脾胃濕熱與變應(yīng)性鼻炎模型小鼠相關(guān)性的初步研究*

屈靜廉海紅劉暢王向東

·實(shí)驗(yàn)研究·

脾胃濕熱與變應(yīng)性鼻炎模型小鼠相關(guān)性的初步研究*

屈靜1廉海紅1劉暢1王向東2

目的探討脾胃濕熱與變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis,AR）發(fā)病的內(nèi)在關(guān)系。方法8～10周齡雄性BALB/c小鼠30只，隨機(jī)分為空白組、AR模型組和“脾胃濕熱+AR”組，比較觀察三組鼠的行為學(xué)、病理改變，以及關(guān)鍵細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ水平的組間差異。結(jié)果各組小鼠的行為評(píng)分、病理改變及細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ的組間差異均存在顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論脾胃濕熱狀態(tài)與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病存在密切關(guān)系。

變應(yīng)性鼻炎；脾胃濕熱；相關(guān)性；病機(jī)特征

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)，即過(guò)敏性鼻炎，是機(jī)體接觸變應(yīng)原后主要由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性炎性疾病[1]。流行病學(xué)研究顯示，變應(yīng)性鼻炎發(fā)病率在世界范圍的發(fā)病率為10%～25%[2]，在我國(guó)中心城市8.7%～24.1%[3]。目前，變應(yīng)性鼻炎動(dòng)物模型的制備方法比較成熟。脾胃濕熱動(dòng)物模型的制備近10年來(lái)得到不斷發(fā)展、改進(jìn)，研究者已經(jīng)成功制備[4-6]。據(jù)前期的臨床觀察，脾胃濕熱在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病中起著重要作用，本研究擬建立脾胃濕熱的動(dòng)物模型，觀察其癥狀學(xué)、病理學(xué)、細(xì)胞因子的改變，以期從實(shí)驗(yàn)角度證實(shí)。

材料與方法

1材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用SPF級(jí)、8～10周齡雄性BALB/C小鼠，體重最低17.7g，最高21.6g，平均體重19.81±0.96g，共30只，購(gòu)于維通利華公司。在北京市眼科研究所屏障系統(tǒng)動(dòng)物房飼養(yǎng)，恒溫恒濕的環(huán)境下，固體飼料，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。30只小鼠隨機(jī)分為三組：脾胃濕熱并變應(yīng)性鼻炎模型組、變應(yīng)性鼻炎模型組、空白組。

1.2 試劑及藥品

卵清蛋白（Ovalbumin，OVA，sigma公司）、氫氧化鋁[Al(OH)3，上海美興化工股份有限公司]、生理鹽水、蜂蜜水、豬脂、55度白酒、10%甲醛、10%依地酸鈉鈣（EDTA）、石蠟、鼠IL-4、IFN-γELISA檢測(cè)試劑盒（BD公司）。

2方法

2.1 AR模型

按Ogasawara H等[7]和Yuhui Ouyang等[8]方法稍加改動(dòng)，基礎(chǔ)致敏階段（1～14天）：OVA 50μg/只加入免疫佐劑Al(OH)3（5mg/只）制成生理鹽水混懸液1ml，予小鼠腹腔注射，隔天1次，共7次；激發(fā)階段（15～21天）：以5%OVA 20μL/只點(diǎn)鼻，1次/d，共7次。

2.2 脾胃濕熱+AR模型

與AR造?；A(chǔ)致敏階段同時(shí)進(jìn)行。

采用呂冠華等[9]、劉冬梅[10]方法稍加改善，第1-5天，將小鼠單日禁食(自由飲水)，雙日正常飲食，自第6天起每日每只小鼠給予20%（200g/L）蜂蜜水，自由飲用，不再給其他飲水。第7、9、11、13天，每只小鼠灌服白酒10ml/kg，第6、8、10、12、14天每只給予豬脂30g/kg。第15～21天，恢復(fù)正常飲食、飲水，與AR模型組處理完全相同。

