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    CD8+T細(xì)胞對(duì)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞的殺傷機(jī)制

    2017-06-15 14:50:28馬錦媛楊鈺琪李舒麗郭偉楠安亞文高天文李春英
    中國麻風(fēng)皮膚病雜志 2017年6期
    關(guān)鍵詞:黑素細(xì)胞原代白癜風(fēng)

    馬錦媛 楊鈺琪 李舒麗 郭偉楠 宋 璞 安亞文 高天文 李春英

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    ·論著·

    CD8+T細(xì)胞對(duì)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞的殺傷機(jī)制

    馬錦媛 楊鈺琪 李舒麗 郭偉楠 宋 璞 安亞文 高天文 李春英

    目的: 明確CD8+T細(xì)胞對(duì)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞的殺傷機(jī)制。方法: 分選白癜風(fēng)患者及正常人外周血CD8+T細(xì)胞,分別與原代黑素細(xì)胞及永生化正常黑素細(xì)胞系PIG1及永生化白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系PIG3V建立共孵育殺傷模型,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)靶細(xì)胞被殺傷情況,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)殺傷環(huán)境中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B及穿孔素的分泌水平。結(jié)果: 白癜風(fēng)患者外周血CD8+T細(xì)胞殺傷原代黑素細(xì)胞及PIG3V能力,分泌IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素水平均高于健康對(duì)照,而殺傷PIG1能力和TNF-α水平并無顯著差異;白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞IFN-γ分泌水平與細(xì)胞殺傷率呈明顯正相關(guān)。結(jié)論: 白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞殺傷黑素細(xì)胞是白癜風(fēng)發(fā)病的重要機(jī)制,且該殺傷作用可能依賴IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素分泌水平的上調(diào)。

    白癜風(fēng); CD8+T細(xì)胞; 干擾素γ; 顆粒酶B; 穿孔素

    白癜風(fēng)是一種常見的由黑素細(xì)胞選擇性破壞導(dǎo)致的體表黑素減退性疾病,全球發(fā)病率近1%。目前白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制不清,有許多病因?qū)W理論,包括黑素細(xì)胞自身破壞學(xué)說、生化學(xué)說、神經(jīng)起源學(xué)說、自身免疫學(xué)說、遺傳學(xué)說等[1,2]。CD8+T細(xì)胞殺傷作用被認(rèn)為是白癜風(fēng)發(fā)病的重要機(jī)制之一,但具體機(jī)制仍不清。本文通過測(cè)定白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞對(duì)正常人表皮黑素細(xì)胞及永生化黑素細(xì)胞系殺傷作用及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)量,進(jìn)一步探討CD8+T細(xì)胞誘發(fā)白癜風(fēng)的相關(guān)機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 細(xì)胞(細(xì)胞系)及組織來源 原代黑素細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科提供,取自8~22歲健康青年男性包皮術(shù)后組織(共8例);PIGI細(xì)胞系(人表皮永生化黑素細(xì)胞系)及PIG3V細(xì)胞系(白癜風(fēng)表皮永生化黑素細(xì)胞系)由美國芝加哥大學(xué)Le Poole教授惠贈(zèng);白癜風(fēng)患者血液樣本取自西京皮膚醫(yī)院進(jìn)展期白癜風(fēng)患者外周血(共8例),對(duì)照組血液樣本取自西京皮膚醫(yī)院健康志愿者外周血(共8名)。

    1.2 培養(yǎng)基、試劑及主要儀器 254培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司,人黑素細(xì)胞生長添加劑購于美國Cascade Biologics公司,0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液購于美國Sigma公司,H2O2原液購于日本TAKARA公司,鼠抗人CD8單克隆抗體購于美國Abcam公司,PerCP-Cy5.5-抗人CD8流式抗體購于美國eBioscience公司,碘化丙啶染色液(PI)購于碧云天生物技術(shù)有限公司,人IFN-γ、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒購于美國RD公司,人顆粒酶B ELISA及穿孔素ELISA檢測(cè)試劑盒購于美國RD公司。流式細(xì)胞分選及分析儀購于美國BD公司,酶標(biāo)儀購自于美國BIO-RAD公司。

