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    海南省豬藍(lán)耳病血清學(xué)監(jiān)測(cè)

    2021-12-08 08:54:56彭維祺孫衛(wèi)平葉丹榮光
    熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年11期
    關(guān)鍵詞:耳病陽(yáng)性率理想

    彭維祺 孫衛(wèi)平 葉丹 榮光

    (中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 海南???571101)

    豬藍(lán)耳病是豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)的俗稱(chēng),該病是由PRRS 病毒(PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病,以母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙以及各種年齡豬特別是仔豬呼吸道疾病為主要特征[1-2]。1987 年,美國(guó)首次報(bào)道PRRS,現(xiàn)已遍布世界各地。1996 年,中國(guó)首次報(bào)道由PRRSV 美洲經(jīng)典株所致的PRRS[1];2006年,由PRRSV 美洲型變異株所致的高致病性PRRS(HP-PRRS)在中國(guó)爆發(fā)[3],并迅速蔓延全國(guó),成為危害中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的的疫病,控制該病對(duì)于保障養(yǎng)豬生產(chǎn)穩(wěn)定發(fā)展意義重大[4]。經(jīng)過(guò)多年努力,豬藍(lán)耳病呈平穩(wěn)態(tài)勢(shì),以散發(fā)性臨床疫情為主,無(wú)嚴(yán)重疫情發(fā)生[3]。近年來(lái),由于毒株變異,豬藍(lán)耳病毒減毒活疫苗使用效果不夠理想,存在散毒風(fēng)險(xiǎn)等,有不少養(yǎng)殖企業(yè)停止了減毒活疫苗使用,特別是種豬養(yǎng)殖企業(yè),通過(guò)實(shí)施閉群飼養(yǎng)和自繁自養(yǎng)、檢測(cè)淘汰陽(yáng)性個(gè)體等策略,病毒感染率呈下降態(tài)勢(shì),取得了比較理想的防控效果[5]。通過(guò)抗體監(jiān)測(cè)可正確評(píng)估豬場(chǎng)PRRSV的免疫效果和野毒感染情況[6]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)具有操作簡(jiǎn)單、高通量、快速高效等優(yōu)點(diǎn),是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的抗體檢測(cè)方法[7]。本研究在海南省18 個(gè)不同類(lèi)型豬場(chǎng)采集血液樣品333份,采用ELISA 對(duì)血清PRRSV 抗體進(jìn)行了檢測(cè)和分析,并提出合理化建議,為海南省豬藍(lán)耳病有效防控提供科學(xué)依據(jù),對(duì)海南省無(wú)規(guī)定疫病示范區(qū)和自由貿(mào)易港建設(shè)均具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑

    豬繁殖與呼吸綜合征抗體試劑盒(間接ELISA),批號(hào)為2020101402,購(gòu)自深圳真瑞生物科技有限公司。

    1.1.2 儀器設(shè)備

    酶標(biāo)儀、微量移液器、恒溫培養(yǎng)箱、微量振蕩器。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品采集及制備

    1.2.1.1 樣品采集

    于2020 年12 月在海南省18 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)(戶(hù)),采集豬前腔靜脈血10 mL 置于真空采血管中,采集血樣共計(jì)333 份。其中規(guī)模免疫場(chǎng)3 個(gè),采集血樣50 份;未免疫規(guī)模場(chǎng)11 個(gè),采集血樣210 份;未免疫散養(yǎng)戶(hù)4個(gè),采集血樣73份。

    1.2.1.2 血清制備

    室溫靜置15 min,待血清析出后,以4℃、2 500 r/min 離心15 min,將上層血清轉(zhuǎn)移至滅菌的1.5 mL離心管中,-20℃保存,備用[8]。

    1.2.2 樣品檢測(cè)

    (1)取包被板,吸取稀釋好待檢血清100 μL加入到檢測(cè)板中;同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照1孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔,取陰性及陽(yáng)性對(duì)照各100μL分別加入反應(yīng)孔中,輕輕振勻孔中樣品(勿溢出)。(2)蓋上封板膜,置37℃溫育30 min。(3)小心揭開(kāi)封板膜,甩掉板孔中的溶液,每孔加250 μL 工作濃度洗滌液后甩去孔內(nèi)液體,重復(fù)4~6 次,最后在干凈吸水紙上拍干。(4)每孔加酶結(jié)合物100 μL,蓋上封板膜,置于37℃溫育30 min。(5)小心揭開(kāi)封板膜,甩掉板孔中的溶液,洗滌4~6 次,方法同(3)。切記最后在干凈吸水紙上拍干。(6)每孔各加入顯色液100 μL,輕微震蕩混勻、蓋上封板膜于37℃閉光顯色10 min。(7)每孔加入50μL 終止液,使反應(yīng)終止,10 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀于450 nm(630 nm作參比波長(zhǎng))讀取吸光度OD值。

    結(jié)果判定:試驗(yàn)OD陰性對(duì)照<0.2,同時(shí)OD陽(yáng)性對(duì)照>0.5, 試 驗(yàn) 成 立 。 判 定 標(biāo) 準(zhǔn) :(OD樣品-OD陰性對(duì)照) ÷ (OD陽(yáng)性對(duì)照-OD陰性對(duì)照) =IRPC。IRPC≥0.4則判為陽(yáng)性,否則判為陰性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 總體血清抗體檢測(cè)結(jié)果

