豬精液稀釋液室溫貯存時間效果研究

陶 劍，陳預(yù)明，曹亞鴿，孟 立，衛(wèi)恒習(xí)，李 莉，張守全

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州 510642；2.廣東廣三保養(yǎng)豬有限公司，廣東 廣州 510642）

豬精液稀釋液室溫貯存時間效果研究

陶 劍1，陳預(yù)明2，曹亞鴿1，孟 立1，衛(wèi)恒習(xí)1，李 莉1，張守全1

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州 510642；2.廣東廣三保養(yǎng)豬有限公司，廣東 廣州 510642）

為解決因水質(zhì)所致的豬精液稀釋液效果不穩(wěn)定的問題，試驗選用實驗室研制的配方A和公開 BTS 兩個配方配制成液態(tài)稀釋液，過濾除菌，室溫過夏天貯存后與某商業(yè)用的液態(tài)稀釋液（液態(tài) B）做對照，觀察 3 種液態(tài)稀釋液室溫貯存時間對精子活力和生存指數(shù)的影響。結(jié)果表明，BTS、配方 A 液態(tài)室溫貯存 396 d 用于稀釋豬精液，保存第 3 天精子活力和生存指數(shù)分別為 0.85、0.75和 40.80、39.60，優(yōu)于液態(tài) B 的 0.2 和 24.60，仍能滿足人工授精精子活力的要求。因此，BTS 和配方A液態(tài)精液稀釋液可以推廣應(yīng)用，液態(tài)室溫貯存保持期可達(dá)1年。

豬精液；稀釋液；室溫貯存；保存效果

豬人工授精技術(shù)自從 1932 年試驗成功后，便迅速得到了廣泛的推廣應(yīng)用。豬人工授精技術(shù)可以大幅度減少公豬的飼養(yǎng)，提高優(yōu)秀公豬的配種效率，減少疾病傳播，降低飼養(yǎng)成本。而豬精液的保存品質(zhì)是決定人工授精成功與否的重要因素之一。按照保存溫度的不同，豬精液的保存分為冷凍保存（-196 ℃）、低溫保存（5 ℃）、常溫保存（17 ℃）3 種，其中常溫保存具有方便快捷、技術(shù)要求簡單、成本低廉、保存效果好、活力高、對精子損傷小、受胎率高、窩產(chǎn)仔數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣普及，在豬人工授精中99%以上是采用常溫保存的精液進(jìn)行輸精的[1]。在豬精液的常溫保存中，精子的活力受到環(huán)境溫度、pH、滲透壓、營養(yǎng)物質(zhì)、稀釋倍數(shù)、代謝廢物、細(xì)菌的繁殖生長等諸多因素影響。而精液稀釋液不僅能為精子提供代謝所需的能量、pH 和滲透壓，還可以抑制精子活力和精液中微生物的繁殖，緩沖精子和細(xì)菌的代謝廢物，起到保護(hù)精子、延長有效保存時間的作用[2]。

我國稀釋粉市場中國產(chǎn)稀釋粉所占的市場份額僅為 5%，而進(jìn)口稀釋粉的份額占到了 95%[3]。國產(chǎn)豬精液稀釋粉價格低廉，但大多數(shù)存在保存時間短、輸精效果差的缺點(diǎn)[4]；而且由于豬品種、配 方和 地 域的差異，稀釋粉更表現(xiàn)出不穩(wěn)定的應(yīng)用效果[5]。而進(jìn)口稀釋粉存在價格昂貴、種類繁雜、魚龍混雜、使用不便等問題，在一定程度上阻礙了我國豬人工授精技術(shù)的推廣應(yīng)用，因而亟待研發(fā)出具有中國自主知識產(chǎn)權(quán)、質(zhì)量可靠的豬精液稀釋粉。

本研究選用 BTS 和配方 A 兩個稀釋液配方，采用實驗室自制的超純水配制成液態(tài)形式，過濾除菌室溫下貯存一段時間后用于精液常溫保存試驗，以探索稀釋液室溫下的貯存效果。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點(diǎn)

試驗于 2014 年 9 月至 2015 年 12 月在廣東廣三保畜牧有限公司開平分公司進(jìn)行。

1.2 材料

1.2.1 試劑 無水葡萄糖、檸檬酸鈉、檸檬酸、碳酸氫鈉（NaHCO3）、EDTA、Tris、Hepes、氯 化 鉀（KCl），均 由Sigma 公司生產(chǎn)，青霉素鈉由華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，硫酸鏈霉素由深圳華藥南方制藥有限公司生產(chǎn)。1.2.2 儀 器 0.45 μm 微孔濾 膜 、0.22 μm 微孔 濾膜、過濾器、高溫高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、17 ℃冰箱、顯微鏡、純水儀。

