敦煌醫(yī)方固元補腎湯對鎘染毒模型大鼠免疫功能和抗氧化能力的影響*

張亞維，顏春魯

(1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

·實驗研究·

敦煌醫(yī)方固元補腎湯對鎘染毒模型大鼠免疫功能和抗氧化能力的影響*

張亞維1，顏春魯2

(1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

目的：探討敦煌醫(yī)方固元補腎湯對鎘染毒模型大鼠免疫功能和抗氧化能力的影響。方法：將60只SPF級Wistar大鼠隨機均分為正常對照組，模型對照組，乙酰半胱氨酸組，固元補腎湯、中、低劑量組6組，每組10只。正常對照組腹腔注射9 g/L NaCl溶液，其余5組均腹腔注射1 g/L氯化鎘溶液，按1.5 μg/g注射，1周5次，連續(xù)5周。各組染毒的同時給予干預(yù)治療：乙酰半胱氨酸組給予乙酰半胱氨酸泡騰片溶液(5.4 g/L)，固元補腎湯低、中、高劑量組依次給予固元補腎湯(低0.675 g/mL，中1.35 g/mL，高2.7 g/mL)，正常對照組、模型對照組給予蒸餾水，均按10 μL/g灌胃,1 d 1次，連續(xù)5周。末次給藥24 h后取血、胸腺和脾臟，計算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。采用比色分析法測定大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量，ELISA法測定大鼠血清白細胞介素-2(IL-2)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的含量。結(jié)果：與正常對照組對比，模型對照組大鼠體質(zhì)量減輕、胸脾指數(shù)和脾臟指數(shù)降低、MDA含量明顯升高、SOD 活性明顯降低、IL-2含量明顯降低，TGF-β1的含量升高，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，各干預(yù)組大鼠體質(zhì)量升高、MDA含量降低，SOD活性升高IL-2含量升高，TGF-β1含量降低，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型對照組對比，乙酰半胱氨酸組和固元補腎湯高、中劑量組大鼠脾臟指數(shù)增加，乙酰半胱氨酸組和固元補腎湯高劑量組大鼠胸腺指數(shù)增加,差別亦均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：固元補腎湯對鎘所致大鼠的氧化損傷和免疫損傷具有保護作用。

固元補腎湯/藥效學(xué)；鎘染毒模型；氧化損傷；免疫功能；動物；大鼠

鎘(Cadmium)是一種廣泛存在于自然界中的銀白色有光澤的重金屬，可以通過各種途徑進入機體，造成機體多器官、多系統(tǒng)損傷[1]。目前有關(guān)鎘中毒的研究主要集中在腎、肺、肝、睪丸、骨骼等器官和血液系統(tǒng)方面[2]，免疫系統(tǒng)方面的研究甚少。本研究采用腹腔注射1 g/L氯化鎘建立鎘染毒大鼠模型，通過觀察敦煌古醫(yī)方固元補腎湯對染鎘大鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量、白細胞介素-2(IL-2)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)含量的影響，探討其在鎘導(dǎo)致氧化損傷和免疫毒性損傷發(fā)生過程中的作用，以期為防治鎘中毒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動 物

SPF級Wistar大鼠60只，體質(zhì)量(180±20) g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證編號：SCXK(甘)2015-0002。

1.2 藥品、試劑與儀器

固元補腎湯水煎液，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科制備，藥物組成：地黃90 g、薯蕷90 g、苦酒1 L、炙甘草120 g、薤白120 g、干姜60 g。制備好后放4 ℃冰箱保存，備用。乙酰半胱氨酸泡騰片，海南贊邦制藥有限公司分裝，批號20120410。氯化鎘，天津市巴斯夫化工有限公司產(chǎn)品，批號20081010；考馬斯亮蘭試劑盒、SOD檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號依次為20140309，20140310，20140305；Rat IL-2 precocated ELISA kit 和Rat TGF-β precocated ELISA kit檢測試劑盒，均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品，批號依次為20140509和20140416。iMark型全自動酶標(biāo)分析儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；FA2004N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；ZY12306型微量加樣器，ScienTiFic產(chǎn)品；T6型新悅-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機，湖南平凡科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 動物分組、模型的建立與給藥

