非小細(xì)胞肺癌患者中EGFR與TTF-1表達(dá)及與患者預(yù)后關(guān)系的研究

邸慶國(guó) 張玲 買智濤 姜明明 張欣 孫寶華

非小細(xì)胞肺癌患者中EGFR與TTF-1表達(dá)及與患者預(yù)后關(guān)系的研究

邸慶國(guó)1張玲2買智濤1姜明明1張欣1孫寶華1

目的 探索NSCLC患者TTF-1與EGFR突變表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的關(guān)系。方法 共收集2011.1-2014.12我科NSCLC患者240例組織標(biāo)本，采用免疫組化法檢測(cè)TTF-1表達(dá)，采用PCR擴(kuò)增直接測(cè)序法檢測(cè)EGFR突變，采用χ2檢驗(yàn)研究EGFR突變與TTF-1陽性表達(dá)的相關(guān)性，Kaplan-Meier法分析患者總生存期(OS)與TTF-1及EGFR突變的關(guān)系，繪制出生存曲線，P<0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 TTF-1陽性與患者性別，吸煙指數(shù)，病理分型，TNM分期，EGFR突變及PS評(píng)分有明顯相關(guān)性，TTF-1陽性、EGFR突變陽性患者與陰性患者生存曲線均無交叉，生存期有差別，尤其EGFR突變中21外顯子陽性患者其生存期明顯好(P<0.001)。結(jié)論 TTF-1可作為NSCLC患者預(yù)測(cè)預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)，聯(lián)合EGFR突變可以更好的預(yù)測(cè)預(yù)后，指導(dǎo)臨床診療。

非小細(xì)胞肺癌；甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子；表皮生長(zhǎng)因子受體

肺癌是最常見的肺部原發(fā)性惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer， NSCLC)占其發(fā)病率80%，其發(fā)病率和死亡率已居于各類腫瘤的首位[1]。隨著化療方法的不斷提高，其生存期有了顯著延長(zhǎng)，特別是近十余年來靶向研究的不斷深入，使得患者生存期更有了極大提高[2]。

EGFR突變檢測(cè)是肺癌靶向治療的前提，EGFR突變陽性患者對(duì)EGFR-TKI制劑敏感性好，預(yù)后會(huì)有極大改善[3]，但是EGFR突變檢測(cè)存在時(shí)間要求，其檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)本大小，檢測(cè)方法等有明顯相關(guān)性。Yatabe 等[4]研究發(fā)現(xiàn)EGFR突變陽性率較高的腺癌中其甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子(thyroid transcription factor，TTF-1)表達(dá)也較高，免疫組化檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)TTF-1陽性率達(dá)到75%左右[5]，有文獻(xiàn)指出[6-7]TTF-1表達(dá)陽性的肺腺癌中大約93-96%的EGFR突變分析陽性，這表明TTF-1與EGFR突變表達(dá)存在一定相關(guān)性。由于TTF-1檢測(cè)方法較EGFR突變檢測(cè)簡(jiǎn)單，省時(shí)，因此進(jìn)一步探索明確TTF-1表達(dá)與EGFR突變之間的關(guān)系及與患者預(yù)后的相關(guān)性大小，從而可以進(jìn)一步指導(dǎo)臨床治療，預(yù)測(cè)預(yù)后。

資料與方法

一、臨床資料

收集我科2011.1至2014.12月非小細(xì)胞肺癌患者240例，男性171例，女性69例。鱗癌86例，腺癌138例，腺鱗癌12例，其他類型4例。其中行EGFR基因檢測(cè)的患者144例。240例患者組織標(biāo)本均行免疫組化檢測(cè)，144例患者采用PCR直接測(cè)序法檢測(cè)EGFR表達(dá)情況。總體臨床數(shù)據(jù)資料采集患者姓名、性別、年齡、體重變化、病理分型、分期、有無吸煙、免疫組化檢測(cè)結(jié)果、EGFR(18-21外顯子)突變情況、PS評(píng)分及患者生存期。其中PS評(píng)分依據(jù)Zubrod-ECOG-WHO(ZPS)法，病理類型依據(jù)2007年WHO肺、胸膜腫瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤分期依據(jù)2009年第7版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。(見表1)。

