環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在天然產(chǎn)物糖基化修飾中的應(yīng)用

張國寧 馮婧嫻 楊穎博 陳萬生，3 肖瑩

（1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所中藥資源與生物技術(shù)中心，上海 201203；2. 上海圖鋒醫(yī)藥科技有限公司，上海 201203；3. 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院醫(yī)療保障中心，上海 200003）

環(huán)糊精（CDs）是一種具有親水外部和疏水中心腔的環(huán)狀低聚糖，由6-100個左右的葡萄糖單元組成，由于環(huán)糊精分子具有獨(dú)特的疏水空腔結(jié)構(gòu)，能包含疏水性客體分子，從而改變客體分子的溶解度、穩(wěn)定性等物理化學(xué)性質(zhì)，因此在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品、紡織、環(huán)保、化妝品、生物技術(shù)和分析化學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用［1-2］，而可催化淀粉或多糖中α-1, 4鍵斷裂并環(huán)化形成CDs的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn) 移 酶（cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase，EC 2.4.1.19）受到廣泛關(guān)注。CGTase可以催化4種不同的反應(yīng)類型，包括環(huán)化反應(yīng)、耦合反應(yīng)、歧化反應(yīng)和水解反應(yīng)。其中CGTase特有的環(huán)化反應(yīng)主要應(yīng)用于環(huán)糊精的制備［3］，而利用歧化反應(yīng)和偶合反應(yīng)的轉(zhuǎn)糖基作用改造天然產(chǎn)物的性質(zhì)的研究近年來顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。本文結(jié)合CGTase的來源、蛋白結(jié)構(gòu)及功能等，重點(diǎn)對近年來CGTase在天然產(chǎn)物糖基化修飾中的應(yīng)用進(jìn)行綜述及展望。

1 CGTase的來源

大多數(shù)CGTase是一種細(xì)菌胞外酶，自從第一個CGTase基因在浸麻芽孢桿菌（Bacillus macerans）中被鑒定［4］，到目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種細(xì)菌來源的CGTase，包括芽孢桿菌（Bacillus）、類芽孢桿菌（Paenibacillus）、克雷伯氏菌（Klebsiella）、熱厭氧菌（Thermoanaerobacterium）、 短 桿 菌（Bacillus brevis）和放線菌（Actinomycetes）［5-6］等。古菌和真菌也能產(chǎn)生CGTase［7-8］。產(chǎn)生CGTase的微生物主要存在于湖水、土壤、溫泉、面粉業(yè)廢水和腐爛的土豆中［9］，特殊環(huán)境可以篩選具有特殊性能的CGTase，如從溫泉環(huán)境中分離出產(chǎn)熱穩(wěn)定CGTase的極熱厭氧古生菌菌株B1001［10］，極大地拓展了CGTase的應(yīng)用范圍。