1.3 方法

1.3.1 液態(tài)稀釋液的配制 實驗室研制的配方 A和公開配方 BTS 的配制：準(zhǔn)確稱量試劑，加入 1 L 實驗室自制的超純水，用磁力攪器攪拌使之充分溶解，配制成液態(tài)形式。在超凈工作臺中利用經(jīng)過高溫高壓滅菌的過濾器過濾除菌，密封后室溫貯存?zhèn)溆?。商業(yè)用的進(jìn)口稀釋液（液態(tài) B）在市場上購買。

1.3.2 精液采集 選取體型健美的優(yōu)秀杜洛克種公豬采用手握法采集全份精液，用濾紙過濾去除膠狀物后保存于保溫杯中，30min 內(nèi)送達(dá)實驗室。初步檢測精液品質(zhì)，選取精子活力大于 0.8、無異味且乳白色的精液進(jìn)行試驗研究。精液均分為 3 份，按相同比例進(jìn)行等溫稀釋，密度為 3×107～5×107個/mL，分裝到輸精瓶中，待溫度降到常溫后用干毛巾包裹置于 17 ℃恒溫箱中保存，每隔 12 h 翻動輸精瓶 1 次，以防精子凝集沉淀。

1.4 精子活力和生存指數(shù)的檢測

每隔 24 h，從輸精瓶中吸取 50 μL 稀釋精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，升溫到 37 ℃，400 倍顯微鏡下觀察。每次至少選取4個視野觀測直線運(yùn)動精子數(shù)量，采用十級評定法計算精子活力和生存指數(shù)。

活力：直線運(yùn)動精子占總精子數(shù)的百分率。

生存指數(shù)=∑（上次活力+下次活力）/2×?xí)r間間隔。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同常溫稀釋液對精子活力的影響

不同常溫稀釋液對精子活力的影響結(jié)果詳見表1。BTS 和配方 A 稀釋液室溫貯存 396 d 后進(jìn)行精液保存試驗，保存第 3 天精子活力仍然還能達(dá)到 0.85和 0.75，滿足生產(chǎn)使用的要求；而對照組液態(tài) B 室溫貯存 201 d 時常溫保存第 3 天精子活力為 0.65，隨后的試驗數(shù)據(jù)表明其保存效果逐步下降，貯存 396 d后進(jìn)行精液保存試驗，保存第 3 天精子活力僅為0.2。

表1 3 種配方稀釋液液態(tài)室溫貯存時間對豬精子活力的影響（n=1）

2.2 不同常溫稀釋液對精子生存指數(shù)的影響

如表2所示，BTS和配方A的生存指數(shù)比較穩(wěn)定，全程穩(wěn)定維持在 40 左右，且 BTS 略高于配方 A。而液態(tài) B 室溫貯存的保質(zhì)期在 200 d 左右，200 d 以后生存指數(shù)直線下降，到 396 d 時生存指數(shù)僅約為 25。液態(tài) B的試驗結(jié)果與包裝袋上述6個月的保質(zhì)期基本一致。

表2 3 種配方稀釋液液態(tài)室溫貯存時間對豬精子生存指數(shù)的影響（n=1）

3 討論

3.1 水質(zhì)對豬精液常溫保存的影響

在豬精液常溫保存過程中水質(zhì)對精子的活力有很大的影響[6]。生產(chǎn)中，所采用的稀釋用水主要是取自豬場附近水源進(jìn)行蒸餾或商業(yè)飲用蒸餾水，也有直接使用高山天然礦泉水、井水等，甚至有的直接使用自來水進(jìn)行稀釋。有研究發(fā)現(xiàn)，無污染、水質(zhì)好的高山礦泉水和質(zhì)量好的蒸餾水作稀釋用水精子存活時間最長[7]。由于受到豬場的 污染或者附近農(nóng)村使用化肥農(nóng)藥的影響，以及農(nóng)村和城市的生活污水、工廠的廢水等的污染，在制備雙蒸水的時候可能會有部分揮發(fā)性的有毒物質(zhì)經(jīng)過蒸發(fā)、冷凝融入雙蒸水中，影響蒸餾水水質(zhì)，從而在精液稀釋時會影響精子的存活時間。而且有些基層人員在制取、運(yùn)輸、保存雙蒸水的過程中操作不當(dāng)，也容易導(dǎo)致雙蒸水受到污染，最終影響精液的正常使用，降低受胎率和產(chǎn)仔數(shù)。試驗中兩個自配的常溫豬精液稀釋液采用實驗室自制的超純水，水質(zhì)較好，這可能是豬精液保存效果較好的原因之一。