二、檢測(cè)方法

TTF-1檢測(cè)：組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，經(jīng)脫水后進(jìn)行石蠟包埋，切片6張(厚度5um)，其中1張經(jīng)HE染色行病理診斷，其余5張行免疫化染色。免疫組化采用EnVision兩步法(抗人TTF-1單克隆抗體及EnVision兩步法試劑盒均采購(gòu)丹麥DAKO公司產(chǎn)品，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作)。

EGFR突變檢測(cè)：主要檢測(cè)外顯子18、19、20、21位點(diǎn)基因片段。PCR法直接擴(kuò)增外顯子及其相連的內(nèi)含子片段(PCR流程：變性95 ℃ 15 min；變性94 ℃ 30 s，退火65 ℃ 30 s和延伸72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后延伸72 ℃ 5 min)。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜，行正反兩個(gè)方向測(cè)定PCR產(chǎn)物基因并測(cè)序圖譜。

三、結(jié)果判定

1 切片HE染色及免疫組化染色均由兩位有豐富經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師讀片審核(TTF-1表達(dá)于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色為陽性信號(hào))(見圖1)。

2 EGFR測(cè)序圖譜與正常對(duì)照分析有無突變(見圖2)

四、隨訪

通過住院病例采集、電話回訪及微信回訪形式收集患者詳細(xì)病例資料。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用χ2檢驗(yàn)比較TTF-1與臨床各因素之間關(guān)系，進(jìn)一步采用pearson法分析TTF-1表達(dá)與EGFR突變的相關(guān)性，通過Kaplan-Meier生存分析法比較TTF-1與EGFR在患者生存方面的相關(guān)性，繪制生存曲線，P<0.05(雙側(cè)檢驗(yàn))為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，運(yùn)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

表1 TTF-1與各臨床因素比較匯總

圖1 免疫組化中TTF-1表達(dá)情況

圖2 檢測(cè)到EGFR 19和21外顯子突變圖譜表現(xiàn)

A.19外顯子突變；B. 19外顯子野生型；C.21外顯子突變;D 21外顯子野生型

結(jié) 果

一、患者基本情況統(tǒng)計(jì)

通過χ2檢驗(yàn)比較TTF-1表達(dá)與各臨床因素之間關(guān)系。(見表2、3)。

表2 EGFR檢測(cè)中19外顯子突變與TTF-1關(guān)系分析

表3 EGFR檢測(cè)中21外顯子突變與TTF-1關(guān)系

二、非小細(xì)胞肺癌患者生存分析

回訪240例非小細(xì)胞肺癌患者，通過生存分析Kaplan-Meier法分析TTF-1及EGFR突變患者的生存情況，繪制生存曲線。(見圖3-6)。

圖3 TTF-1表達(dá)與患者總生存期之間關(guān)系。TTF-1陽性患者與陰性患者生存曲線無交叉，生存期存在差異，但P=0.289，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖4 EGFR突變患者與野生型患者其生存曲線無交叉，生存期存在差異，但P=0.56，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖5 EGFR突變與患者總生存期之間關(guān)系。21外顯子突變患者生存情況，突變患者與野生型患者生存期存在差異，P<0.001,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

圖6 19外顯子突變患者與野生型患者生存曲線存在交叉，且P=0.501，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

討 論

EGFR是分子量為170 KD的跨膜糖蛋白，通過與表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth facto，EGF)結(jié)合并啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)的一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。該受體在多種上皮性腫瘤細(xì)胞中均有較高表達(dá)，EGFR表達(dá)增高直接影響到腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、粘附、轉(zhuǎn)移、凋亡抑制及血管生成，同時(shí)其在腫瘤不同分期表達(dá)不同，其與患者生存期，預(yù)后以及治療敏感性有密切相關(guān)。EGFR屬于Ⅰ型表皮生長(zhǎng)因子受體家族(基因位點(diǎn)位于7號(hào)染色體短臂TP12-14區(qū))，目前已發(fā)現(xiàn)的EGFR突變90%以上位于外顯子18-21位點(diǎn)，其中最多的是19外顯子(2235-2250位)堿基缺失和21外顯子點(diǎn)突變(2573位T替代G)，從而引起氨基酸編碼改變。

