• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    CD8+T細(xì)胞對(duì)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞的殺傷機(jī)制

    2017-06-15 14:50:28馬錦媛楊鈺琪李舒麗郭偉楠安亞文高天文李春英
    中國麻風(fēng)皮膚病雜志 2017年6期
    關(guān)鍵詞:黑素細(xì)胞原代白癜風(fēng)

    馬錦媛 楊鈺琪 李舒麗 郭偉楠 宋 璞 安亞文 高天文 李春英

    ?

    ·論著·

    CD8+T細(xì)胞對(duì)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞的殺傷機(jī)制

    馬錦媛 楊鈺琪 李舒麗 郭偉楠 宋 璞 安亞文 高天文 李春英

    目的: 明確CD8+T細(xì)胞對(duì)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞的殺傷機(jī)制。方法: 分選白癜風(fēng)患者及正常人外周血CD8+T細(xì)胞,分別與原代黑素細(xì)胞及永生化正常黑素細(xì)胞系PIG1及永生化白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系PIG3V建立共孵育殺傷模型,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)靶細(xì)胞被殺傷情況,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)殺傷環(huán)境中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B及穿孔素的分泌水平。結(jié)果: 白癜風(fēng)患者外周血CD8+T細(xì)胞殺傷原代黑素細(xì)胞及PIG3V能力,分泌IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素水平均高于健康對(duì)照,而殺傷PIG1能力和TNF-α水平并無顯著差異;白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞IFN-γ分泌水平與細(xì)胞殺傷率呈明顯正相關(guān)。結(jié)論: 白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞殺傷黑素細(xì)胞是白癜風(fēng)發(fā)病的重要機(jī)制,且該殺傷作用可能依賴IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素分泌水平的上調(diào)。

    白癜風(fēng); CD8+T細(xì)胞; 干擾素γ; 顆粒酶B; 穿孔素

    白癜風(fēng)是一種常見的由黑素細(xì)胞選擇性破壞導(dǎo)致的體表黑素減退性疾病,全球發(fā)病率近1%。目前白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制不清,有許多病因?qū)W理論,包括黑素細(xì)胞自身破壞學(xué)說、生化學(xué)說、神經(jīng)起源學(xué)說、自身免疫學(xué)說、遺傳學(xué)說等[1,2]。CD8+T細(xì)胞殺傷作用被認(rèn)為是白癜風(fēng)發(fā)病的重要機(jī)制之一,但具體機(jī)制仍不清。本文通過測(cè)定白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞對(duì)正常人表皮黑素細(xì)胞及永生化黑素細(xì)胞系殺傷作用及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)量,進(jìn)一步探討CD8+T細(xì)胞誘發(fā)白癜風(fēng)的相關(guān)機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 細(xì)胞(細(xì)胞系)及組織來源 原代黑素細(xì)胞由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科提供,取自8~22歲健康青年男性包皮術(shù)后組織(共8例);PIGI細(xì)胞系(人表皮永生化黑素細(xì)胞系)及PIG3V細(xì)胞系(白癜風(fēng)表皮永生化黑素細(xì)胞系)由美國芝加哥大學(xué)Le Poole教授惠贈(zèng);白癜風(fēng)患者血液樣本取自西京皮膚醫(yī)院進(jìn)展期白癜風(fēng)患者外周血(共8例),對(duì)照組血液樣本取自西京皮膚醫(yī)院健康志愿者外周血(共8名)。

    1.2 培養(yǎng)基、試劑及主要儀器 254培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司,人黑素細(xì)胞生長添加劑購于美國Cascade Biologics公司,0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液購于美國Sigma公司,H2O2原液購于日本TAKARA公司,鼠抗人CD8單克隆抗體購于美國Abcam公司,PerCP-Cy5.5-抗人CD8流式抗體購于美國eBioscience公司,碘化丙啶染色液(PI)購于碧云天生物技術(shù)有限公司,人IFN-γ、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒購于美國RD公司,人顆粒酶B ELISA及穿孔素ELISA檢測(cè)試劑盒購于美國RD公司。流式細(xì)胞分選及分析儀購于美國BD公司,酶標(biāo)儀購自于美國BIO-RAD公司。