2 CGTase蛋白結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制

2.1 CGTase蛋白結(jié)構(gòu)

CGTase屬于α-淀粉酶家族，隸屬于糖基水解酶13家族，具有（α/β）8桶狀蛋白結(jié)構(gòu)［11］。1991年首個來自于環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）的CGTase晶體結(jié)構(gòu)被報道［12］，為CGTase蛋白結(jié)構(gòu)解析奠定了基礎(chǔ)。目前已經(jīng)有許多CGTase結(jié)構(gòu)被報道，它們結(jié)構(gòu)均非常相似，都包含5個結(jié)構(gòu)域：A、B、C、D和E。與α-淀粉酶家族的結(jié)構(gòu)域（A、B和C）相比，CGTase包含兩個額外的D域和E域［13］（圖1）。結(jié)構(gòu)域A包含8條α-螺旋和8條平行的β-折疊氨基酸，稱為（α/β）8桶狀催化域［14］，被認(rèn)為是催化核心區(qū)域［4］，關(guān)鍵催化殘基位于β鏈的c端。結(jié)構(gòu)域B是結(jié)構(gòu)域aβ-strand 3和α-helix3之間的突起環(huán)，將 A 域分成 A1和 A2域［15］（圖 1），B 域包含 44-133個氨基酸殘基，在底物結(jié)合中起重要作用［4］。Leemhuis等［16］在B域表面引入新的鹽橋顯著提高了圓環(huán)桿菌251 CGTase的穩(wěn)定性。C域有1個麥芽糖結(jié)合位點(diǎn)，參與底物結(jié)合［4］。E域被認(rèn)為是一個原始的淀粉結(jié)合域［4］，有2個麥芽糖結(jié)合位點(diǎn)（MBS），分別負(fù)責(zé)淀粉結(jié)合（MBS1）和引導(dǎo)底物進(jìn)入活性位點(diǎn)（MBS2），有文獻(xiàn)報道E域上MBS2受損（Tyr633Ala）會導(dǎo)致產(chǎn)物的非競爭性抑制顯著降低［17］。結(jié)構(gòu)域D的功能尚不明確，但有研究表明C和D域與E域的正確空間定位有關(guān)［18］。此外最近關(guān)于CGTase抗病研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)域D是CGTase水解活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域A1和C是CGTase誘導(dǎo)植物抗病的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域［19］。

圖1 CGTase蛋白結(jié)構(gòu)（PDB登錄碼：4JCL）Fig. 1 CGTase protein structure（PDB accession number：4JCL）

目前關(guān)于CGTase的結(jié)構(gòu)改造研究主要聚焦于環(huán)糊精和L-抗壞血酸（AA）糖基化產(chǎn)物2-O-葡萄糖基-L-抗壞血酸（AA-2G）的定向合成制備。Li等［20］將環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）STB01的CGTase的鈣結(jié)合位點(diǎn)III（CaIII）氨基酸殘基Asp 577進(jìn)行定點(diǎn)突變提高了其對麥芽糖糊精的親和力和環(huán)化反應(yīng)的催化效率；同時研究較多的還有通過定點(diǎn)突變增加 CGTase對 α-環(huán)糊精［21］、β-環(huán)糊精［22］、γ-環(huán)糊精［23］的產(chǎn)物專屬性。Tao 等［24］對Bacillus stearothermophilus NO2的CGTase的9個殘基進(jìn)行迭代飽和誘變，增強(qiáng)了合成AA-2G的特異性，是迄今為止高產(chǎn)AA-2G的最優(yōu)策略；Han等［25］對Paenibacillus macerans的CGTase的6個亞位殘基（Y167，G179，G180和N193）進(jìn)行了迭代飽和誘變，通過提高CGTase對麥芽糖糊精的特異性，提升了AA-2G的產(chǎn)量。

2.2 CGTase的催化機(jī)制

CGTase主要催化4種反應(yīng)類型，包括3種轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)（歧化反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)和偶合反應(yīng)）及水解反應(yīng)。環(huán)化反應(yīng)是CGTase的特征反應(yīng)，是一種分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，原理是將直鏈麥芽低聚糖上非還原末端的O-4或C-4轉(zhuǎn)移到同一直鏈上還原末端的C-1或O-1上（圖2-A），形成6-8個糖基的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分別對應(yīng)α-、β-和γ-環(huán)糊精；偶合反應(yīng)是環(huán)化反應(yīng)的逆反應(yīng)，可以將環(huán)糊精的環(huán)打開，然后轉(zhuǎn)移到直鏈麥芽低聚糖上（圖2-B）；歧化反應(yīng)是先把一個直鏈麥芽低聚糖切斷，然后將其中一段轉(zhuǎn)移到另外的直鏈?zhǔn)荏w上（圖2-C）［9］。與天然產(chǎn)物的糖基化相關(guān)的主要是偶合反應(yīng)和歧化反應(yīng)，兩者均為分子間轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，例如通過CGTase將AA糖基化合成AA-2G。水解反應(yīng)則是將直鏈淀粉分子切斷，然后兩段均轉(zhuǎn)移到水分子上（圖2-D），有報道利用CGTase水解真菌細(xì)胞壁β-1, 4糖苷鍵（幾丁質(zhì)）的功能，增強(qiáng)了棉花植物抵御真菌大麗輪枝菌導(dǎo)致的黃萎病的抗病能力［19］。需要指出的是，在以CGTase為催化酶進(jìn)行糖基化反應(yīng)的過程中，若以直鏈麥芽糖為糖供體，轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)主要是以歧化反應(yīng)為主［25-26］，若以環(huán)糊精為糖供體時，轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)以歧化反應(yīng)和偶合反應(yīng)為主［26］，而水解反應(yīng)微弱，在反應(yīng)前期或后期均會發(fā)生。

