高效液相色譜法快速測定青海牛羊肉和內(nèi)臟組分中尿酸和嘌呤

王靜瑩+薄海波+吉生軍+楊娟

摘 要：建立青海牛羊肉和內(nèi)臟組分中尿酸和4 種嘌呤（鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤）的2 種分析方法，一種是采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法同時測定上述5 種組分，并折算出尿酸總含量；另一種是采用生物酶解法將嘌呤全部轉(zhuǎn)化后，采用HPLC法快速測定其降解產(chǎn)物尿酸。2 種方法均采用Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18色譜柱分離，濃度為7×10-3 mol/L的KH2PO4-H3PO4（pH=3.83）溶液作為流動相，紫外檢測波長為254 nm。結(jié)果表明：同時測定法中，被測物質(zhì)在上述條件下分離良好，在較寬的濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）均在0.998 4以上，平均回收率為92.2%～119.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.78%～10.43%；轉(zhuǎn)化后尿酸快速測定法中，被測物質(zhì)在1～70 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積間的線性關(guān)系良好，r=0.999 4。將2 種分析方法得出的總尿酸含量進(jìn)行比較，經(jīng)配對t檢驗，結(jié)果無顯著性差異（P=0.773>0.05）。2 種方法均可用于牛羊肉和內(nèi)臟組分中嘌呤類物質(zhì)的檢測。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；尿酸；嘌呤；酶解轉(zhuǎn)化

Abstract： Two analytical methods were developed to determine uric acid and four purines （guanine， hypoxanthine， xanthine and adenine） in meat and viscera of cattle and sheep from Qinghai province. One was based on the simultaneous determination of five individual components by high performance liquid chromatography （HPLC） for subsequent calculation of total uric acid， while the other was based on the enzymatic transformation of all four purines to uric acid for rapid determination of the degradation product by HPLC. In both methods， the chromatographic separation was performed using an Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18 column with 7 × 10-3 mol/L KH2PO4-H3PO4 （pH 3.83） as mobile phase， and the analytes were detected at 254 nm. Results shows that the first method achieved good separation and good linearity in a wide concentration range with all correlation coefficients being higher than 0.998 4， and the recoveries were between 92.2% and 119.8% with relative standard deviations （RSD） between 0.78% and 10.43%. Similarly， the second method had a good linearity in the range of 1–70 mg/L with correlation coefficients of 0.999 4. The values of total uric acid obtained by the two methods did not significantly differ from each other as indicated by the matched pairs t-test （P = 0.773 > 0.05）. The two methods could be used for the detection of purine compounds in bovine and sheep meat and viscera.

Key words： high performance liquid chromatography （HPLC）； uric acid； purine； enzymatic conversion

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201705008

中圖分類號：O657.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）05-0040-06

嘌呤（purine）是組成核酸的重要堿基。常見的嘌呤主要有腺嘌呤（adenine，A）、鳥嘌呤（guanine，G）、黃嘌呤（xanthine，X）和次黃嘌呤（hypoxanthine，H）[1]。

飲食是人體內(nèi)嘌呤的重要來源，嘌呤攝入量過多時易引起痛風(fēng)，飲食控制對避免痛風(fēng)發(fā)生和復(fù)發(fā)有特別重要的作用。嘌呤及其最終代謝物尿酸（uric acid）的檢測對人體的一些疾病和代謝紊亂的診斷極為重要[2]。尿酸又名2，6，8-三羥基嘌呤，是血漿中非蛋白氮的重要組分之一[3]。尿酸與VC有相似的抗氧化作用，能清除體內(nèi)的自由基[4]。有研究[5]表明，高嘌呤含量的食物攝入過多會引起血液中尿酸水平升高，從而引發(fā)高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA），5%～12%的HUA患者因長期不愈導(dǎo)致痛風(fēng)。隨著社會經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展及人民膳食結(jié)構(gòu)的變化，HUA和痛風(fēng)的患病率逐年增加[6]，并有年輕化趨勢[7]。

嘌呤的檢測方法主要有液相色譜法、紙層析法、電泳法、薄層色譜法、氣相色譜法和離子色譜法等[8]，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法具有高效、方便、快捷、選擇性高等優(yōu)點，在嘌呤研究領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛。樣品中嘌呤的提取方法有酸提取法[9-13]、有機(jī)溶劑萃取法[14-15]和超聲輔助萃取法[16-18]。