    1.3 殺傷環(huán)境的建立及殺傷細(xì)胞比率檢測(cè) 使用254無血清培養(yǎng)基配制0.75 mmol/L H2O2處理靶細(xì)胞(原代黑素細(xì)胞及PIG1、PIG3V細(xì)胞系)誘導(dǎo)發(fā)生抗原暴露,分別于離心管內(nèi)種植靶細(xì)胞1×105個(gè)細(xì)胞/管,并分別向各組管內(nèi)加入2×105個(gè)細(xì)胞/管對(duì)照組或白癜風(fēng)患者通過磁珠分選出的CD8+T細(xì)胞(CD8+T細(xì)胞與原代黑素細(xì)胞、PIG1細(xì)胞及PIG3V細(xì)胞HLA分型適配),按2∶1的細(xì)胞數(shù)比例建立CD8+T細(xì)胞與黑素細(xì)胞(原代黑素細(xì)胞、PIG1細(xì)胞及PIG3V細(xì)胞)的殺傷體系;將各組離心管進(jìn)行800 rpm×5 min離心,使效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞緊密結(jié)合,37℃過夜孵育16 h,棄上清液,加入200 μL/管PBS重懸細(xì)胞,隨后加入PI并調(diào)整濃度至1 μg/mL,混勻震蕩,室溫避光染色15 min;1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

    1.4 ELISA檢測(cè)殺傷體系中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B及穿孔素含量 按照1.3步驟建立CD8+T細(xì)胞與PIG1、PIG3V細(xì)胞殺傷體系;采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法,試劑盒來源見1.2,操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

    1.5 統(tǒng)計(jì)軟件及統(tǒng)計(jì)圖制作 所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行了三次獨(dú)立重復(fù)后統(tǒng)計(jì)分析,采用Graphpad Prism 5.0軟件,各組間均數(shù)比較采用雙向方差分析及studentt檢驗(yàn),用直線相關(guān)分析法處理指標(biāo)間的關(guān)系,P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CD8+T細(xì)胞殺傷黑素細(xì)胞比例 白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞對(duì)原代黑素細(xì)胞殺傷率均顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1a,P=0.003)。白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞殺傷對(duì)PIG3V細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯升高(P=0.0411),而在PIG1細(xì)胞中兩者無明顯差異(圖1b,P=0.1467);在對(duì)照組和白癜風(fēng)患者組中,CD8+T細(xì)胞對(duì)PIG3V細(xì)胞的殺傷作用明顯高于對(duì)PIG1的殺傷作用,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1b,P=0.025)。

    圖1 a.白癜風(fēng)患者及正常人群CD8+T細(xì)胞致原代黑素細(xì)胞死亡比例(n=8,**P<0.01);b.白癜風(fēng)患者及正常人群CD8+T細(xì)胞致PIG1、PIG3V細(xì)胞死亡比例(n=8,*P<0.05)

    2.2 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)殺傷體系中IFN-γ、TNF-α、顆粒酶B及穿孔素的分泌水平 白癜風(fēng)患者組CD8+T細(xì)胞殺傷PIG1及PIG3V細(xì)胞時(shí)IFN-γ分泌水平較對(duì)照組明顯升高(圖2a,PIG1組P=0.0119、PIG3V組P=0.0101),而TNF-α分泌水平并無明顯變化(PIG1組P=0.3089、PIG3V組P=0.4498)。白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞殺傷PIG1及PIG3V細(xì)胞時(shí)顆粒酶B的分泌水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.001),但在PIG1及PIG3V細(xì)胞間無明顯差異(圖2b)。白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞殺傷PIG1及PIG3V細(xì)胞時(shí)穿孔素分泌水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.001),且針對(duì)PIG3V細(xì)胞分泌的穿孔素水平明顯高于針對(duì)PIG1細(xì)胞的分泌水平(圖2c,P=0.0015)。

    圖2 白癜風(fēng)患者及正常人群CD8+T細(xì)胞與PIG1、PIG3V共孵育環(huán)境中IFN-γ (a,n=5,*P<0.05)、顆粒酶B(b,n=7,***P<0.001)及穿孔素(c,n=6,**P<0.01,***P<0.001)表達(dá)水平

