褪黑素對大鼠急性脊髓損傷后HO-1因子表達的影響

徐玉生 理陽 汪鑫 朱海洋 鐘斌 李鵬輝 蘇一帆

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院 骨科六病區(qū) 河南 鄭州 450000)

褪黑素對大鼠急性脊髓損傷后HO-1因子表達的影響

徐玉生 理陽 汪鑫 朱海洋 鐘斌 李鵬輝 蘇一帆

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院 骨科六病區(qū) 河南 鄭州 450000)

目的 研究褪黑素(MT)對大鼠急性脊髓損傷(SCI)后血紅素氧合酶(HO-1)表達的影響，探討MT對SCI的作用機制。方法 選取108只成年SD大鼠，隨機分為3組：對照組、損傷組、MT組。對照組僅行椎板切除，暴露T11～T12節(jié)段，不損傷脊髓神經(jīng)。損傷組和MT組用改良的Allen’s法建立T11～T12SCI模型，并分別在SCI后10 min腹腔注射MT溶劑和MT制劑。各組于術后6、12、24 h隨機選取12只大鼠處死，取T11～T12節(jié)段脊髓標本。其中6個標本液氮保存，以備檢測HO-1 mRNA的表達水平，另外6個標本甲醛固定，以備HE染色和免疫熒光切片，觀察SCI及修復情況。結果 術后各時間點大鼠脊髓的HO-1 mRNA水平比較：MT組最高，損傷組次之，對照組最低，在12 h和24 h時間點上各組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HE染色切片觀察SCI程度：對照組最輕，MT組次之，損傷組最重。免疫熒光顯示：MT組HO-1表達最多，損傷組次之，對照組最少。結論 MT能在大鼠急性SCI后促進HO-1表達，并減輕損傷脊髓的炎性反應。

脊髓損傷；褪黑素；血紅素氧合酶-1

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是脊柱損傷最嚴重的并發(fā)癥。有研究指出，SCI不僅會引起損傷階段以下肢體的運動或感覺障礙，還能使機體各個系統(tǒng)儲備能力降低，超出機體的修復能力，與生理衰老重疊出現(xiàn)過早衰老[1]。SCI后大量的炎性細胞及炎性因子產生、浸潤是造成脊髓繼發(fā)性損傷的主要原因[2]，SCI早期治療的重點正是控制繼發(fā)性損傷[3]。實驗證實，褪黑素(melatonin，MT)在大鼠SCI后對IL-10、IL-8、TNF-α等多種炎性因子的分泌都有一定的調節(jié)作用[4-6]。這為其治療SCI提供了可能性。但對于SCI后脊髓繼發(fā)性損傷和修復的機制尚不清楚，并且MT與血紅素氧合酶-1(heme oxygense-1，HO-1)之間的關系尚未闡明。本實驗通過大鼠SCI后注射MT制劑，觀察SCI情況和HO-1表達的變化，探索MT通過HO-1影響SCI的內在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康成年雄性大鼠108只，體質量為(230±20)g，采購于河南省實驗動物中心，許可證號為SCXK(豫)2010-0002，飼養(yǎng)于通風、溫度、濕度適宜的動物房內，不限飲水及進食，每日光照及黑暗各12 h，術前適應性喂養(yǎng)1周。實驗過程中的動物處置均符合動物倫理學要求。

1.2 主要試劑及儀器 Transzol試劑、RT試劑盒、PCR試劑盒、Maker均購自北京全式金生物技術有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。兔抗鼠HO-1抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，DAB試劑盒、SP9002免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術有限公司。MT、DEPC、EB購自美國SIGMA公司。PCR GeneAmp System(美國Applied Biosystems公司，型號：2700)；低溫離心機(美國Sigma公司，型號：3K30)；圖像記錄分析系統(tǒng)(大連Jim-X Scientific，型號：D140)；電子天平(德國220 g/0.1 mg，型號：BS224S)；恒冷箱切片機(LE ICACM 1900)。

1.3 分組 采用隨機數(shù)字法將108只大鼠分為3組：對照組(A組)、損傷組(B組)、MT組(C組)。

1.6 HE及免疫熒光 HE染色步驟：切片脫蠟至水；蘇木素染色3 min；水洗，1%鹽酸酒精分色10 s；水洗，1%伊紅染色10 min；水洗，梯度酒精脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片；顯微鏡觀察，照相。免疫熒光步驟：切片脫蠟至水，PBS洗3次(3×5 min)。檸檬酸抗原修復10 min，自然冷卻。PBS浸泡5 min，3次(3×5 min)；3% H2O2封閉內源性過氧化物酶，室溫20 min。PBS浸泡5 min，3次(3×5 min)。滴加山羊血清50 μl/片，室溫封閉內源性生物素20 min。甩除勿洗，滴加一抗(Nrf2 NQO1/Oxy 1∶100)50 μl/片，4 ℃過夜。PBS浸泡5 min，3次(3×5 min)。滴加熒光素標記二抗(Cy3抗兔1:300)50 μl/片，37 ℃ 2 h。PBS浸泡5 min，3次(3×5 min)；熒光顯微鏡下采集圖像。

1.7 觀察指標 各組大鼠術后不同時間點一般情況；HE染色中脊髓組織炎性反應情況；免疫熒光里HO-1蛋白表達情況；脊髓中HO-1 mRNA表達的情況。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)分析。應用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較3組大鼠脊髓組織中HO-1 mRNA及蛋白表達水平的差異，檢驗標準α=0.05。