將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按照隨機數(shù)字表法分為正常對照組，模型對照組，乙酰半胱氨酸組，固元補腎湯低、中、高劑量組6組，每組10只。正常對照組腹腔注射9 g/L NaCl溶液，其余5組均腹腔注射1 g/L氯化鎘溶液，按1.5 μg/g注射，1周5次，連續(xù)5周。各組染毒的同時給予干預(yù)治療：乙酰半胱氨酸組給予乙酰半胱氨酸泡騰片溶液(5.4 g/L)，固元補腎湯低、中、高劑量組依次給予固元補腎湯(低0.675 g/mL，中1.35 g/mL，高2.7 g/mL)，正常對照組、模型對照組給予蒸餾水，均按10 μL/g灌胃,1 d 1次，連續(xù)5周。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 免疫器官指數(shù)

末次給藥24 h小時后，稱量大鼠體質(zhì)量，動脈采血，頸椎脫臼法處死大鼠，摘取脾臟、胸腺等組織稱量質(zhì)量，分別計算脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.4.2 血清SOD、MDA、IL-2和TGF-β1含量

動脈采血5 mL，注入試管內(nèi)，靜置2 h， 3 000 r/min離心10 min，分離血清，比色分析法測定血清SOD活性及MDA含量，ELISA法測定血清IL-2和TGF-β1含量，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠處死前體質(zhì)量變化

與正常對照組對比，模型對照組大鼠體質(zhì)量降低,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，各干預(yù)組大鼠體質(zhì)量均增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠處死前體質(zhì)量變化±s

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.2 各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)對比

與正常對照組對比，模型對照組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均降低,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，乙酰半胱氨酸組和固元補腎湯高、中劑量組大鼠脾臟指數(shù)增加，乙酰半胱氨酸組和固元補腎湯高劑量組大鼠胸腺指數(shù)增加,差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠脾臟指數(shù)何胸腺指數(shù)對比 ±s

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.3 各組大鼠血清SOD和MDA含量對比

與正常對照組對比，模型對照組 MDA含量升高、SOD 活性降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型對照組對比，各干預(yù)組MDA含量降低，SOD活性升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

組 別SOD/(U·mL-1)MDA/(μmol·L-1)正常對照組72.72±8.106.26±0.98模型對照組38.28±4.92*13.36±1.15*乙酰半胱氨酸組64.87±10.15#7.86±0.83#固元補腎湯高劑量組66.12±7.94#7.78±1.12#固元補腎湯中劑量組68.07±5.03#8.19±1.15#固元補腎湯低劑量組65.54±4.92#8.31±0.72#

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

2.4 各組大鼠血清 IL-2和TGF-β1含量對比

與正常對照組對比，模型對照組 IL-2含量降低，TGF-β1含量升高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) 。與模型對照組對比，各干預(yù)組IL-2含量升高，TGF-β1降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

組 別IL-2/(ng·L-1)TGF-β1/(μg·L-1)正常對照組223.61±28.595.50±0.51模型對照組130.56±20.18*11.78±0.83*乙酰半胱氨酸201.39±23.81#6.17±0.35#固元補腎湯高劑量組191.67±33.63#6.29±0.52#固元補腎湯中劑量組184.72±32.24#7.39±0.39#固元補腎湯低劑量組166.67±13.18#7.80±0.61#

注：與正常對照組對比，*P<0.05；與模型對照組對比，#P<0.05。

3 討 論

敦煌古醫(yī)方是來源于敦煌莫高窟藏經(jīng)洞的敦煌遺書，其中的中醫(yī)學(xué)內(nèi)容是“敦煌學(xué)”研究的重要領(lǐng)域之一。這些隋唐五代時期醫(yī)學(xué)家們留下的經(jīng)驗醫(yī)方涉及范圍非常廣泛。本課題所采用的固元補腎湯正是出自于敦煌古醫(yī)方。該方由地黃90 g、薯蕷90 g、苦酒1 L、炙甘草120 g、薤白120 g、干姜 60 g組成，治下元虛衰、虛火上擾證。大量研究證實，地黃復(fù)方制劑地黃益智顆粒[3]、地黃有效成分地黃多糖[4-5]、山藥多糖[6]、甘草有效成分甘草苷[7]、薤白提取物[8]、干姜提取液[9]都可以提高機體的SOD活性，降低MDA含量，具有較好的抗氧化、提高免疫力等生物學(xué)活性。本實驗中模型對照組大鼠血清SOD活性降低、MDA含量升高，考慮可能是由于鎘與SOD 中的二價金屬離子發(fā)生競爭性替代作用，抑制了SOD的活力[10]；也可能是鎘進入體內(nèi)產(chǎn)生的自由基不斷消耗SOD所致。固元補腎湯各劑量組大鼠血清中的SOD活性升高、MDA含量降低提示：固元補腎湯能夠增加氧自由基清除劑含量，抑制體內(nèi)脂質(zhì)過氧化過程，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量和氧自由基代謝產(chǎn)物的損害，達到調(diào)節(jié)氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡，從而使機體細胞和組織免受鎘的損害。