    3 討論

    CD8+T細(xì)胞在多種自身免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮作用。有報(bào)道斑禿患者及銀屑病患者外周血中CD8+T細(xì)胞數(shù)量上升[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn),CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)殺傷黑素細(xì)胞是白癜風(fēng)重要的發(fā)病機(jī)制之一。有研究認(rèn)為白癜風(fēng)患者血液及皮損中均可出現(xiàn)抗黑素細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞,且數(shù)量與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。同時(shí),白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞能夠殺傷無皮損部位的黑素細(xì)胞[4],提示CD8+T細(xì)胞的殺傷作用與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。Zhang等[5]報(bào)道非節(jié)段型白癜風(fēng)患者活躍期表達(dá)皮膚歸巢CD8+T細(xì)胞中趨化因子受體CCR4表達(dá)水平明顯升高。Byrne等[6]研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)受累的小鼠CD8+T細(xì)胞可針對(duì)黑素細(xì)胞分化抗原TRP2反應(yīng)。本研究通過流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在原代黑素細(xì)胞及永生化細(xì)胞系中,白癜風(fēng)患者的CD8+T細(xì)胞均可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞殺傷增加,也進(jìn)一步證明了上述觀點(diǎn)。

    CD8+T細(xì)胞誘發(fā)白癜風(fēng)的分子機(jī)制方面,有研究認(rèn)為T細(xì)胞能夠通過胞內(nèi)聯(lián)接引導(dǎo)Fas配體(FasL)與靶細(xì)胞上凋亡相關(guān)的Fas分子結(jié)合,從而誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡[7]。然而也有文獻(xiàn)報(bào)道在白癜風(fēng)患者中CD8+T細(xì)胞FasL含量并無明顯上升,提示FasL可能在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞死亡中沒有重要意義[8]。Lili等[9]通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定白癜風(fēng)患者CD3+T細(xì)胞中IFN-γ+CD8+T細(xì)胞、顆粒酶B+CD8+T細(xì)胞(GrB+CD8+T細(xì)胞)及穿孔素+CD8+T細(xì)胞(Perforin+CD8+T細(xì)胞)比例較正常人明顯升高。本研究建立的殺傷環(huán)境中,白癜風(fēng)患者組上清液的IFN-γ,顆粒酶B及穿孔素水平均有不同程度升高,也從另一角度證實(shí)白癜風(fēng)患者表達(dá)IFN-γ、顆粒酶B及穿孔素的CD8+T細(xì)胞比例升高。同時(shí),在白癜風(fēng)患者CD8+T細(xì)胞參與的殺傷環(huán)境中,PIG3V細(xì)胞組上清中的穿孔素含量較PIG1細(xì)胞也明顯升高,說明白癜風(fēng)患者的黑素細(xì)胞可能存在某種機(jī)制誘導(dǎo)Perforin+CD8+T細(xì)胞增殖或促進(jìn)CD8+T細(xì)胞表達(dá)分泌穿孔素。Zhang等[5]通過實(shí)驗(yàn)也認(rèn)為白癜風(fēng)患者表皮內(nèi)可能存在某種抗原誘使CD8+T細(xì)胞增殖及歸巢,且這一現(xiàn)象中存在CCR4的參與,但具體發(fā)生機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

    [1] 張成,唐金,劉建蘭,等.單核苷酸多態(tài)性rs2236313與漢族人尋常型白癜風(fēng)臨床表型的相關(guān)性研究[J].中國麻風(fēng)皮膚病雜志,2011,27(7):451-454.

    [2] Abreu AC, Duarte GG, Miranda JY, et al. Immunological parameters associated with vitiligo treatments: a literature review based on clinical studies[J]. Autoimmune Dis,2015,2015:e196537.

    [3] Yano S, Nakamura K, Okochi H, et al. Analysis of the expression of cutaneous lymphocyte-associated antigen on the peripheral blood and cutaneous lymphocyte of alopecia areata patients[J]. Acta Derm Venerol,2002,82:82-85.

    [4] Harris JE, Harris TH, Weninger W, et al. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-c for autoreactive CD8+T cell accumulation in the skin[J]. J Invest Dermatol,2012,132(7):1869-1876.

    [5] Zhang BX, Lin M, Qi XY, et al. Characterization of circulating CD8+T cells expressing skin homing and cytotoxic molecules in active non-segmental vitiligo[J]. Eur J Dermatol,2013,23(3):331-338.

    [6] Byrne KT, Zhang P, Steinberg SM, et al. Autoimmune vitiligo does not require the ongoing priming of naive CD8+T cells for disease progression or associated protection against melanoma[J]. J Immunol,2014,192 (4):1433-1439.