3.2 糖類對豬精液常溫保存的影響

精子維持正常的細(xì)胞代謝和運(yùn)動需要能量，葡萄糖在絕大多數(shù)的配方中是為精子提供能量的，精子的產(chǎn)能主要是通過糖酵解途徑進(jìn)行的[8-9]，因此，常在精液稀釋液中加入糖類以維持精子的生存。糖類不僅可以為精子的運(yùn)動提供能量，還可以在精子周圍置換水分子，形成保護(hù)膜，提高精子對滲透壓的耐受能力[10]。蘇澤智等[11]認(rèn)為，海藻糖可以通過其羥基和精子細(xì)胞膜上的磷酸根結(jié)合，形成保護(hù)膜進(jìn)而保護(hù)質(zhì)膜。Maxwell等[12]認(rèn)為，精液稀釋液的滲透壓主要靠非離子物質(zhì)維持，離子對滲透壓維持沒有太大作用。因此也常用糖類來調(diào)節(jié)稀釋液的滲透壓。但是，糖類的含量不宜過高，否則對精子有損傷，影響受精率，因此傳統(tǒng)的高糖配方（5%糖類）可能并不利于精子的長期保存。研究表明，低糖稀釋液對精子的保存效果顯著優(yōu)于高糖稀釋液，較高的糖類濃度會損傷精子的頂體[13]。Althouse 等[14]認(rèn)為，稀釋液中的葡萄糖在常溫保存下會促進(jìn)大部分革蘭氏陰性菌的生長，進(jìn)而導(dǎo)致精子活力下降、精子凝集、頂體腫脹等。周歧生等[15]認(rèn)為，蜜糖具有抗菌效果，同時含有果糖、蔗糖、葡萄糖等營養(yǎng)成分更利于精子的保存。3.3 緩沖劑對豬精液常溫保存的影響

精液稀釋液中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，利于微生物的生長、繁殖，可能會產(chǎn)生大量的代謝廢物刺激精子，導(dǎo)致精子死亡。而精液保存的環(huán)境無氧，精子通過糖酵解途徑產(chǎn)生大量的乳酸，隨著保存時間的延長，精子代謝活動產(chǎn)生的酸性物質(zhì)積累，達(dá)到一定程度 就 會 引 起 精 子 的 代 謝 性 酸 中 毒 死 亡[6]，而 精 清 中也含有一些影響精子保存的物質(zhì)，降低濃度或去除更有利于精子的保存[16]。高飛等[9]認(rèn)為，高濃度的鈣離子（Ca2+）可以啟動精子獲能，對受精是很有必要的，但卻不利于精子的保存。因此，在稀釋液中加入一定量的緩沖劑是很有必要的。常用的緩沖劑有檸檬酸、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉等。張寶珣等[1]認(rèn)為，Hepes和 Mops等兩性有機(jī)緩沖劑的緩沖能力要好于無機(jī)物，并且具有螯合有害金屬離子的作用。但在本試驗中并沒能很好地體現(xiàn)出 Hepes的緩沖效果，可能是其添加量不足所致。常用的有機(jī)緩沖劑還有諸如Tris、BSA 等。有研究表明，適當(dāng)?shù)奶砑?BSA 可以穩(wěn)定精子結(jié)構(gòu)，維持精子的運(yùn)動[17]，克服冷卻過程中產(chǎn)生的溶血磷脂和自由脂肪酸造成的 Ca2+易進(jìn)入胞內(nèi)的性質(zhì)[18]，對抗自由基對精子的 損傷 ，降 低 丙 二 醛（MDA）濃度[19]，中和精子和細(xì)菌代謝副產(chǎn)物[12]，減少精子頭對頭凝集[16]。而鉀離子（K+）可以維持精子膜上 Na+-K+泵運(yùn)轉(zhuǎn)，適當(dāng)添 加氯化鉀（KCl）可防止精子耗竭 K+而喪失運(yùn)動能力[20]，BTS 配方效果優(yōu)于配方 A 可能是因為其中添加了 K+維持了精子的運(yùn)動能力。

4 結(jié)論

本試驗表明，BTS 和配方 A 的液態(tài)精液稀釋液在室溫下有較為良好的貯存效果，貯存 396 d 后用于精液稀釋試驗，保存第3天精子活力分別為0.85、0.75，符合保存 3 d 精子活力大于 0.6 的人工授精要求。因此，BTS 和配方 A 的液態(tài)精液稀釋液可以推廣應(yīng)用，液態(tài)室溫貯存保持期達(dá)1年。