圖2 CGTase催化4種反應(yīng)類型Fig. 2 CGTase catalyzes four types of reactions

α-淀粉酶轉(zhuǎn)糖苷化催化機(jī)理于1953年由美國科學(xué)家Koshland首次提出［27］，稱為雙取代機(jī)制。α-淀粉酶家族中的CGTase有7個最保守的氨基酸殘基聚集在（α/β）8桶狀蛋白結(jié)構(gòu)表面底物結(jié)合口袋的底部，位于催化位點(diǎn)的中心［27］，其中Asp229、Glu257和Asp328是絕對保守的3個關(guān)鍵氨基酸殘基。在雙取代反應(yīng)中，Glu257是質(zhì)子供體，Asp229是一般的堿基或親核試劑，而Asp328參與底物結(jié)合，可能對Glu257的pKa升高有重要作用［28］。具體催化過程如圖3所示：第一步，由Glu257提供質(zhì)子，CGTase在底物淀粉上裂解一個α-1, 4糖苷鍵，并與Asp229形成一個共價的β-1, 4糖基酶中間體；第二步，中間體的共價鍵裂解，受體被Glu257所激活，隨后攻擊共價連接的中間產(chǎn)物α-1, 4糖苷鍵并形成新的產(chǎn)物［29］。受體可以是水、另一個糖基的4-OH基團(tuán)（4位的羥基）或其它化合物的羥基基團(tuán)。此外，CGTase的環(huán)化反應(yīng)除了與轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)原理相似外，還有其它的氨基酸殘基參與了中間產(chǎn)物的環(huán)化，使得其還原末端與非還原末端的4-OH基團(tuán)形成共價鍵而形成環(huán)糊精。

圖3 CGTase催化機(jī)制示意圖Fig. 3 Schematic diagram of the catalytic mechanism of CGTase

3 CGTase在天然產(chǎn)物糖基化修飾中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)糖基化是將糖基從供體轉(zhuǎn)移到受體的過程。與化學(xué)合成相比，通過酶促反應(yīng)進(jìn)行糖基化修飾具有反應(yīng)步驟簡單、空間位阻低、區(qū)域?qū)Ｒ恍愿?、副產(chǎn)物少、后處理簡單、生產(chǎn)成本低、反應(yīng)條件溫和及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)［9］。通過CGTase的轉(zhuǎn)糖基功能催化天然產(chǎn)物底物合成糖基化產(chǎn)物，可有效改善天然產(chǎn)物的原有性質(zhì)，包括提高水溶性、增強(qiáng)生物活性、改善口感、提高穩(wěn)定性等（圖4），目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化妝品等各個領(lǐng)域，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