2.3 與造模同時(shí)進(jìn)行的對(duì)照處理

在脾胃濕熱狀態(tài)造模的同時(shí)，空白組和AR模型組置于正常環(huán)境下正常飼料喂養(yǎng)，自由飲水。AR造模時(shí)，空白組給予同等劑量生理鹽水作致敏液，激發(fā)期給予等劑量生理鹽水滴鼻。

3觀察項(xiàng)目

3.1 觀察一般情況

觀察并詳細(xì)記錄每日小鼠的皮毛、狀態(tài)、體重、大便、行為、狀態(tài)。

3.2 鼻部癥狀觀察

末次即第21天鼻腔滴藥后30分鐘，觀察小鼠搔鼻、噴嚏、流清涕鼻部癥狀，并進(jìn)行評(píng)分。

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按照趙秀杰等[11]采用，陳煒等[12]稍加改進(jìn)的積分辦法。鼻癢:無(wú)抓鼻為0分，抓鼻1～5次為1分，5次以上為2分；噴嚏:無(wú)噴嚏0分，1～3個(gè)為1分，4～10個(gè)為2分，11個(gè)以上為3分；清涕:無(wú)鼻涕為0分，流至前鼻孔為1分，超出前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。

3.3 血清IL-4、IFN-γ測(cè)定

將小鼠用摘眼球法取眶內(nèi)動(dòng)靜脈血液，裝于抗凝管內(nèi)，放入離心機(jī)內(nèi)離心，3000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘，再用微量移液器取上清液，置于-80℃冰箱保存，采用IL-4、IFN-γ鼠試劑盒以雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)。

3.4 鼻黏膜病理改變

取血后將小鼠斷頭處死，分離組織，剪去鼻腔周圍骨性結(jié)構(gòu)，將整個(gè)鼻腔取出，用10%甲醛固定，用10%EDTA脫鈣，以針刺鼻甲骨性結(jié)構(gòu)無(wú)阻力為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行石蠟包埋，行蘇木素—伊紅(HE)染色，萊卡組織切片機(jī)將標(biāo)本做4μm厚切片。應(yīng)用奧林帕斯光鏡，視野（×10-×400）倍觀察。

4統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，全部數(shù)據(jù)按計(jì)數(shù)資料、計(jì)量資料選擇統(tǒng)計(jì)方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1病理觀察

每個(gè)標(biāo)本任選3張切片，應(yīng)用奧林帕斯光鏡，自低倍視野（×10）至高倍視野（×400）觀察。主要觀察項(xiàng)目有黏膜是否完整，有無(wú)滲出、出血，嗜酸粒細(xì)胞數(shù)目。

脾胃濕熱+AR模型組中可見(jiàn)鼻中隔黏膜有明顯滲出、出血，黏膜內(nèi)及髓腔見(jiàn)大量嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，AR模型組中可見(jiàn)鼻中隔粘膜較上組出血、滲出情況要好，黏膜不連續(xù)，內(nèi)見(jiàn)嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)，空白組偶見(jiàn)嗜酸粒細(xì)胞、鼻黏膜完整、連續(xù)。典型片如下。

2末次激發(fā)后小鼠癥狀評(píng)分比較

比較各組小鼠體重。末次鼻腔滴藥后30分鐘，觀察小鼠搔鼻、噴嚏、流清涕3個(gè)鼻部癥狀，并進(jìn)行評(píng)分，見(jiàn)表1。

表1 三組小鼠實(shí)驗(yàn)前體重、實(shí)驗(yàn)后癥狀評(píng)分比較（分，±s）

表1 三組小鼠實(shí)驗(yàn)前體重、實(shí)驗(yàn)后癥狀評(píng)分比較（分，±s）

體重癥狀評(píng)分脾胃濕熱+AR模型組AR模型組空白組P 19.88±0.99 19.63±1.06 19.81±0.96 P＞0.05 4.5±0.71 2.67±1.03 0.5±0.58 P＜0.05