    [8] Oyarbide-Valencia K, Van den Boorn JG, Denman CJ, et al. Therapeutic implications of autoimmune vitiligo T cells[J]. Autoimmune Rev,2006,5:486-542.

    [9] Lili Y, Yi W, Ji Y, et al. Global activation of CD8+cytotoxic T lymphocytes correlate with an impairment in regulatory T cells in patients with generalized vitiligo[J]. Plos One,2012,7:e37513.

    (收稿:2016-09-07 修回:2016-10-26)

    Mechanism of CD8+T cells killing melanocytes in the patients with vitiligo

    MAJinyuan,YANGYuqi,LIShuli,GUOWeinan,SONGPu,ANYawen,GAOTianwen,LIChunying.

    DepartmentofDermatology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032,China

    LIChunying,E-mail:lichying@fmmu.edu.cn

    Objective: To determine the killing mechanism of CD8+T cells to melanocytes in the patients with vitiligo. Methods: CD8+T cells were obtained from peripheral blood in 8 patients with vitiligo and 8 healthy controls. The primary melanocyte, immortalized normal melanocyte cell line PIG1 and immortalized vitiligo melanocyte cell line PIG3V were co-cultivated with selected CD8+T cells respectively. The number of the death of melanocytes killed by CD8+T cells was assessed by Flow cytometry. The expression levels of IFN-γ, TNF-α, granzyme B and perforin were measured by ELISA. Results: The number of died primary melanocytes and PIG3V killed by CD8+T cells, the expression level of IFN-γ, granzyme B and perforin in the patients with vitiligo was higher than those in controls. There was no significant difference in the number of died PIG1 and the expression level of TNF-α between the patients and healthy controls. There was an obviously positive correlation between the level of IFN-γ secreted by CD8+T cells and the number of died melanocytes killed by CD8+T cells. Conclusion: The killing of melanocytes by CD8+T cells plays an important role in the development of vitiligo, which probably depends on the increased expression of IFN-γ, granzyme B and perforin.

    vitiligo; CD8+T cells; IFN-γ; granzyme B; perforin

    國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):81502717, 81602764, XJZT15M10)

