葉片疊加導(dǎo)致熒光產(chǎn)量增加的原因分析

黃語琦

研究背景

葉綠素色素分子未激發(fā)時(shí)處于能量的最低狀態(tài)——基態(tài)。色素分子吸收1個(gè)光子后，會(huì)引起原子結(jié)構(gòu)內(nèi)電子的重新排列。其中一個(gè)低能的電子獲得能量后就可克服原子核正電荷對其的吸引力而被推進(jìn)到高能的激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)的葉綠素分子回至基態(tài)時(shí)，能夠以光子形式釋放能量。處在激發(fā)態(tài)（第一單線態(tài)）的葉綠素分子回至基態(tài)時(shí)發(fā)出的光稱為熒光（fluorescence）。葉綠素?zé)晒馐茄芯抗夂献饔霉夥磻?yīng)中光能吸收、捕獲、利用和分配極為重要的工具。其在抗逆研究、品種評(píng)價(jià)和篩選、環(huán)境評(píng)價(jià)等方面起著重要作用。

近期，有臺(tái)灣學(xué)者認(rèn)為目前對于葉綠素?zé)晒獾臏y定和分析方法忽略了葉片的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，這種方法存在一定缺陷。他們認(rèn)為他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了激發(fā)光能夠到達(dá)第2層葉片，并以弱光的形式激發(fā)下層葉片的熒光。而且，他們還初步證明J-I這一段熒光產(chǎn)量的增加很可能與深層細(xì)胞激發(fā)的熒光有關(guān)。

研究過程

葉片疊加后熒光產(chǎn)量的增加是否完全由第2個(gè)葉片受激發(fā)而產(chǎn)生？熒光產(chǎn)量增加的原因究竟是什么？此外，激發(fā)光強(qiáng)度是否影響對熒光結(jié)果的分析？本實(shí)驗(yàn)對以上問題進(jìn)行了探究，用葉片疊加的方法進(jìn)行熒光產(chǎn)量的測定，目的是驗(yàn)證臺(tái)灣學(xué)者葉片疊加方法的可行性與效果，并提出改進(jìn)思路，探究熒光產(chǎn)量增加的可能原因。

葉片疊加后熒光產(chǎn)量增加的驗(yàn)證

本次實(shí)驗(yàn)選擇了成熟新鮮的元寶楓葉片作為實(shí)驗(yàn)材料（見圖1）。設(shè)定激發(fā)光光強(qiáng)梯度為由弱光到強(qiáng)光200～3 000umol ms，每200umol ms一個(gè)激發(fā)光梯度。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可觀察到，葉片疊加的確可以導(dǎo)致測得的Fn、FJ、F1、FP熒光產(chǎn)量均增加；激發(fā)光較弱時(shí)增加幅度小，伴隨激發(fā)光的增強(qiáng)，各特征點(diǎn)熒光產(chǎn)量也迅速增加。與之前臺(tái)灣學(xué)者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

激發(fā)光穿透葉片后的強(qiáng)度測定

為了研究葉片疊加后熒光產(chǎn)量的增加是否與第2層葉片中葉綠素的激發(fā)有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)測量了激發(fā)光在透過第1層葉片且被其中葉綠素吸收后的強(qiáng)度。光強(qiáng)使用光量子計(jì)測定。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)看出，激發(fā)光在穿過第1層葉片被其中葉綠素吸收后，光強(qiáng)大大減弱，比本實(shí)驗(yàn)中最低激發(fā)光200 umolm s還要小。因此透射光激發(fā)的第2層葉片的熒光對熒光產(chǎn)量貢獻(xiàn)很小。

平面鏡模擬葉片對熒光反射的研究

倘若穿過第1層葉片后的激發(fā)光強(qiáng)度不足以激發(fā)第2層葉片，那么葉片疊加后熒光產(chǎn)量增加的原因是什么？我推測，這可能與葉片上表面的蠟質(zhì)對熒光的反射作用有關(guān)。葉片的角質(zhì)層常分2層，其中細(xì)胞壁外面是一層較薄的、由角質(zhì)或角質(zhì)與蠟質(zhì)混合組成的角質(zhì)層。

蠟質(zhì)的存在導(dǎo)致了上層葉片被激發(fā)光激發(fā)的熒光向四面?zhèn)鬟f，一部分到達(dá)下層葉片被下層葉表面的蠟質(zhì)反射上去。最終被葉片上方的熒光探頭接收到，導(dǎo)致了測得的熒光產(chǎn)量增加，見圖2。