圖4 CGTase的應(yīng)用Fig. 4 Application of CGTase［19］

3.1 提高天然產(chǎn)物溶解度

溶解度是化合物的重要化學(xué)特性，許多具有應(yīng)用價值的化合物因溶解度低而嚴(yán)重限制了其應(yīng)用。糖基化是增加化合物溶解度的重要方法，使用CGTase進(jìn)行糖基化修飾以改變化合物溶解度相關(guān)研究已有較多報道。如黃酮類化合物山奈酚-3-o-β-d-吡喃葡萄糖（astragalin，AS）具有抗氧化、抗腫瘤、抗人類免疫缺陷病毒（HIV）等生物活性，但因水溶性低限制了其應(yīng)用。Choung等［30］使用CGTase（Toruzyme）進(jìn)行糖基化修飾，糖苷產(chǎn)物G1-AS的溶解度提高了65倍；同理，白藜蘆醇具有抗炎、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等生物活性，也因溶解度低影響其生物利用度，Marié等［31］使用來自于Thermoanaerobacter sp.的CGTase催化白藜蘆醇，其糖苷產(chǎn)物在水中的溶解度提高了65倍。表1列舉了近年來利用CGTase糖基化修飾提高天然產(chǎn)物溶解度的應(yīng)用實(shí)例。

表1 CGTase糖基化修飾提高天然產(chǎn)物溶解度的應(yīng)用Table 1 Application of CGTase glycosylation modification to improve the solubility of natural products

3.2 改善或增強(qiáng)天然產(chǎn)物生物活性

許多天然化合物本身具有生物活性，其糖基化產(chǎn)物可以進(jìn)一步增強(qiáng)或者改善生物活性，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。Huang等［41］使用地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CGTase為催化劑，以α-環(huán)糊精為糖供體催化PU，其糖苷（PU-G）比PU具有更強(qiáng)的抗骨質(zhì)疏松活性；Choung等［30］以麥芽糖為供糖體，山奈酚-3-o-β-d-吡喃葡萄糖（AS）為受體，糖苷產(chǎn)物G1-AS抗炎活性與醛糖還原酶抑制活性顯著增強(qiáng)；表2列舉了使用CGTase糖基化修飾以增強(qiáng)或改善天然產(chǎn)物生物活性的相關(guān)應(yīng)用。

表2 CGTase糖基化修飾增強(qiáng)或改善天然產(chǎn)物生物活性的應(yīng)用Table 2 Application of CGTase glycosylation modification to improve the bioactivity of natural products

3.3 改善化合物口感

口感是天然產(chǎn)物在食品及醫(yī)藥應(yīng)用中一項(xiàng)重要的評價指標(biāo)，糖基化可以有效改善某些天然產(chǎn)物的苦味。甜菊糖苷是從菊科植物甜葉菊Stevia Rebaudia的葉子中提取出來的一種糖苷，甜度為蔗糖的250-450倍，被譽(yù)為“世界第三糖源”，但是帶有一定程度的苦味［56］。Abelian等［57］使用來自于嗜溫（mesophilic）、嗜熱（alkaliphilic）、嗜堿（thermophilic）和嗜鹽（halophilic）桿菌的CGTase對甜菊糖苷進(jìn)行糖基化修飾，顯著降低了其苦味。Yu等［58］從甜菊種植土壤中分離到一株產(chǎn)CGTase的芽孢桿菌（Paenibacillus sp. cgmcc5316），以淀粉為糖基供體，將甜菊糖苷轉(zhuǎn)化為單糖基化甜菊糖苷，甜味提高了35.4%。Kim等［59］使用來源于B.stearothermophilus、B.macerans的CGTase催化人參皂苷Rb1、Rc、Re、Rg1，以糊精為供糖體，產(chǎn)物苦味明顯降低。表3列舉了使用CGTase糖基化修飾以改善天然產(chǎn)物口感的相關(guān)應(yīng)用。

表3 CGTase糖基化修飾改善天然產(chǎn)物口感的應(yīng)用Table 3 Application of CGTase glycosylation modification to improve the taste of natural products