    1.3 殺傷環(huán)境的建立及殺傷細(xì)胞比率檢測(cè) 使用254無血清培養(yǎng)基配制0.75 mmol/L H2O2處理靶細(xì)胞(原代黑素細(xì)胞及PIG1、PIG3V細(xì)胞系)誘導(dǎo)發(fā)生抗原暴露,分別于離心管內(nèi)種植靶細(xì)胞1×105個(gè)細(xì)胞/管,并分別向各組管內(nèi)加入2×105個(gè)細(xì)胞/管對(duì)照組或白癜風(fēng)患者通過磁珠分選出的CD8+T細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞與原代黑素細(xì)胞、PIG1細(xì)胞及PIG3V細(xì)胞HLA分型適配),按2∶1的細(xì)胞數(shù)比例建立CD8+T細(xì)胞與黑素細(xì)胞(原代黑素細(xì)胞、PIG1細(xì)胞及PIG3V細(xì)胞)的殺傷體系;將各組離心管進(jìn)行800 rpm×5 min離心,使效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞緊密結(jié)合,37℃過夜孵育16 h,棄上清液,加入200 μL/管PBS重懸細(xì)胞,隨后加入PI并調(diào)整濃度至1 μg/mL,混勻震蕩,室溫避光染色15 min;1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

    1.4 ELISA檢測(cè)殺傷體系中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B及穿孔素含量 按照1.3步驟建立CD8+T細(xì)胞與PIG1、PIG3V細(xì)胞殺傷體系;采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法,試劑盒來源見1.2,操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.5 統(tǒng)計(jì)軟件及統(tǒng)計(jì)圖制作 所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行了三次獨(dú)立重復(fù)后統(tǒng)計(jì)分析,采用Graphpad Prism 5.0軟件,各組間均數(shù)比較采用雙向方差分析及studentt檢驗(yàn),用直線相關(guān)分析法處理指標(biāo)間的關(guān)系,P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CD8+T細(xì)胞殺傷黑素細(xì)胞比例 白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞對(duì)原代黑素細(xì)胞殺傷率均顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1a,P=0.003)。白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞殺傷對(duì)PIG3V細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯升高(P=0.0411),而在PIG1細(xì)胞中兩者無明顯差異(圖1b,P=0.1467);在對(duì)照組和白癜風(fēng)患者組中,CD8+T細(xì)胞對(duì)PIG3V細(xì)胞的殺傷作用明顯高于對(duì)PIG1的殺傷作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1b,P=0.025)。

    圖1 a.白癜風(fēng)患者及正常人群CD8+T細(xì)胞致原代黑素細(xì)胞死亡比例(n=8,**P<0.01);b.白癜風(fēng)患者及正常人群CD8+T細(xì)胞致PIG1、PIG3V細(xì)胞死亡比例(n=8,*P<0.05)

    2.2 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)殺傷體系中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B及穿孔素的分泌水平 白癜風(fēng)患者組CD8+T細(xì)胞殺傷PIG1及PIG3V細(xì)胞時(shí)IFN-γ分泌水平較對(duì)照組明顯升高(圖2a,PIG1組P=0.0119、PIG3V組P=0.0101),而TNF-α分泌水平并無明顯變化(PIG1組P=0.3089、PIG3V組P=0.4498)。白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞殺傷PIG1及PIG3V細(xì)胞時(shí)顆粒酶B的分泌水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.001),但在PIG1及PIG3V細(xì)胞間無明顯差異(圖2b)。白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞殺傷PIG1及PIG3V細(xì)胞時(shí)穿孔素分泌水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.001),且針對(duì)PIG3V細(xì)胞分泌的穿孔素水平明顯高于針對(duì)PIG1細(xì)胞的分泌水平(圖2c,P=0.0015)。

    圖2 白癜風(fēng)患者及正常人群CD8+T細(xì)胞與PIG1、PIG3V共孵育環(huán)境中IFN-γ (a,n=5,*P<0.05)、顆粒酶B(b,n=7,***P<0.001)及穿孔素(c,n=6,**P<0.01,***P<0.001)表達(dá)水平

    3 討論

    CD8+T細(xì)胞在多種自身免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮作用。有報(bào)道斑禿患者及銀屑病患者外周血中CD8+T細(xì)胞數(shù)量上升[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn),CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)殺傷黑素細(xì)胞是白癜風(fēng)重要的發(fā)病機(jī)制之一。有研究認(rèn)為白癜風(fēng)患者血液及皮損中均可出現(xiàn)抗黑素細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞,且數(shù)量與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。同時(shí),白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞能夠殺傷無皮損部位的黑素細(xì)胞[4],提示CD8+T細(xì)胞的殺傷作用與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。Zhang等[5]報(bào)道非節(jié)段型白癜風(fēng)患者活躍期表達(dá)皮膚歸巢CD8+T細(xì)胞中趨化因子受體CCR4表達(dá)水平明顯升高。Byrne等[6]研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)受累的小鼠CD8+T細(xì)胞可針對(duì)黑素細(xì)胞分化抗原TRP2反應(yīng)。本研究通過流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在原代黑素細(xì)胞及永生化細(xì)胞系中,白癜風(fēng)患者的CD8+T細(xì)胞均可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞殺傷增加,也進(jìn)一步證明了上述觀點(diǎn)。