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（編輯：富春妮）

觀看條紋圖案能引發(fā)偏頭痛

【英國《每日電訊報》網(wǎng)站 5月 8日報道】荷蘭和美國的科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對于某些人來說，僅僅注視垂直的條紋—無論是在靜止的圖案上還是在實際生活中—就可能觸發(fā)大腦活動的神經(jīng)回路。在某些案例中，這可能導(dǎo)致癲癇，而研究人員認(rèn)為這還可能引起偏頭痛。

有 1/7 的英國人患有偏頭痛，而其病因常常無人知道。但是這篇論文的作者相信，服裝、建筑物或公共美術(shù)作品上的條紋圖案可能會引發(fā)嚴(yán)重的頭痛，尤其是對于已經(jīng)對光敏感的人們。

他們指出，露臺裝飾、暖氣片、自動扶梯、造型重復(fù)的磚墻，甚至帆布篷或輕便折疊躺椅上的條紋，都可能引起疾病發(fā)作、癲癇，或者只是某種難以描述的不適感。

荷蘭烏得勒支大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的多拉·赫爾梅斯說：“我們的研究結(jié)果意味著，在設(shè)計建筑物的時候，或許有必要避免那些可能激活這一回路并導(dǎo)致不適感、偏頭痛或癲癇的視覺圖案類型。甚至是完全健康的人，在看到那些最有可能引發(fā)光敏性癲癇發(fā)作的圖案后，也可能會感到輕度的不適?！?/p>

眾所周知，閃爍或明亮的燈光會引發(fā)癲癇發(fā)作或偏頭痛。在 1997 年的一起事件中，一集《口袋妖怪》卡通片在日本導(dǎo)致 685 人癲癇發(fā)作。無獨(dú)有偶，2012 年倫敦奧運(yùn)會的一則廣告在引發(fā)癲癇發(fā)作后不得不進(jìn)行了修改，該廣告畫面展示的是泛著漣漪的彩色泳池中的一名跳水運(yùn)動員。

但這是科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)某些靜態(tài)圖形也可能產(chǎn)生類似的影響。

在廣泛查閱現(xiàn)有的科學(xué)文獻(xiàn)后，研究人員認(rèn)為，條紋圖案影響人體的原因是它們會引發(fā)大腦內(nèi)一種特定的重復(fù)性神經(jīng)活動，即所謂的伽馬振蕩。條紋圖案會導(dǎo)致強(qiáng)烈的伽馬振蕩，而出于科學(xué)家并不完全了解的原因，蓬松的云朵或自然景色一般不會導(dǎo)致伽馬振蕩。

研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)他們對黑白條紋圖案進(jìn)行修改從而使垂直線條變得更寬，或者開始形成格子圖案的時候，研究對象大腦中伽馬振蕩的活躍度出現(xiàn)了下降。

研究報告發(fā)表在《當(dāng)代生物學(xué)》半月刊上。

（轉(zhuǎn)自 參考消息[N]，2017-05-13）

Study on the Storage Tim e of Boar Semen Liquid Diluents at Room Tem perature

TAO Jian1,CHEN Yuming2,CAO Yage1,MENG Li1,WEIHengxi1,LILi1,ZHANG Shouquan1
（1.National Engineering Research Center For Breeding Swine Industry,Guangdong Provincial Key Laboratory of Agro-animal Genomics and Molecular Breeding,College of Animal Science,South China Agricultural University, Guangzhou 510642,China;2.Guangdong Guangsanbao Co.,Ltd.,Guangzhou 510642,China)

In order to solve this problem due to the water quality,Diluent Formula A (DFA)and BTSmade in our own lab were used to extend semen samples,ofwhich the bacteria was filtered out,and then were preserved atambient temperature for the whole summer.A commercial extender(liquid B)was introduced as control group. Sperm motility and survival index were investigated among three different formulations of semen diluents.The results showed that after 396 d stored at ambient temperature,the DFA and BTS formula semen diluents diluted sperm can stillmeet the requirements of artificial insemination,and the sperm motility and survival index were 0.85,0.75 and 40.80,39.60 after 3 days,respectively,which was better than liquid B (0.2,24.60).Therefore, BTSand DFA semen dilution formula can be applied in production and constantly stored for one year in liquid.

boar semen;dilution;store at room temperature;save effect

S828

A

1002-1957(2017)03-0045-04

2017-05-08

廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團(tuán)隊項目（2016LM1102）

陶 劍（1992-），男，廣西桂林人，在讀碩士研究生，研究方向為生殖生理與生物技術(shù).E-mail:1318389160@qq.com

張守全（1964-），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為生殖生理與生物技術(shù).E-mail:sqzhang@scau.edu.cn