比較實(shí)驗(yàn)前各組小鼠體重，無(wú)明顯差異。各組分?jǐn)?shù)比較，P＜0.01，應(yīng)用LSD法兩兩比較：“空白組”與“AR模型組”P＜0.01，“AR模型組”與“脾胃濕熱+ AR模型組”P＜0.05。

統(tǒng)計(jì)分析表明，三組造模后變應(yīng)性鼻炎評(píng)分有顯著差異，兩兩比較也有顯著差異。

3三組小鼠體征比較

空白組小鼠在整個(gè)飼養(yǎng)、造模過(guò)程中，毛色鮮亮，活動(dòng)靈敏；“脾胃濕熱+AR模型組”在造模開(kāi)始后5天始，逐漸毛色稀疏、無(wú)光澤，精神差，活動(dòng)遲緩；“AR模型組”自進(jìn)入造模激發(fā)階段，逐漸有毛發(fā)脫落、光澤變差。如下圖示。

4血清IL-4、IFN-γ的測(cè)定

用摘眼球法取眼眶內(nèi)動(dòng)靜脈血液，由中心實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員進(jìn)行離心，3000r/min，5分鐘，取血清，置于-80℃冰箱保存。應(yīng)用IL-4、IFN-r鼠試劑盒以雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如下，見(jiàn)表2。

表2 三組細(xì)胞因子測(cè)試結(jié)果比較（pg/m l，±s）

表2 三組細(xì)胞因子測(cè)試結(jié)果比較（pg/m l，±s）

IL-4（pg/ml）IFN-r（pg/m l）脾胃濕熱+AR模型組AR模型組空白組P 19.52±10.34 13.21±9.87 8.54±9.11 P＜0.01 11.87±10.51 7.86±6.70 5.67±6.45 P＜0.01

應(yīng)用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差分析方法。三組IL-4和IFN-r含量有顯著差異，并且“脾胃濕熱+ AR模型組”與“AR模型組”之間有顯著差異，“AR模型組”與“空白組”之間有顯著差異。

討論

變應(yīng)性鼻炎的免疫反應(yīng)過(guò)程是體外環(huán)境作用于機(jī)體導(dǎo)致異常免疫反應(yīng)，造成Th1(1型輔助性T細(xì)胞)和Th2（2型輔助性T細(xì)胞）免疫反應(yīng)失衡引發(fā)的以鼻腔黏膜Th2免疫反應(yīng)為主的變應(yīng)性炎癥反應(yīng)[13-15]。細(xì)胞因子對(duì)變應(yīng)性炎癥的調(diào)節(jié)作用被逐步闡明[15]。

Th1細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ），介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5，促進(jìn)體液免疫反應(yīng)。在變應(yīng)原致敏階段，Th2細(xì)胞分泌IL-4刺激B細(xì)胞合成IgE。在速發(fā)相反應(yīng)階段，肥大細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)，引發(fā)急性變應(yīng)性反應(yīng)。同時(shí)，肥大細(xì)胞還產(chǎn)生IL-4和IL-5。另外，T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等還可分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素，參與慢性變應(yīng)性反應(yīng)[16]。本研究測(cè)定IFN-γ、IL-4正是變應(yīng)性鼻炎病理機(jī)制中的關(guān)鍵作用因子，更好的反應(yīng)脾胃濕熱狀態(tài)對(duì)變應(yīng)性鼻炎免疫反應(yīng)進(jìn)程的影響。結(jié)果顯示，在三組小鼠實(shí)驗(yàn)完成后，IFN-γ、IL-4三組之間有顯著差異，兩兩對(duì)照，亦有差異，說(shuō)明變應(yīng)性鼻炎疾病小鼠較正常小鼠的免疫因子高，脾胃濕熱狀態(tài)下，免疫因子較單純變應(yīng)性鼻炎狀態(tài)的免疫因子高。脾胃濕熱狀態(tài)在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病中有著促進(jìn)作用。之前有學(xué)者研究證實(shí)脾胃濕熱證大鼠免疫功能低下，應(yīng)用治療脾胃濕熱的中藥有恢復(fù)機(jī)體免疫功能的作用[17]。亦說(shuō)明出中醫(yī)脾胃濕熱狀態(tài)時(shí)鼠的免疫功能下降，從而對(duì)變應(yīng)性鼻炎發(fā)生發(fā)展起到推進(jìn)作用。

