白術多糖對嗜水氣單胞菌抑菌效果的影響

樊敏歡梁日深

(1.廣東科貿(mào)職業(yè)學院人文外語系,廣東廣州 510430; 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院,廣東廣州 510225)

白術多糖對嗜水氣單胞菌抑菌效果的影響

樊敏歡1梁日深2

(1.廣東科貿(mào)職業(yè)學院人文外語系,廣東廣州 510430; 2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院,廣東廣州 510225)

目前，由嗜水氣單胞菌引起的水產(chǎn)動物的疾病防治多采用抗生素，但抗生素的濫用造成了耐藥性的增強，給魚病的治療帶來困難。而白術多糖相對于抗生素具有天然、無殘留、毒副作用小、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點。本試驗通過對白術多糖進行分離純化，配制成不同濃度梯度的白術多糖溶液，研究其抑菌最小有效濃度。為白術多糖在水產(chǎn)健康養(yǎng)殖的開發(fā)和利用上提供依據(jù)。

白術多糖 嗜水氣單胞菌 雜交鱧魚 藥代動力學 有效濃度

1 前言

雜交鱧容易因感染嗜水氣單胞菌而引發(fā)腐皮病。病魚多呈現(xiàn)潰爛病癥，體表潰爛、出血，出現(xiàn)爛身、爛尾現(xiàn)象，解剖可見肝臟等遭受損害。該病一年四季均可流行，病程較長且死亡率高。然而國內(nèi)外目前對雜交鱧潰爛病病原的分析這方面還存在很大的空白。本實驗從雜交鱧病魚身上分離疑似菌株進行鑒定，并對其不同濃度中藥白術多糖的敏感性等進行分析，旨在為雜交鱧養(yǎng)殖過程中的疾病防治提供參考。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2.1.1 試驗樣品

實驗病魚樣品采自佛山市順德區(qū)一養(yǎng)殖場所養(yǎng)殖的患病雜交鱧，病魚體表部分潰爛，出血，腹部腫脹；解剖觀察發(fā)現(xiàn)肝臟、腎臟紅腫、部分糜爛、膽囊腫大，腹腔有血紅腹水。

2.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、細菌生理生化鑒定管、藥敏試紙測試盒白術多糖溶液

2.2 實驗方法

2.2.1 病魚體表及內(nèi)部病理學觀察

佛山某養(yǎng)殖場部分雜交鱧體表出現(xiàn)爛身、爛尾、出血以及腹部腫脹等病理癥狀，剖開腹部可觀察到病魚腸道及肝臟等器官呈充血現(xiàn)象；病魚大多精神沉郁，食欲不振，甚至死亡。

2.2.2 不同濃度白術多糖原液配制

準確稱取80% 白術多糖12.5mg，溶于10ml胚胎水中，充分混勻，0.22μm過濾器過濾滅菌，配制成1mg/ml的白術多糖原液。然后稀釋成不同濃度梯度溶液，分別為：10 μg/ml、50μg/ ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、350μg/ml、400μg/ml、450μg/ml、500μg/ml、550μg/ml、600μg/ml、650μg/ml、700μg/ml、750μg/ml、800μg/ml、850μg/ml、900μg/ml、950μg/ml、1mg/ml等21個濃度梯度。

2.2.3 疑似菌株的分離培養(yǎng)

（1）分離菌株：

從患有潰爛病的雜交鱧病灶中分離出疑似菌株，在超凈工作臺無菌操作條件下，從病魚肝臟、腎臟、脾臟3個部位取樣，在酒精燈旁邊用滅菌剪刀剪開器官組織，灼燒滅菌的接種環(huán)伸入病料中蘸上少量病料，于固體平板中進行3區(qū)劃線，平板倒置，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜（16～18h）。

（2）菌液分離培養(yǎng)：

在無菌操作條件下，挑取平板生長良好的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，輕微搖晃混勻，于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)過夜（16～18h），用于后續(xù)實驗。