TTF-1在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞和無纖毛細(xì)支氣管上皮細(xì)胞中有較高表達(dá)，其在表面活性物質(zhì)和Clara細(xì)胞分泌蛋白增強(qiáng)區(qū)域結(jié)合，從而維持肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)活性，TTF-1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中隨病理類型的不同表達(dá)而異，有研究指出TTF-1在腺癌中表達(dá)約58%-84%[8-9]。

本研究提示TTF-1陽性表達(dá)與性別(P<0.001)、吸煙指數(shù)(P=0.002)、病理類型(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)、EGFR突變(P<0.001)及PS評(píng)分(P=0.012)相關(guān)，特別是女性(88.41%)、不吸煙(73.72%)，腺癌(92.75%)患者TTF-1陽性表達(dá)明顯升高，Giaccone等[10]研究發(fā)現(xiàn)改組人群中EGFR突變率也明顯升高。采用免疫組化檢測(cè)TTF-1，是一種較EGFR突變分析省時(shí)，省力，節(jié)約成本的檢測(cè)方法，有研究發(fā)現(xiàn)[11]93-96%的NSCLC患者中EGFR與TTF-1同時(shí)表達(dá)，本研究也發(fā)現(xiàn)NSCLC中TTF-1與EGFR陽性表達(dá)存在一致性，僅7.32%EGFR陽性患者TTF-1表達(dá)陰性，2011年ASCO大會(huì)上Somaiah[12]等報(bào)道224例TTF-1陰性表達(dá)的肺腺癌患者中僅有2例發(fā)生EGFR突變，TTF-1檢測(cè)EGFR突變的靈敏度和特異度分別為99．1%和36．4%。Julien Vincenten等[2]發(fā)現(xiàn)TTF-1陰性患者其術(shù)后復(fù)發(fā)或化療后進(jìn)展幾率明顯升高，可能與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)分化程度有關(guān)， Kyuichi Kadota等[13]研究指出TTF-1陰性患者術(shù)后易復(fù)發(fā)，生存期較短。有研究[14]已發(fā)現(xiàn)TTF-1陰性患者預(yù)后較差，本研究中結(jié)果顯示患者生存期情況與上述研究結(jié)果相符合指出TTF-1陽性患者預(yù)后明顯優(yōu)于陰性患者，因此TTF-1可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。

研究發(fā)現(xiàn)早期肺癌中EGFR突變是一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)后因子，已有的研究指出EGFR突變患者接受化療，其有效率明顯升高；指南已提出EGFR突變檢測(cè)是晚期肺癌一線使用靶向藥物(吉非替尼、厄洛替尼)的先決條件。目前，EGFR突變的檢測(cè)手段很多，但對(duì)組織標(biāo)本、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、質(zhì)量控制等要求較高，而且耗時(shí)、費(fèi)用高等，使部分患者錯(cuò)失檢測(cè)的機(jī)會(huì)，耽誤患者治療。而免疫組化檢測(cè)是一種快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的方法，是在一般實(shí)驗(yàn)室都能開展的項(xiàng)目，因此采用TTF-1來預(yù)測(cè)患者治療效果及預(yù)后具有更重要臨床指導(dǎo)意義，尤其對(duì)于級(jí)別及設(shè)備不全的較低級(jí)別醫(yī)院具有更好的指導(dǎo)意義。

[1] 劉雨桃，郟博，石遠(yuǎn)凱．2011年非小細(xì)胞肺癌研究進(jìn)展[J]．癌癥進(jìn)展，2012，10(2)：124-128．

[2] Vincenten J, Smit EF,Vos W,et al.Negative NKX2-1 (TTF-1) as Temporary Surrogate Marker for Treatment Selection During EGFR-Mutation Analysis in Patients with Non-Small-Cell Lung Cancer[J].J Thorac Oncol,2012,7(10)：1522-1527.

[3] Mitsudomi T,Morita S,Yatabe Y,et al.Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harbouring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomised phase 3 trial[J].Lancet Oncol,2010,11(2):121-128.

[4] Yatabe Y,Kosaka T,Takahashi T,et al.EGFR mutation is specific for terminal respiratory unit type adenocarcinoma[J].Am J Surg Pathol,2005,29(5):633-639.