其中酸提取法多采用高氯酸[19-22]、三氟乙酸和甲酸混合液[23-25]水解樣品。所有嘌呤類物質(zhì)的代謝產(chǎn)物都是尿酸，食品中嘌呤檢測的最終目的是評價尿酸對人體健康的影響。尿酸的檢測分析方法有紫外分光光度法[26]、液相色譜法[27-28]、磷鎢酸還原法[29]和同位素稀釋法[30]等。

本研究擬建立肉類中尿酸和4 種嘌呤的2 種分析方法，一種是采用HPLC法同時測定上述5 種組分；另一種是將G和A通過重氮化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為H和X，再在黃嘌呤氧化酶的作用下生成尿酸，采用HPLC法快速測定總尿酸含量。并采用上述2 種方法測定青藏高原牛羊肉和內(nèi)臟組分中尿酸和4 種嘌呤的含量，將2 種方法測得的總尿酸含量進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮黃牛肉、牦牛肉、牛肉、牛頭肉、牛雜碎（含有牛肚、牛筋、牛排、牛腩等內(nèi)臟）、手抓羊肉、羊雜碎（含有羊肚、羊心、羊肺、羊腸、羊肝等內(nèi)臟） 西寧市各大市場。-20 ℃冷凍保存。

尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98.0%） 美國Agilent公司；黃嘌呤氧化酶（生化試劑） 上海源葉生物科技有限公司；實驗用水均為超純水。

高氯酸 天津東方化工廠；磷酸 天津市濱?？频匣瘜W(xué)試劑有限公司；鹽酸 白銀良友化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鉀、氫氧化鈉 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀 北京紅星化工廠；磷酸二氫鈉 天津凱通化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉（分析純） 西安化學(xué)試劑廠；亞硝酸鈉 天津北辰方正試劑廠；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

戴安U1tiMate 3000高效液相色譜儀（配有紫外檢測器） 美國戴安公司；752型紫外-可見分光光度計 上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司；L600湘儀離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；WB-2000水浴鍋、R1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司； FW-100高速萬能粉碎機(jī) 紹興市科弘儀器有限公司；雷磁PHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TG332A微量分析天平 湘儀天平儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 HPLC色譜條件

色譜柱：Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；柱溫30 ℃；流動相：7×10-3 mol/L KH2PO4-H3PO4（pH=3.83）；流速1.0 mL/min；檢測器：紫外檢測器，檢測波長254 nm；進(jìn)樣量10 ?L。

1.3.2 溶液配制

稱取尿酸、鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品各0.050 0 g，加入20 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，分別用體積分?jǐn)?shù)為10%甲醇定容至100 mL，搖勻，得質(zhì)量濃度為500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)單一儲備溶液。-20 ℃保存。

1.3.3 樣品制備

將牛羊肉、牛羊雜碎用刀切碎，用高速萬能粉碎機(jī)絞碎并勻漿，-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 樣品前處理

樣品水解：稱取0.200 0 g樣品于10 mL具塞刻度離心管中，加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為10% HClO4，搖勻，在沸水浴中水解60 min，冷卻。用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至3.8左右，再用超純水定容至10 mL，3 000 r/min條件下離心30 min，上清液用濾紙過濾。濾液經(jīng)0.45 ?m微孔濾膜過濾，HPLC法分別測定尿酸和4 種嘌呤的含量。

重氮化反應(yīng)：取上述水解液的上清液2 mL于10 mL具塞刻度離心管，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至3.8左右，加入1.10 mL 1.2 mol/L的HCl溶液、0.25 mL 150.0 g/L的NaNO2溶液，振蕩，55 ℃恒溫水浴30 min。

酶解轉(zhuǎn)化：將重氮化反應(yīng)后的溶液冷卻至室溫，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）2.0 mL，黃嘌呤氧化酶（300 U/L）4.0 mL，用超純水定容至10 mL，振蕩，30 ℃恒溫水浴30 min，冷卻至室溫。0.45 ?m微孔濾膜過濾，HPLC法測定總尿酸的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行配對樣本t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