    CD8+T細(xì)胞誘發(fā)白癜風(fēng)的分子機(jī)制方面,有研究認(rèn)為T細(xì)胞能夠通過胞內(nèi)聯(lián)接引導(dǎo)Fas配體(FasL)與靶細(xì)胞上凋亡相關(guān)的Fas分子結(jié)合,從而誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[7]。然而也有文獻(xiàn)報(bào)道在白癜風(fēng)患者中CD8+T細(xì)胞FasL含量并無明顯上升,提示FasL可能在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞死亡中沒有重要意義[8]。Lili等[9]通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定白癜風(fēng)患者CD3+T細(xì)胞中IFN-γ+CD8+T細(xì)胞、顆粒酶B+CD8+T細(xì)胞(GrB+CD8+T細(xì)胞)及穿孔素+CD8+T細(xì)胞(Perforin+CD8+T細(xì)胞)比例較正常人明顯升高。本研究建立的殺傷環(huán)境中,白癜風(fēng)患者組上清液的IFN-γ,顆粒酶B及穿孔素水平均有不同程度升高,也從另一角度證實(shí)白癜風(fēng)患者表達(dá)IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素的CD8+T細(xì)胞比例升高。同時(shí),在白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞參與的殺傷環(huán)境中,PIG3V細(xì)胞組上清中的穿孔素含量較PIG1細(xì)胞也明顯升高,說明白癜風(fēng)患者的黑素細(xì)胞可能存在某種機(jī)制誘導(dǎo)Perforin+CD8+T細(xì)胞增殖或促進(jìn)CD8+T細(xì)胞表達(dá)分泌穿孔素。Zhang等[5]通過實(shí)驗(yàn)也認(rèn)為白癜風(fēng)患者表皮內(nèi)可能存在某種抗原誘使CD8+T細(xì)胞增殖及歸巢,且這一現(xiàn)象中存在CCR4的參與,但具體發(fā)生機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

    [1] 張成,唐金,劉建蘭,等.單核苷酸多態(tài)性rs2236313與漢族人尋常型白癜風(fēng)臨床表型的相關(guān)性研究[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2011,27(7):451-454.

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    (收稿:2016-09-07 修回:2016-10-26)

    Mechanism of CD8+T cells killing melanocytes in the patients with vitiligo

    MAJinyuan,YANGYuqi,LIShuli,GUOWeinan,SONGPu,ANYawen,GAOTianwen,LIChunying.

    DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China

    LIChunying,E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

    Objective: To determine the killing mechanism of CD8+T cells to melanocytes in the patients with vitiligo. Methods: CD8+T cells were obtained from peripheral blood in 8 patients with vitiligo and 8 healthy controls. The primary melanocyte, immortalized normal melanocyte cell line PIG1 and immortalized vitiligo melanocyte cell line PIG3V were co-cultivated with selected CD8+T cells respectively. The number of the death of melanocytes killed by CD8+T cells was assessed by Flow cytometry. The expression levels of IFN-γ, TNF-α, granzyme B and perforin were measured by ELISA. Results: The number of died primary melanocytes and PIG3V killed by CD8+T cells, the expression level of IFN-γ, granzyme B and perforin in the patients with vitiligo was higher than those in controls. There was no significant difference in the number of died PIG1 and the expression level of TNF-α between the patients and healthy controls. There was an obviously positive correlation between the level of IFN-γ secreted by CD8+T cells and the number of died melanocytes killed by CD8+T cells. Conclusion: The killing of melanocytes by CD8+T cells plays an important role in the development of vitiligo, which probably depends on the increased expression of IFN-γ, granzyme B and perforin.

    vitiligo; CD8+T cells; IFN-γ; granzyme B; perforin

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):81502717, 81602764, XJZT15M10)

    第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院,陜西西安,710032

    李春英,E-mail: lichying@fmmu.edu.cn

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