    18個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)(戶(hù))333份豬血清抗體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。其中免疫規(guī)模場(chǎng)、未免疫規(guī)模場(chǎng)、未免疫散養(yǎng)戶(hù)血清抗體陽(yáng)性率分別為68%、0、12%。

    表1 血清抗體檢測(cè)結(jié)果

    2.2 免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體檢測(cè)結(jié)果

    3 個(gè)免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體陽(yáng)性率分別為100%、45%、50%,除A 場(chǎng)達(dá)到理想保護(hù)以外,其余2 場(chǎng)均未達(dá)到理想保護(hù)(表2)。

    表2 免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體檢測(cè)結(jié)果

    2.3 未免疫養(yǎng)殖場(chǎng)血清抗體檢測(cè)結(jié)果

    2.3.1 未免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體

    11個(gè)未免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體陽(yáng)性率均為0(表3),凈化效果均比較理想。

    表3 未免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體檢測(cè)結(jié)果

    2.3.2 未免疫散養(yǎng)戶(hù)血清抗體

    4 個(gè)未免疫散養(yǎng)戶(hù)血清抗體陽(yáng)性率分別為10%、5%、31%、10%,抗體總陽(yáng)性率為12%(表4),存在一定的野毒感染風(fēng)險(xiǎn)。

    表4 未免疫散養(yǎng)戶(hù)血清抗體檢測(cè)結(jié)果

    3 討論與結(jié)論

    3.1 討論

    從檢測(cè)結(jié)果可以看出,3 個(gè)免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體陽(yáng)性率分別為100%、45%、50%,抗體總陽(yáng)性率為68%,按照藍(lán)耳病抗體水平陽(yáng)性率大于80%為全體免疫合格[9],僅有1個(gè)場(chǎng)達(dá)到理想保護(hù)狀態(tài),其余2場(chǎng)均未達(dá)到理想保護(hù)??赡苁怯捎冢海?)免疫接種不規(guī)范,比如免疫程序不合理、疫苗注射部位或注射方式不科學(xué)、注射劑量不準(zhǔn)等;(2)疫苗質(zhì)量存在問(wèn)題,例如疫苗存貯、運(yùn)輸條件不合理、操作不規(guī)范、疫苗污染等情況;(3)飼養(yǎng)管理不當(dāng),豬生長(zhǎng)環(huán)境差、飼料和飲水不潔凈等;(4)其他免疫抑制病的存在,豬如果感染了豬瘟、豬圓環(huán)病毒病等免疫抑制類(lèi)疾病,在注射疫苗后,豬體不產(chǎn)生免疫應(yīng)答,造成免疫失敗[10]。因本研究所用的抗體檢測(cè)試劑盒暫不能區(qū)分所檢測(cè)抗體為感染抗體還是免疫抗體,散養(yǎng)戶(hù)血清抗體陽(yáng)性可能為野毒感染,也可能是母源抗體、購(gòu)入已免疫仔豬等多種因素引起的[11]。未免疫規(guī)模場(chǎng)血清抗體陽(yáng)性率均為0,提示未免疫規(guī)模場(chǎng)通過(guò)生物安全防控和檢測(cè)凈化可以達(dá)到理想效果。

    動(dòng)物疫病凈化是一項(xiàng)復(fù)雜的工作,需要合理制定區(qū)域凈化方案,構(gòu)建嚴(yán)密的檢測(cè)系統(tǒng)及嚴(yán)格的監(jiān)督系統(tǒng)[12]。目前PRRS 已經(jīng)退出了國(guó)家強(qiáng)制免疫計(jì)劃,但按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 《2020 年國(guó)家動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》要求,應(yīng)每半年開(kāi)展一次病原學(xué)和血清學(xué)監(jiān)測(cè),對(duì)疑似患PRRS 豬的肺和流產(chǎn)胎兒胎衣進(jìn)行病毒RNA 的提取,通過(guò)RTPCR 擴(kuò)增,選取陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物并進(jìn)行克隆、測(cè)序,與PRRSV代表毒株的序列進(jìn)行比較[13-14],對(duì)未免疫豬場(chǎng)抗體陽(yáng)性豬和免疫豬場(chǎng)病原鑒定陽(yáng)性豬均應(yīng)進(jìn)行淘汰,同時(shí)制定科學(xué)、合理的監(jiān)測(cè)計(jì)劃,按照完善的疫病凈化方案,并不斷對(duì)陽(yáng)性豬只進(jìn)行排查、淘汰,以期達(dá)到有效控制和逐步凈化疫病的目的[15]。

    3.2 結(jié)論

    本研究采用間接ELISA 法對(duì)海南省18 個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)(戶(hù))豬藍(lán)耳病抗體進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),由于多方面原因,免疫規(guī)模場(chǎng)免疫效果不理想,未免疫規(guī)模場(chǎng)通過(guò)生物安全防控和檢測(cè)凈化免疫效果較好,未免疫散養(yǎng)戶(hù)存在野毒感染的風(fēng)險(xiǎn),為豬藍(lán)耳病疫病的科學(xué)防控提供了參考依據(jù)。

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