實驗對比了Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18、Agilent 5 HC-C18和資生堂CAPCELL PAK-C18 3 種色譜柱（規(guī)格均為4.6 mm×250 mm，5 ?m）對樣品的分離效果，用尿酸和4 種嘌呤的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣品，綜合考察色譜柱對5 種組分的分離情況。由圖1可知，3 種色譜柱對各個組分的分離度均可達(dá)到分析測定的要求，Agilent ZorBax Eclipse XDB-C18柱分析5 種組分的保留時間較短，故選擇其作為本研究用色譜柱。

2.1.2 流動相的優(yōu)化

2.1.2.1 緩沖液pH值的選擇

采用KH2PO4-H3PO4緩沖液做流動相，其pH值對目標(biāo)組分的分離效果和保留時間影響較大?？疾靝H值分別為3.65、3.83、3.93、4.15的KH2PO4-H3PO4溶液（濃度均為7.0×10-3 mol/L）對尿酸和4 種嘌呤峰形和分離效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

嘌呤堿基呈微弱的堿性，在色譜柱上的保留行為對流動相酸度非常敏感。由圖2可知，在緩沖液pH值為3.65和4.15時，G和H的分離度較差，且A的保留時間較長；pH值為3.93時，G和H的分離度較pH 3.65和pH 4.15較好，但仍達(dá)不到分析測定要求；pH值為3.83時，5 種組分的分離度均能達(dá)到分析測定要求，色譜峰形尖銳，對A的保留時間較pH 3.65和pH 4.15時短，可減少分析檢測時間，故確定緩沖液的pH值為3.83。

2.1.2.2 緩沖鹽濃度的選擇

考察濃度分別為2.0×10-4、5.0×10-3、7.0×10-3、1.0×10-2、2.0×10-2 mol/L的KH2PO4-H3PO4溶液（pH值均為3.83）對尿酸和4 種嘌呤峰形和分離效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，KH2PO4-H3PO4溶液濃度為7.0×10-3 mol/L時，分離效果最好，峰形尖銳、對稱。出峰順序依次為尿酸、G、H、X、A。故選擇緩沖液濃度為7.0×10-3 mol/L。

2.1.3 酶解條件的優(yōu)化

2.1.3.1 重氮化反應(yīng)中HCl和NaNO2用量的選擇

馮曉晶等[26]探討了重氮化反應(yīng)和酶解反應(yīng)的條件，4 種嘌呤可全部轉(zhuǎn)化為尿酸。本研究在此基礎(chǔ)上做進(jìn)一步優(yōu)化。G和A與亞硝酸鹽作用，并在酸性溶液中分別轉(zhuǎn)化為H和X，然后在黃嘌呤氧化酶的作用下轉(zhuǎn)化為嘌呤終產(chǎn)物——尿酸。

G、H、X、A的質(zhì)量濃度分別為4 mg/L，按1.3.4節(jié)進(jìn)行重氮化反應(yīng)和酶解反應(yīng)，分別改變1.2 mol/L HCl溶液和150.0 g/L NaNO2溶液的加入量，根據(jù)生成尿酸的峰面積來評估HCl和NaNO2溶液的加入量對反應(yīng)的影響。

由表1可知，1.2 mol/L HCl溶液和150.0 g/L NaNO2溶液的適應(yīng)加入量分別為1.10、0.25 mL。

2.1.3.2 黃嘌呤氧化酶用量的選擇

4 種嘌呤的質(zhì)量濃度均為4 mg/L時，改變300 U/L的黃嘌呤氧化酶溶液的加入量，確保能將4 種嘌呤高效率地轉(zhuǎn)化為尿酸。

由表2可知，黃嘌呤氧化酶溶液加入量為4.0～5.0 mL時，尿酸峰面積相差不大，出于對試劑成本和轉(zhuǎn)化率的綜合考慮，選擇黃嘌呤氧化酶溶液的加入量為4.0 mL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

2.2.1 5 種組分的線性關(guān)系

用超純水對尿酸和4 種嘌呤的標(biāo)準(zhǔn)單一儲備液進(jìn)行逐級稀釋，配制成5 種分析組分的系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。在1.3.1節(jié)所述的色譜條件下，分別取10 ?L進(jìn)樣。采用外標(biāo)法對系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積（y）和相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸計算。

由表3可知，尿酸和4 種嘌呤的質(zhì)量濃度和峰面積在0.05～50.00 mg/L線性范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）在0.998 4～0.999 6之間。