2 結果

2.1 術后一般狀況 共計108只大鼠。麻醉蘇醒后，術后B、C兩組均出現(xiàn)后肢癱瘓、尿潴留、進食減少等情況，A組大鼠活動情況及進食較術前無明顯改變。脊髓標本見B組脊髓組織損傷部位出現(xiàn)潰瘍及大量炎癥反應；C組脊髓組織炎癥反應較輕，未見潰瘍面；A組脊髓組織標本炎癥反應最輕。

2.2 3組大鼠不同時間點脊髓中HO-1 mRNA表達的比較 各組脊髓中HO-1 mRNA的表達水平在各個時間點上從高到低依次是C組、B組、A組。在SCI后的最早期6 h時間點上，各組數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在12 h時間點上，各組數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；在24 h時間點上，各組數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1、表1。

表1 術后各組各時間點脊髓中HO-1 mRNA表達水平比較(n=6)

注：與C組比較，aP<0.05；與A組比較，bP<0.05。

2.3 3組大鼠不同時間HE染色的比較 A組神經(jīng)元細胞形態(tài)正常，無水腫及壞死，無明顯出血點。B組出血灶明顯，炎性細胞增生明顯，部分神經(jīng)元水腫、壞死。C組出血灶較B組明顯縮小，神經(jīng)元水腫亦較輕。見圖2。2.4 3組大鼠不同時間免疫熒光的比較 HO-1神經(jīng)細胞胞質中分布較多，呈紅色。C組表達最強，B組次之，A組最弱。見圖3。

圖1 術后各組各時間點RT-PCR結果(n=6)

A組 B組 C組

A組 B組 C組

3 討論

MT是一種胺類神經(jīng)內分泌激素，由松果體產生，具有調節(jié)時間節(jié)律、調節(jié)體溫中樞等生理作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，對于SCI，MT不僅具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、調節(jié)免疫等功能，還能提高神經(jīng)營養(yǎng)作用，減少神經(jīng)細胞凋亡，促進神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌[7-10]。這為SCI的治療和研究提供新的方法和思路。

血紅素氧合酶1，即熱休克蛋白32，是一種誘導型的血紅素氧合酶，廣泛存在于各個組織細胞中，在熱休克、重金屬、紫外線、缺血缺氧、創(chuàng)傷等多種因素誘導下，HO-1的活性能提高100倍，是目前發(fā)現(xiàn)的最容易受誘導的酶。HO-1的催化分解產物是一氧化碳、鐵離子、膽紅素，它的抗氧化性作用機制與這些產物有關。也有學者指出，HO-1能增加星形細胞、巨噬細胞、膠質細胞內多種酶的活性，從而抑制神經(jīng)組織的繼發(fā)性損傷[11]。近來研究表明HO-1對腦損傷有重要的保護作用[12]，但是對于SCI中HO-1的研究尚未透徹，特別是在MT作用下，HO-1在SCI中會有什么樣的表達和作用，目前尚未見報道。

從實驗結果來看，在各個時間點上，HE染色顯示的SCI由輕到重依次是對照組、MT組、損傷組，免疫熒光顯示的HO-1表達由少到多分別是對照組、損傷組、MT組。RT-PCR的結果顯示，在12 h和24 h時間點上，各組間HO-1 mRNA的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且差異越來越明顯(12 h時間點上P<0.05，24 h時間點上P<0.01)。但在6 h時間點上，各組間HO-1 mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義，其原因可能和腹腔注射MT的吸收有關。綜上，本實驗研究可以證明SCI后MT能促進HO-1的表達，但究竟是通過怎樣的信號通路進一步影響炎性因子和細胞營養(yǎng)因子的分泌，還需做進一步的研究。

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Effects of melatonin on the expression of HO-1 factor after acute spinal cord injury

Xu Yusheng, Li Yang, Wang Xin, Zhu Haiyang, Zhong Bin, Li Penghui, Su Yifan

(The Sixth Department of Orthopaedics, the First Affiliated Hospital of ZhengZhou University, ZhengZhou 450000, China)

Objective To study the effects of melatonin (MT) on the expression of heme oxygenase (HO-1) after acute spinal cord injury (SCI) in rats, and explore the effects of MT on spinal cord injury. Methods A total of 108 adult SD rats were selected and randomly divided into three groups: control group, injury group and MT group. Lamina was removed in control group. Consequencely, T11-T12segment was exposed without spinal nerves damage. The T11-T12acute SCI models in injury group and MT group were established by use of the modified Allen’s method. At 10 min after SCI, MT and MT preparations were intraperitoneally injected in injury group and MT group, respectively. In every groups, 12 rats were randomly sacrificed at 6 h, 12 h and 24 h after operation, then T11-T12spinal cord specimens were collected. The 6 specimens were stored in liquid nitrogen for dectecting the expression level of HO-1 mRNA, while the other 6 specimens were fixed with formalin for HE staining and immunofluorescence sections to observe the spinal cord injury and repair. Results At 6 h, 12 h and 24 h, the levels of HO-1 mRNA in MT group were highest, those of which in control group were lowest. Significant differences (P<0.05) in HO-1 mRNA level at 12 h and 24 h were found among control group, injury group and MT group. In terms of SCI degree, control group was lightest, followed by MT control and injury group. In addition, immunofluorescence showed that HO-1 expression in MT group was the most, that of which in control group was the least. Conclusion MT could promote the expression of HO-1 after acute SCI in rats, and reduce the inflammatory response of injured spinal cord.

spinal cord injury; melatonin; heme oxygenase-1

R-332

10.3969/j.issn.1004-437X.2017.09.004

2016-09-23)