[5] Martins SJ，Takagaki TY,Silva AG,et al．Prognostic relevance of TTF-1 and MMP-9 expression in advanced lung adenocarcinoma[J]．Lung Cancer,2009，64(1)：105-109.

[6] 徐曉艷，杜華，寶魯日，等.非小細(xì)胞肺癌活檢標(biāo)本中CK7、TTF-1、NapsinA、CK5/6及p63的表達(dá)及其意義[J]. 診斷病理學(xué)雜志,2015,22(11):688-689.

[7] Chung K,Huang Y,Chang YL,et al.Clinical significance of thyroid transcription factor-1 in advanced lung adenocarcinoma under epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor treatment[J].Chest,2012,141(2):420-428.

[8] 萬善志,韓一平,黃玲,等.肺腺癌患者EGFR突變與TTF-1的關(guān)系及意義研究[J].臨床肺科雜志,2015,20(2):224-227.

[9] Nicholson AG,Gonzalez D,Shah P,et al. Refining the diagnosis and EGFR status of non-small cell lung carcinoma in biopsy and cytologic material, using a panel of mucin staining, TTF-1, cytokeratin 5/6, and P63, and EGFR mutation analysis[J].J Thorac Oncol,2010,5(4):436-441.

[10] Giaccone G，Gallegos Ruiz M，Le Chevalier T，et al．Erlotinib for frontline treatment of advanced non-small cell lung cancer: a phase II study[J]．Clin Cancer Res，2006，12(20 Pt 1)：6049—6055.

[11] Tapia C,Savic S,Bihl M,et al.EGFR mutation analysis in non-small-cell lung cancer: Experience from routine diagnostics[J].Pathologe,2009,30(5):384-392.

[12] Somaiah N,Garrett-Mayer E,Huang X,et al.Use of negative thy-roid transcription factor (TTF-1) status to predict for negative epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations (Mts) status with a high negative predictive value (NPV) in patients (pts) with adenocarcinomas (AC) of the lung[A].ASCO Annual Meeting Proceedings[C]. 2011 ASCO Annual Meeting 2011,29(15 suppl):7530.

[13] Kadota K,Nitadori J,Sarkaria IS,et al.Thyroid transcription factor-1 expression is an independent predictor of recurrence and correlates with the IASLC/ATS/ERS histologic classification in patients with stage I lung adenocarcinoma[J].Cancer,2013,119(5):931-938.

[14] Barletta JA,Perner S,Iafrate AJ,et al.Clinical significance of TTF-1 protein expression and TTF-1 gene amplification in lung adenocarcinoma[J].J Cell Mol Med,2009,13(8B):1977-1986.

Research of relation between TTF-1 and EGFR mutations and prognosis in NSCLC

DI Qing-guo, ZHANG Ling, MAI Zhi-tao, JIANG Ming-ming, ZHANG Xin, SUN Bao-hua.

Department of Respiratory Medicine, Cangzhou Central Hospital, Cangzhou, Hebei 061000, China

Objective To explore the relationship between the expression of TTF-1, EGFR mutations and the prognosis of patients of NSCLC. Methods 240 cases of tissue samples of NSCLC were collected from 2011.1 to 2014.12. Immunohistochemical staining method was used to detect the TTF-1 expression, and direct sequencing detection was used to detect EGFR mutations. Chi-square test was used to compare the correlation of EGFR mutation positive expression and TTF-1 expression, and Kaplan Meier survival analysis method to analyze the correlation between the patients’ overall survival (OS) and EGFR mutation and TTF-1. Results The positive expression of TTF-1 had significant relevance with gender, smoking index, pathological type, TNM stage, EGFR mutations and PS score. Through the survival analysis it showed that the prognosis of TTF-1 in patients with positive and EGFR mutation positive was significant difference from negative patients. Their survival curves were without cross, and further analysis of EGFR mutation in exon 21 positive patients showed the survival was obviously better (P<0.001). Conclusion TTF-1 can be used as an independent predictor to predict prognosis in NSCLC. Further, EGFR mutations can better predict the prognosis of NSCLC patients and guide clinical diagnosis and treatment.

NSCLC; TTF-1; EGFR

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.008

061000 河北 滄州，滄州市中心醫(yī)院1.呼吸一科、2.內(nèi)分泌三科

2016-08-27]