本研究納米粒徑粒徑尚未直接反映顆粒硒含量的高低，可能是由于納米顆粒表面聚合物層的成分或含量存在差異所致。

本實驗研究了培養(yǎng)條件對納米硒粒徑的影響，以及不同粒徑納米硒的體外抑菌活性、抗氧化活性與粒徑之間的相關性，并結合不同培養(yǎng)條件下粒徑的差異顯著性和菌株生長條件，得到最佳獲得高生物學活性納米硒顆粒的培養(yǎng)條件為：起始pH 6.8、培養(yǎng)溫度35 ℃、接種量4%、亞硒酸鈉質量濃度80 μg/mL、脅迫時間5 h。但培養(yǎng)條件對納米硒粒徑影響的作用機理尚不明確，仍需進一步的研究和探索。