2.2.4 生理生化鑒定

采用細菌生理生化鑒定管對待測菌株進行生理生化鑒定，將純化好的細菌分別進行以下幾項生理生化反應實驗：糖發(fā)酵實驗（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇）甲基紅實驗、VP實驗、靛基質(zhì)實驗、脲酶實驗、枸櫞酸鹽實驗、硫化氫實驗、甘露醇、山梨醇、氨基酸脫羧酶反應（賴氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、鳥氨酸），具體操作過程按相應的生化反應管操作步驟進行。

2.2.5 藥敏試驗

采用紙片瓊脂擴散（K-B）法[8]對待測菌株進行藥敏實驗檢測，測定其對不同濃度白術多糖溶液的敏感性，具體操作如下：

細菌涂布接種：在無菌操作條件下，吸取150μl菌液于固體培養(yǎng)平板中，利用涂布棒將平板上的菌液涂抹均勻，涂布完畢，室溫下置3～5min待瓊脂表面的菌液充分吸收。涂布棒在使用前和使用后都要燃燒滅菌。

貼藥敏紙片：用無菌鑷子夾取藥物紙片平貼在種好細菌的瓊脂表面，每個平板貼3種藥物紙片。

培養(yǎng)：貼好藥物紙片的平板應于室溫下放置15min，然后翻轉(zhuǎn)平板，放37℃培養(yǎng)18～24h之后觀察結(jié)果。

結(jié)果記錄：用直尺從背面精確測量包括紙片直徑在內(nèi)的抑菌環(huán)直徑，測得結(jié)果以毫米為單位進行記錄。

3 結(jié)果與分析

3.1 致病菌的形態(tài)觀察

分離菌株在普通營養(yǎng)瓊脂中生長良好，菌落邊緣整齊、光滑，微隆起，半透明，顏色乳白色或淡黃色，菌落大小與培養(yǎng)時間以及溫度有關，最大可達4mm。

3.2 細菌生理生化鑒定結(jié)果

菌株生理生化鑒定結(jié)果如下表[11-13]，其中“+”表示反應陽性，“-”表示反應陰性。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》及相關研究資料，初步判斷該菌株為嗜水氣單胞菌。

表1 生理生化鑒定

3.3 藥敏實驗結(jié)果

藥敏實驗中經(jīng)過37℃培養(yǎng)24h后，不同抗生素藥敏紙片呈現(xiàn)出不同的抑菌效果，出現(xiàn)有或無，大小不定的抑菌圈，部分藥敏實驗結(jié)果如下圖。測量各藥敏紙片抑菌環(huán)直徑大小，其中18mm以上為高度敏感，13～18mm為中度敏感，13 mm以下為耐藥。

表2 藥敏實驗

4 討論

本研究中的藥敏實驗結(jié)果可為雜交鱧潰爛病防治用藥提供參考。結(jié)果可見雜交鱧體內(nèi)嗜水氣單胞菌對不同濃度梯度白術多糖的敏感性。在22個不同梯度的溶液中，嗜水氣單胞菌對1m/ml、950μg/ml、900μg/ml、850μg/ml、800μg/ml、750μg/ ml、700μg/ml、650μg/ml濃度白術多糖表現(xiàn)為高度敏感，對0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ ml、250μg/ml、300μg/ml等濃度白術多糖表現(xiàn)為耐藥。其中對450μg/ml濃度白術多糖表現(xiàn)出耐藥性可能由于實驗操作過程中試紙污染的情況導致的。由此試驗可得，白術多糖對嗜水氣單胞菌的最小抑菌濃度為：350μg/ml。

[1] 陳霞.鯉魚腹水癥的病源學與病理學研究[D].四川農(nóng)業(yè)大學，2006.

[2] 劉明智.嗜水氣單胞菌鑒定、重組外膜蛋白W的制備及免疫原性研究[D].上海海洋大學，2010.