    第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院,陜西西安,710032

    李春英,E-mail: lichying@fmmu.edu.cn

    猜你喜歡
    黑素細(xì)胞原代白癜風(fēng)
    改良無血清法培養(yǎng)新生SD乳鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞
    新生大鼠右心室心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定
    艾迪注射液對(duì)大鼠原代肝細(xì)胞中CYP1A2、CYP3A2酶活性的影響
    中成藥(2018年9期)2018-10-09 07:18:32
    白癜風(fēng)的治療進(jìn)展
    TLR3活化對(duì)正常人表皮黑素細(xì)胞內(nèi)活性氧簇表達(dá)的影響
    308nm準(zhǔn)分子光治療36例白癜風(fēng)患者臨床觀察
    自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞治療白癜風(fēng)患者療效觀察
    兒童白癜風(fēng)和成人白癜風(fēng)臨床比較分析
    角質(zhì)形成細(xì)胞和黑素細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系的建立
    橋粒芯糖蛋白1、3 在HaCaT 細(xì)胞、A431 細(xì)胞及原代角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)
    亚洲av美国av| 亚洲内射少妇av| 久久香蕉精品热| 国产色爽女视频免费观看| 97热精品久久久久久| 天堂动漫精品| 嫩草影视91久久| 天天一区二区日本电影三级| 麻豆av噜噜一区二区三区| 99热只有精品国产| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 一个人免费在线观看电影| 一区二区三区激情视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| x7x7x7水蜜桃| 欧美一区二区国产精品久久精品| 熟女电影av网| 色尼玛亚洲综合影院| 桃红色精品国产亚洲av| 国产私拍福利视频在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 色尼玛亚洲综合影院| 性色avwww在线观看| 丁香欧美五月| 91狼人影院| 欧美3d第一页| 日本 欧美在线| 十八禁网站免费在线| av天堂中文字幕网| 亚洲在线观看片| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产精品免费一区二区三区在线| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲在线观看片| 人妻久久中文字幕网| a在线观看视频网站| av视频在线观看入口| 麻豆国产97在线/欧美| 99国产极品粉嫩在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 日本三级黄在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 能在线免费观看的黄片| 露出奶头的视频| 亚洲国产精品999在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 午夜日韩欧美国产| 精品久久久久久成人av| 麻豆国产av国片精品| 亚洲七黄色美女视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲美女视频黄频| 一级黄色大片毛片| 午夜日韩欧美国产| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产高清三级在线| 青草久久国产| 国产一区二区激情短视频| 丁香欧美五月| 亚洲,欧美,日韩| av在线老鸭窝| 麻豆国产av国片精品| 欧美在线一区亚洲| 色哟哟·www| 国产免费av片在线观看野外av| 999久久久精品免费观看国产| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 听说在线观看完整版免费高清| 国内揄拍国产精品人妻在线| 中文字幕av成人在线电影| h日本视频在线播放| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 亚洲成人久久爱视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 乱人视频在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 少妇丰满av| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲经典国产精华液单 | 香蕉av资源在线| 色在线成人网| 国产乱人视频| 小说图片视频综合网站| 亚洲午夜理论影院| 国产 一区 欧美 日韩| 人妻久久中文字幕网| 精品人妻熟女av久视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲无线在线观看| 深夜精品福利| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产高潮美女av| 国产精品亚洲一级av第二区| 日本熟妇午夜| netflix在线观看网站| 黄色丝袜av网址大全| 久久久国产成人免费| 亚洲七黄色美女视频| 国产av不卡久久| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品不卡视频一区二区 | 国产三级在线视频| 少妇高潮的动态图| 亚洲中文日韩欧美视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 成人亚洲精品av一区二区| 日韩亚洲欧美综合| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲av电影在线进入| 国产成年人精品一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成人国产一区最新在线观看| 精品国产亚洲在线| 精品国产亚洲在线| 一级黄色大片毛片| 看黄色毛片网站| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品人妻熟女av久视频| 一本久久中文字幕| 免费大片18禁| 色综合站精品国产| 久久久久久久久大av| 亚洲美女黄片视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成年女人看的毛片在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 男人舔奶头视频| 伦理电影大哥的女人| 免费一级毛片在线播放高清视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 热99re8久久精品国产| 青草久久国产| 一区二区三区免费毛片| 一个人观看的视频www高清免费观看| 九色成人免费人妻av| www日本黄色视频网| 国产高潮美女av| 天天一区二区日本电影三级| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 日韩大尺度精品在线看网址| xxxwww97欧美| 在现免费观看毛片| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲av成人av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日韩中字成人| 丁香欧美五月| 免费看a级黄色片| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 成年版毛片免费区| 搞女人的毛片| 国产精品99久久久久久久久| 日韩欧美在线乱码| 国产在视频线在精品| 女人被狂操c到高潮| 很黄的视频免费| 无人区码免费观看不卡| 亚洲精品影视一区二区三区av| 我要搜黄色片| 亚洲国产欧美人成| 床上黄色一级片| 欧美精品国产亚洲| 美女免费视频网站| 国产av在哪里看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 男女那种视频在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人无遮挡网站| 精华霜和精华液先用哪个| 少妇被粗大猛烈的视频| 搡老岳熟女国产| 精品国产三级普通话版| 成人三级黄色视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 午夜a级毛片| 久久亚洲精品不卡| 99久久精品热视频| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 舔av片在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 97热精品久久久久久| 久久久色成人| 嫁个100分男人电影在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 男人的好看免费观看在线视频| 在现免费观看毛片| 欧美日韩福利视频一区二区| 99热6这里只有精品| 99精品久久久久人妻精品| 精品熟女少妇八av免费久了| 热99re8久久精品国产| 美女高潮的动态| 人妻久久中文字幕网| 亚洲第一电影网av| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲人成网站高清观看| 99热这里只有是精品50| 怎么达到女性高潮| 在线国产一区二区在线| 欧美+日韩+精品| 国产精品1区2区在线观看.