3.4 其他

CGTase糖基化修飾除了提高天然產(chǎn)物的水溶性、增強(qiáng)生物活性、改善口感外，還具有其它多種應(yīng)用，包括提高穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)粘度、降低毒性等，也可同時具有多方面的應(yīng)用。例如：L-抗壞血酸（維生素C）不穩(wěn)定，容易被氧化，在實(shí)際生產(chǎn)中可利用CGTase的轉(zhuǎn)糖基活性，將葡萄糖基連接在L-抗壞血酸的2號位C上，得到的維生素C衍生物AA-2G穩(wěn)定性顯著提高，水溶性和抗氧化活性增強(qiáng)，在人體內(nèi)可發(fā)揮L-抗壞血酸的多種生理功能［64-65］；使用來自于Thermoanaerobacter sp.的CGTase，以蔗糖為底物，淀粉為糖供體，合成的偶聯(lián)糖是一種非致齲甜味劑，也可用作粘度調(diào)節(jié)劑，且比其他還原糖混合物更穩(wěn)定［66］。此外，Moon等［67］以糊精為糖供體，使用來源于Thermoanaerobacter sp的CGTase催化人參皂苷F1，α-糖基化人參皂苷F1（G1-F1）顯示出比人參皂苷F1更高的溶解性、對人皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）更低的細(xì)胞毒性、更高的酪氨酸酶活性和紫外線誘導(dǎo)的對基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）的抑制活性。隨著越來越多的CGTase發(fā)現(xiàn)以及蛋白質(zhì)工程對酶的改造，CGTase的糖基化應(yīng)用將更加廣泛。

4 總結(jié)和展望

盡管目前已獲得多種不同來源的CGTase，但催化效率高、穩(wěn)定性好、專屬性強(qiáng)的新型CGTase仍有待發(fā)現(xiàn)，而基因組測序及生物信息學(xué)的進(jìn)步為新型CGTase的挖掘帶來了前所未有的機(jī)遇，CGTase的應(yīng)用范圍將隨之進(jìn)一步拓寬。當(dāng)前除了制備環(huán)糊精，CGTase工業(yè)化應(yīng)用主要集中在維生素C糖基化產(chǎn)物AA-2G的制備。通過蛋白質(zhì)工程的策略［68］對天然CGTase進(jìn)行改造，提高催化效率或?qū)μ腔w的特異選擇性等以提升AA-2G的產(chǎn)量是當(dāng)前研究的一個熱點(diǎn)，極大地推進(jìn)了該應(yīng)用的工業(yè)化進(jìn)程［24-25，69］并將持續(xù)得到關(guān)注。

利用CGTase對天然產(chǎn)物進(jìn)行糖基化修飾以提高穩(wěn)定性、增加生物活性、提高安全性等已取得較多研究成果，但是均僅限于實(shí)驗(yàn)室，與工業(yè)生產(chǎn)還有很大的距離。其重要原因之一是CGTase對特異底物和催化產(chǎn)物的選擇性均較低，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)底物轉(zhuǎn)化率低，目標(biāo)產(chǎn)物的精準(zhǔn)合成難以實(shí)現(xiàn)，副產(chǎn)物較多，生產(chǎn)成本較高。CGTase的底物雜泛性較高，單個CGTase可以同時催化幾種不同的底物，如來源于Thermoanaerobacter sp.的CGTase可以催化白藜蘆醇［31，51］、對苯二酚（HQ）［44］等 ；而多種不同來源的CGTase對某種底物也可能都具有催化活性［61，63］；但同時也存在不同來源的 CGTase催化天然產(chǎn)物的底物特異性差異巨大的情況。因此，解析清楚CGTase底物特異性的催化機(jī)制是實(shí)現(xiàn)以CGTase作為催化元件的天然產(chǎn)物定向改造，推進(jìn)其工業(yè)化進(jìn)程的首要任務(wù)。在此基礎(chǔ)上可以充分調(diào)用或設(shè)計(jì)CGTase實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的定向高效合成，將CGTase在天然產(chǎn)物糖基化修飾中的應(yīng)用推向深入和新高度。