為了繼續(xù)研究葉片疊加后熒光產(chǎn)量增加的原因，驗(yàn)證下層葉片的反射是否會(huì)導(dǎo)致測得的熒光產(chǎn)量增加，實(shí)驗(yàn)中選用了平面鏡作為實(shí)驗(yàn)材料。平面鏡對熒光有很好的反射作用，且不會(huì)產(chǎn)生新的熒光，可以用來替代下層葉片研究熒光的反射。

實(shí)驗(yàn)材料分成3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為單層葉片、單層葉片疊加平面鏡、雙層葉片疊加。測量單層葉片疊加平面鏡時(shí)，將平面鏡疊加在元寶楓葉片的下層，和疊加2層葉片的方法相同，用葉綠素?zé)晒鉁y試儀在葉片上方測量熒光產(chǎn)量。

實(shí)驗(yàn)測得單層、單層疊加葉片、雙層3組的O、J、I、P 4個(gè)熒光特征點(diǎn)的熒光產(chǎn)量，其中F0實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。將疊加葉片與疊加平面鏡后熒光產(chǎn)量的增長率相減，能大致得出排除葉表反射后，第2層葉片真實(shí)激發(fā)的熒光比例。

由數(shù)據(jù)可以看出，在葉片下層疊加平面鏡后的確使測得的熒光產(chǎn)量增加了。這證明反射作用能使熒光產(chǎn)量增加。這一部分熒光產(chǎn)量的增加是來自于葉表面的蠟質(zhì)/角質(zhì)層的反射所致。

我們的結(jié)果也證明2層葉片疊加的熒光產(chǎn)量大于1層葉片疊加平面鏡的熒光產(chǎn)量。單獨(dú)疊加平面鏡，各特征點(diǎn)F0、FI、FJ、FP熒光產(chǎn)量增加均在10%以下，疊加葉片熒光產(chǎn)量的增加則在20%左右。說明葉片疊加條件下熒光產(chǎn)量的增加與第2層葉片葉表的熒光反射和葉綠素的激發(fā)均有關(guān)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中疊加葉片與疊加平面鏡后熒光產(chǎn)量的增長率差，能大致得出排除葉表反射后，第2層葉片真實(shí)激發(fā)的熒光比例，各激發(fā)光強(qiáng)下，各特征點(diǎn)F0、FI、FJ、FP平均值約為6.98%、11.26%、9.49%和7.78%。增加比例約為10%。

結(jié)論

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們證明了：

疊加后增加的熒光產(chǎn)量一部分來自于第2層葉表對第1層葉片激發(fā)熒光的反射，還有一部分來自于第2層葉片自身的激發(fā)。

在200～3000umolm s激發(fā)光強(qiáng)下，隨激發(fā)光強(qiáng)的增加，熒光產(chǎn)量增長幅度逐漸增大，增長率保持在20%。葉表面反射與第2層葉片的激發(fā)分別占熒光產(chǎn)量的10%左右。

臺(tái)灣學(xué)者的葉片疊加實(shí)驗(yàn)存在一些問題，即沒有考慮葉表面（蠟質(zhì)）對熒光的反射。因此他得出的結(jié)果尚不夠完善。

本次實(shí)驗(yàn)證明了葉片結(jié)構(gòu)尤其是細(xì)胞層數(shù)、葉表蠟質(zhì)對葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量存在的影響。因此日后在運(yùn)用葉綠素?zé)晒獾臄?shù)學(xué)模擬方法分析不同種類葉片淺表的光能吸收、捕獲和分配，以研究葉片的光合作用時(shí)，需得考慮葉片結(jié)構(gòu)的不同點(diǎn)，如葉片厚度、細(xì)胞層數(shù)、葉表蠟質(zhì)厚度等。

展望

本次實(shí)驗(yàn)分析探究了葉片疊加后熒光產(chǎn)量增加的原因，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)可以繼續(xù)研究葉面反射、下層葉片細(xì)胞乃至深層細(xì)胞激發(fā)占增加熒光產(chǎn)量的精確比例，也可以選擇不同葉片厚度、不同葉表蠟質(zhì)厚度的葉片進(jìn)一步證明葉片結(jié)構(gòu)對熒光產(chǎn)量的影響。

本次實(shí)驗(yàn)可以推動(dòng)熒光理論的發(fā)展，應(yīng)用到對熒光測定和分析技術(shù)的完善，以及對熒光儀的改進(jìn)之中，為植物光合作用和抗逆研究提供重要實(shí)驗(yàn)支持。