| 精品国产亚洲在线| ponron亚洲| 久久精品人妻少妇| 国产三级中文精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久这里只有精品中国| 亚洲精品色激情综合| 床上黄色一级片| 舔av片在线| 91久久精品国产一区二区成人| 中国美女看黄片| 麻豆国产av国片精品| 国内精品久久久久久久电影| 久久99热6这里只有精品| 免费看日本二区| 亚洲男人的天堂狠狠| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲av五月六月丁香网| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 女同久久另类99精品国产91| 麻豆成人av在线观看| 91久久精品电影网| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲国产精品sss在线观看| 久久久成人免费电影| 国产精品三级大全| 舔av片在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 男插女下体视频免费在线播放| 能在线免费观看的黄片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲在线观看片| 看片在线看免费视频| 亚洲午夜理论影院| 综合色av麻豆| 亚洲18禁久久av| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 男女之事视频高清在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 午夜老司机福利剧场| 免费观看的影片在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲在线观看片| 赤兔流量卡办理| 内射极品少妇av片p| 日本成人三级电影网站| 中文字幕av成人在线电影| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 我要搜黄色片| 国产成人影院久久av| 极品教师在线视频| 国产探花在线观看一区二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 在线天堂最新版资源| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产免费av片在线观看野外av| 久久久久久大精品| 欧美成人一区二区免费高清观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 久久久国产成人免费| 国产视频内射| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产亚洲精品av在线| 国产精品久久久久久久电影| 国产真实伦视频高清在线观看 | 亚洲成人精品中文字幕电影| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国内精品久久久久久久电影| 天堂影院成人在线观看| 麻豆一二三区av精品| 免费无遮挡裸体视频| 日韩精品青青久久久久久| 99热只有精品国产| 观看美女的网站| 好男人在线观看高清免费视频| 最新在线观看一区二区三区| 精品一区二区三区av网在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 身体一侧抽搐| 久久久成人免费电影| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 美女高潮的动态| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美区成人在线视频| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一级av片app| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 成人av一区二区三区在线看| 黄色女人牲交| 日韩欧美免费精品| 久99久视频精品免费| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美乱色亚洲激情| 精品一区二区三区人妻视频| 国产高清激情床上av| 天美传媒精品一区二区| 国产人妻一区二区三区在| 最近最新中文字幕大全电影3| 免费看光身美女| 99国产极品粉嫩在线观看| 88av欧美| 天天躁日日操中文字幕| 精品一区二区三区视频在线| 国产大屁股一区二区在线视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| av在线天堂中文字幕| 久久九九热精品免费| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲欧美日韩东京热| 国产av在哪里看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产真实乱freesex| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 成年版毛片免费区| 村上凉子中文字幕在线| 90打野战视频偷拍视频| 热99re8久久精品国产| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 亚洲国产精品合色在线| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲欧美清纯卡通| 日本三级黄在线观看| 激情在线观看视频在线高清| www日本黄色视频网| 午夜亚洲福利在线播放| xxxwww97欧美| 少妇的逼水好多| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 欧美黄色片欧美黄色片| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲国产精品久久男人天堂| 99久久九九国产精品国产免费| 午夜a级毛片| 69av精品久久久久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| av黄色大香蕉| 757午夜福利合集在线观看| 精品久久久久久,| 日本 av在线| 亚洲国产欧美人成| 舔av片在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 搡老熟女国产l中国老女人| ponron亚洲| АⅤ资源中文在线天堂| 国产欧美日韩一区二区精品| 最近最新中文字幕大全电影3| av福利片在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 成人午夜高清在线视频| 日本在线视频免费播放| 亚洲第一区二区三区不卡| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 午夜福利欧美成人| 丰满乱子伦码专区| 国产成人av教育| 国产亚洲精品av在线| 国产精品影院久久| 长腿黑丝高跟| 久久九九热精品免费| 国产在线精品亚洲第一网站| 少妇高潮的动态图| 欧美日本亚洲视频在线播放| 舔av片在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 免费在线观看亚洲国产| 欧美+日韩+精品| 午夜影院日韩av| 一a级毛片在线观看| 国产高清激情床上av| 我要搜黄色片| 成年女人毛片免费观看观看9| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 色在线成人网| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 免费av不卡在线播放| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲五月婷婷丁香| 