2.2.2 尿酸單組分的線性關(guān)系

用超純水對尿酸標(biāo)準(zhǔn)單一儲備液進(jìn)行逐級稀釋，配制成單組分系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用外標(biāo)法對尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積（y）和相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸計算。線性方程為y=0.18x+0.03，r為0.999 4，線性范圍為1～70 mg/L。

2.3 檢出限和定量限

分別將5 種組分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和尿酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配成低質(zhì)量濃度的溶液進(jìn)樣，以3 倍信噪比為檢出限（limit of detection，LOD），6 倍信噪比為定量限（limit of quantification，LOQ）。分別測定法中5 種組分的檢出限和定量限見表3；轉(zhuǎn)化后尿酸快速測定法中尿酸的檢出限為0.096 mg/L，定量限為0.192 mg/L。

2.4 回收率和精密度

采用牛肚樣品做尿酸和4 種嘌呤的添加回收實驗。取牛肚樣品18 份，每份0.2 g（精確到0.000 1 g），分別添加質(zhì)量濃度為16 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、1.0、4.0 mL，3 個添加水平分別為32、80、340 mg/kg，每個水平6 次平行，按1.3.4節(jié)進(jìn)行樣品水解處理，在最佳色譜條件下測定。

由表4可知，尿酸在3 個添加水平時的平均加標(biāo)回收率在92.5%～105.5%之間，方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在0.78%～10.43%之間；G的平均回收率為94.0%～119.8%，RSD為1.29%～10.12%；H的平均回收率為99.5%～114.9%，RSD為1.05%～9.07%；X的平均回收率為92.5%～93.1%，RSD為1.54%～8.08%；A的平均回收率為92.2%～94.0%，RSD為2.91%～8.14%。

將5 種組分的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，根據(jù)測定結(jié)果分別計算尿酸和4 種嘌呤的RSD。由表5可知，5 種組分的RSD均在0.25%～0.81%之間，表明儀器的精密度良好。

2.5 2 種方法的測定結(jié)果及對比

在1.3.1節(jié)的條件下，采用同時測定法和轉(zhuǎn)化后尿酸快速測定法分別對1.3.3節(jié)中的樣品進(jìn)行分析測定。第1種方法測定得到的5 種組分的含量根據(jù)相對分子質(zhì)量全部折算為尿酸的總含量，并將計算結(jié)果與第2種方法測得的總尿酸含量進(jìn)行比較。牛肚樣品及其加標(biāo)樣品的色譜圖見圖4，樣品測定結(jié)果及比較見表6。

采用同時測定法測得的青藏高原牛羊雜碎中總尿酸含量為159～3 750 mg/kg，轉(zhuǎn)化后尿酸快速測定法測得的總尿酸含量為165～3 768 mg/kg。牛雜碎（牛肚、牛筋、牛排、牛腩等）中的尿酸總含量普遍低于牛肉、黃牛肉和牦牛肉；羊肝、羊心和羊肺中的尿酸總含量高于手抓羊肉，而羊肚、羊排和羊腸中的尿酸總含量低于手抓羊肉，其中羊肝和羊肺中總嘌呤含量較高，牛肚和羊肚中總嘌呤含量較低。

采用SPSS軟件對2 種方法的測定結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗，結(jié)果表明，配對樣本P=0.000<0.005，表明2 種方法的測定結(jié)果具有相關(guān)性；t=-0.295，自由度=12，雙側(cè)檢驗P=0.773>0.05，2 種方法測定總尿酸含量的結(jié)果間無顯著性差異。

3 結(jié) 論

本研究建立了肉類中尿酸和4 種嘌呤（G、H、X、A）的2 種分析方法，即采用HPLC法同時測定5 種組分和將全部嘌呤轉(zhuǎn)化后再測定尿酸含量的快速測定法。同時測定法測得青藏高原牛、羊雜碎中的總尿酸含量為159～3 750 mg/kg；轉(zhuǎn)化后尿酸快速測定法測得的青藏高原牛、羊雜碎中的總尿酸含量為165～3 768 mg/kg。將2 種分析方法得出的總尿酸含量進(jìn)行比較，經(jīng)配對t檢驗，雙側(cè)檢驗P=0.773>0.05，結(jié)果無顯著性差異。2 種方法均可用于肉類中嘌呤類物質(zhì)的分析測定。

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