通過(guò)病理學(xué)檢測(cè)和體征觀測(cè)的結(jié)果，亦反應(yīng)出，在脾胃濕熱的條件下，小鼠的變應(yīng)性鼻炎體征表現(xiàn)更顯著，變應(yīng)性鼻炎評(píng)分之間有顯著差異，鼻黏膜的病理性變化更加明顯。

脾胃濕熱是目前臨床上變應(yīng)性鼻炎的常見(jiàn)證候，在現(xiàn)代社會(huì)中，環(huán)境因素，生活壓力增大，飲食不規(guī)律、嗜食肥甘厚味，熬夜等生活方式的變化，導(dǎo)致人群中脾胃濕熱證候狀態(tài)逐漸增加。內(nèi)在證候狀態(tài)加之外在過(guò)敏原，從而發(fā)生變應(yīng)性鼻炎。關(guān)于脾胃濕熱的實(shí)驗(yàn)研究隨之增多，形成了比較成熟的造模方法，本次脾胃濕熱模型綜合了饑飽失常、進(jìn)食油膩、飲酒等因素而成。

此次從基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)角度證實(shí)了脾胃濕熱與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病的內(nèi)在關(guān)系，認(rèn)為中醫(yī)脾胃濕熱狀態(tài)與變應(yīng)性鼻炎發(fā)病存在密切關(guān)系。當(dāng)然，本研究在樣本量上還可以擴(kuò)充，在設(shè)計(jì)方案也能再增加諸如中藥治療組，這有待于下一步深入研究。

1中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編委會(huì),中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)分會(huì)鼻科學(xué)組.變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2009,44(12): 977-978.

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（收稿:2016-09-21修回：2016-11-04）

A prelim inary evaluation on the association of sp leen-stomach dam p-heatw ith experimental allergic rhinitis amongm ice

QU Jing,LIAN Haihong,LIU Chang,WANG Xiangdong
Department of Traditional Chinese Medicine,Affiliated Beijing Tongren Hospital,Capital Medical University, Beijing,100730,China

Objective To preliminarily evaluate the association of spleen-stomach damp-heatwith allergic rhinitis(AR)based on an experimental study amongmice.M ethods Thirtymice were random ly divided into 3 groups,i.e.blank group(BG),AR model group(AMG)and spleen-stomach damp-heat plus AR group(PSDHAG).Determined were the changes of experimental animals in their behavior,histopathology and the related key factors IL-4 and IFN-γamong different groups in a comparative way.Results There were significant differences in the changes of behavior,histopathology and the related key factors IL-4 and IFN-γamong different groups as shown from the results with obviously statistical significance(P＜0.01).Conclusion There should be a close association of spleen-stomach damp-heatwith the developmentof allergic rhinitis in its pathogenesis in the terms of TCM.

Allergic rhinitis;Spleen-stomach damp-heat;Association;Pathogenesis features

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2017.02.001

①脾胃濕熱與變應(yīng)性鼻炎模型鼠血清Th1/Th2細(xì)胞因子相關(guān)性研究（首都中醫(yī)藥專項(xiàng)課題13ZY13）

②清肺健脾法治療持續(xù)性變應(yīng)性鼻炎的即刻、遠(yuǎn)期療效評(píng)價(jià)（首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項(xiàng)項(xiàng)目2014-2-2051）

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)科（北京，100730）；北京市中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科研究所

2北京市耳鼻咽喉科研究所；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉科頭頸外科

屈靜，副主任醫(yī)師.Email:crgjaa@126.com.