精品久久久久久久久久免费视频| 两个人的视频大全免费| 国产一区二区激情短视频| 国产成人av教育| 中文资源天堂在线| 国产野战对白在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产精品99久久久久久久久| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 男女之事视频高清在线观看| 国产淫片久久久久久久久 | 在线看三级毛片| 欧美日本视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 天美传媒精品一区二区| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲午夜理论影院| 色噜噜av男人的天堂激情| 中亚洲国语对白在线视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 首页视频小说图片口味搜索| 动漫黄色视频在线观看| 色综合站精品国产| bbb黄色大片| h日本视频在线播放| 免费高清视频大片| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 免费av毛片视频| 久99久视频精品免费| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久中文看片网| 日韩亚洲欧美综合| 一本综合久久免费| 亚洲美女视频黄频| 亚洲欧美日韩高清专用| 脱女人内裤的视频| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 美女大奶头视频| 最后的刺客免费高清国语| 久久久久久久久中文| 人人妻人人澡欧美一区二区| 免费观看人在逋| 中文在线观看免费www的网站| 国产三级中文精品| 毛片一级片免费看久久久久 | 中亚洲国语对白在线视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲欧美日韩无卡精品| 男插女下体视频免费在线播放| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲美女视频黄频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲av.av天堂| 美女 人体艺术 gogo| 成人国产综合亚洲| 久久久久久久久大av| 亚洲av免费高清在线观看| 中文资源天堂在线| 男人舔女人下体高潮全视频| 久9热在线精品视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 久久中文看片网| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产视频一区二区在线看| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| www.熟女人妻精品国产| 免费在线观看影片大全网站| 成人午夜高清在线视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 免费看光身美女| 免费高清视频大片| 精品日产1卡2卡| 成人av一区二区三区在线看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 天天躁日日操中文字幕| 高潮久久久久久久久久久不卡| 美女免费视频网站| 午夜激情福利司机影院| 欧美三级亚洲精品| 亚洲精华国产精华精| 看片在线看免费视频| 国产高清激情床上av| 日韩 亚洲 欧美在线| 在线观看66精品国产| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产大屁股一区二区在线视频| 午夜影院日韩av| 99在线视频只有这里精品首页| 白带黄色成豆腐渣| 久久久久久大精品| av黄色大香蕉| 午夜福利18| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美最新免费一区二区三区 | 欧美乱妇无乱码| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 色av中文字幕| 日韩精品青青久久久久久| 嫁个100分男人电影在线观看| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 性欧美人与动物交配| 国产精品一区二区性色av| 精品一区二区三区人妻视频| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 草草在线视频免费看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 看免费av毛片| 色综合亚洲欧美另类图片| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲电影在线观看av| 亚洲av熟女| 欧美高清成人免费视频www| 在线免费观看的www视频| 校园春色视频在线观看| 日本五十路高清| 男人的好看免费观看在线视频| 黄色一级大片看看| 黄色视频,在线免费观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 高清日韩中文字幕在线| 特大巨黑吊av在线直播| 日韩免费av在线播放| 99riav亚洲国产免费| 看十八女毛片水多多多| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 99精品在免费线老司机午夜| 宅男免费午夜| 99热这里只有精品一区| 久久国产乱子免费精品| 欧美色欧美亚洲另类二区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲欧美清纯卡通| 国产黄片美女视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 在线观看舔阴道视频| 亚洲国产欧美人成| 成人美女网站在线观看视频| 国产精品一及| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美在线黄色| 国产精品伦人一区二区| 久久人人精品亚洲av| 亚洲人成电影免费在线| 国内精品美女久久久久久| 一本久久中文字幕| 亚洲av二区三区四区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 91狼人影院| 欧美一区二区亚洲| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 我的女老师完整版在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 99久久精品热视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 男人舔女人下体高潮全视频| 91麻豆av在线| 91av网一区二区| 国产精品伦人一区二区| 亚洲美女黄片视频| 桃色一区二区三区在线观看| av中文乱码字幕在线| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美又色又爽又黄视频| 熟女人妻精品中文字幕| 日韩人妻高清精品专区| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲人成电影免费在线| 91久久精品电影网| 国产真实乱freesex| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产亚洲精品久久久com| 日本黄色视频三级网站网址| 一本久久中文字幕| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲五月婷婷丁香| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久久色成人| 91字幕亚洲| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产真实伦视频高清在线观看 | 老司机午夜十八禁免费视频| 国产男靠女视频免费网站| 欧美黄色淫秽网站| 91av网一区二区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产不卡一卡二| 亚洲第一电影网av| 欧美午夜高清在线| 99热这里只有是精品50| 亚洲av成人av| 看黄色毛片网站| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲,欧美,日韩| 丝袜美腿在线中文| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| a在线观看视频网站| 成年女人看的毛片在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站|