胸腺與脾臟是機體重要的免疫器官，其結(jié)構(gòu)正常與否直接影響機體的免疫功能，胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的高低變化可以反映機體的免疫功能狀態(tài)[11]。另外，IL-2和TGF-β1在免疫功能的調(diào)節(jié)上屬于一對截然相反的指標(biāo)。IL-2是機體正向免疫調(diào)節(jié)中最重要的細胞因子之一，主要由T淋巴細胞分泌，功能是促進T、B淋巴細胞的增殖[12]。TGF-β1 可能是免疫系統(tǒng)關(guān)閉的信號之一，其可以抑制所有淋巴細胞的增殖與功能[13]。本實驗結(jié)果中，模型對照組大鼠胸、脾指數(shù)和血清IL-2含量明顯降低，TGF-β1含量明顯升高，提示染毒之后，機體的免疫功能受損。固元補腎湯高、中劑量組脾臟指數(shù)增加，固元補腎湯高劑量組大鼠胸腺指數(shù)增加，且固元補腎湯各劑量組大鼠IL-2含量增加、TGF-β1含量降低，提示：固元補腎湯可能是通過調(diào)節(jié)機體的細胞因子表達來糾正和改善機體的免疫功能的。

總之，鎘中毒可以導(dǎo)致機體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷及免疫功能紊亂。固元補腎湯可能通過提高機體的抗氧化能力，加速機體自由基的清除來糾正機體的氧化和抗氧化之間的平衡失調(diào)，也可能是通過調(diào)節(jié)細胞因子的表達來糾正和改善機體的免疫功能，最終達到拮抗鎘毒性的目的，但其具體機制尚需進一步研究。

[1]魏樹和,周啟星.重金屬污染土壤植物修復(fù)基本原理及強化措施探討[J].生態(tài)學(xué)雜志,2004,23(1):65-72.

[2]孫鐵珩，李培軍，周啟星.土壤污染形成機理與修復(fù)技術(shù)[M].北京:科學(xué)出版社 ，2005：256.

[3]劉海云，崔艷茹，伍慶華，等.菟絲子總黃酮對過氧化氫損傷的血管內(nèi)皮細胞的保護作用 [J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013,19(18):215-218.

[4]彭輝.地黃多糖對心肌缺血再灌注損傷大鼠保護作用研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2016,18(6):39-42.

[5]楊兵,夏先林,施曉麗,等.熟地黃多糖對斷奶仔豬抗氧化性能和免疫性能的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2012,28 (4):787-791.

[6]唐群，吳華，雷久士.山藥多糖預(yù)處理對大鼠腎缺血再灌注損傷的抗氧化保護作用[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2013,10(9):21-24.

[7]孫國慶,羅正里.甘草苷對衰老模型大鼠的抗衰老作用[J].中國老年學(xué)雜志,2014,34(7):1895-1896.

[8]李向紅，顧麗貞，張百舜，等.薤白提取物的抗氧化作用研究[J].中藥材,1994,17(11):34-37.

[9]張旭，游國葉.干姜對小鼠抗應(yīng)激能力的影響[J].河南大學(xué)學(xué)報,2014,33(2):99-103.

[10]夏源,鄒志方,羅敏,等.原花青素對鎘染毒大鼠血清和肝臟中SOD活性、MDA含量的影響[J].基礎(chǔ)研究，2010,48(23):8-10.

[11]趙迎虎,張明軍,劉進輝,等.中藥制劑對小鼠耐力及免疫器官指數(shù)影響[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2010，30(1):14-17.

[12]費東亮,肖銀霞,蘇禹剛,等.鉛鎘聯(lián)合染毒對雞血液中細胞因子水平的影響[J].畜牧與獸醫(yī),2012,44(8):59-61.

[13]龔非力.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社， 2003：182.

(編輯 陶 珠)

1001-6910(2017)03-0070-04

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2017.03.32

張亞維(1968-)，男(漢族)，甘肅天水人，副主任醫(yī)師，學(xué)士，主要研究方向：四肢創(chuàng)傷與關(guān)節(jié)矯形。

甘肅省自然科學(xué)基金項目(1508RJZA046)；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中青年基金項目(ZQ2014-9)；敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點實驗室開放基金項目(DHYX1213-004)

2016-12-19；

2017-02-08