分子線性探針雜交方法用于耐多藥結核病耐藥性分析的應用研究

包訓迪 王超 闞曉紅 王慶

分子線性探針雜交方法用于耐多藥結核病耐藥性分析的應用研究

包訓迪 王超 闞曉紅 王慶

目的 評價分子線性探針雜交方法(LPA)在快速檢測耐多藥結核病人耐藥性的應用價值。方法 利用分子線性探針雜交方法檢測415例結核分枝桿菌臨床分離株，同時使用常規(guī)藥敏方法對樣本進行抗結核藥物敏感性測試。結果 線性探針雜交法檢測415例結核分枝桿菌臨床分離株RFP和INH耐藥性的靈敏度、特異性分別為91.43%、94.20%和75.68%、95.89%，兩種檢測方法的kappa值分別為0.830、0.731；線性探針雜交法檢出MDR的敏感度和特異度分別為75.44%、95.25%，兩種檢測方法的kappa值為0.692。線性探針雜交法檢測的耐藥株中RFP常見的突變型主要分布在WT7、WT8和MUT3(S531L)。結論 線性探針雜交法在結核病耐藥分析中能夠快速、準確的鑒定出RFP和INH的耐藥性以及常見耐藥基因型，能夠大幅縮短藥敏試驗時間，便于及時用藥治療，對控制耐藥結核病的傳播有重要意義。

分子線性探針雜交；異煙胼；利福平；耐藥

結核病(Tuberculosis，TB)是威脅全球公共衛(wèi)生的常見感染性疾病。近年來隨著國家加大對結核病的防控力度，結核病得到了一定程度的遏制；但耐藥結核病卻成了結核病的三大難題之一，耐藥結核病的控制面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，細菌學檢查仍是耐藥結核病診斷的主要手段，但由于傳統(tǒng)細菌學方法耗時較長，一般需要2-3個月才能最終診斷為耐藥結核病，這為耐藥結核病的防控提出了巨大挑戰(zhàn)。因此，耐藥結核病的早期診斷和及時治療對耐藥結核病的防控具有重要意義。

隨著醫(yī)學技術的發(fā)展，分子生物學方法在耐藥結核病診斷中的應用，極大縮短了耐藥結核病的診斷時間，為耐藥結核病的早期診斷方法的提供依據。線性探針技術(簡稱LPA)是近年來國家在全國推廣的耐多藥結核病快速診斷方法之一，我省已在16個市進行推廣。為評價這種方法的應用效果，本研究組在2015年度對安徽省胸科醫(yī)院415例培養(yǎng)陽性肺結核患者進行快速檢測耐多藥肺結核，并與傳統(tǒng)結核菌培藥敏試驗作對照分析，結果如下。

資料與方法

一、材料和試劑

2015年我院培養(yǎng)陽性的415例臨床肺結核患者標本。試劑采用MTBDR-Plus Kit(Hain life science．Germany)，高保真熱啟動酶(HotStar Taq酶) ，按試劑盒說明書操作。

二、研究方法

1. 采用病例對照方法 對所有病人培養(yǎng)陽性標本進行傳統(tǒng)藥敏試驗和線性探針技術檢測，臨床標本的藥敏試驗參照《結核病實驗室檢驗規(guī)程》[1]

2. 核酸提取 挑取1接種環(huán)菌，加500μL無菌蒸餾水中，充分混懸沉淀，85℃金屬浴20 min滅活。13000g離心5min棄上清，加500μL無菌蒸餾水重懸，13000g離心5min棄上清，加100μL無菌蒸餾水，95℃金屬浴20 min， 37kHz 80W超聲15 min，13000g離心5 min后；將上清轉移到另一管。5μL用于PCR擴增，剩余-20℃保存?zhèn)溆?/p>

3. PCR擴增和雜交 準備含有DNA聚合酶的擴增體系45μL,加5μL提取的DNA模板。上機擴增：95℃ 15 min；95℃ 30s，58℃ 2 min，10個循環(huán)；95 ℃ 25s，53℃ 40s，70℃ 40s，20個循環(huán)；70℃ 8min；4℃ 1h。直接取擴增產物2μL進行化學變性后，與帶有探針固化的試紙條在GT48全自動雜交儀進行顯色反應。

三、結果分析

結果判定(見圖1)。RFP和INH突變檢測圖示，其中有4個質控探針，23個檢測探針。當任一基因的野生位點出現(xiàn)顯色缺失，或者突變位點有顯色時，判定為耐藥：野生位點未缺失，突變位點未顯色，判定為敏感。如果質控探針或tub對照條帶缺失，需要重復實驗。

圖1 RFP和INH突變示意圖

四、統(tǒng)計學方法

應用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0對兩種方法檢測結果一致性的Kappa值進行判別，若Kappa值≥0.75，表示兩種方法取得相當滿意的一致性，0.75> Kappa值≥0.4，表示兩種方法的一致性比較滿意，若Kappa值<0.4，表示兩種方法的一致性不夠理想。

結 果

一、線性探針技術檢測利福平和異煙肼耐藥性的性能以絕對濃度法藥敏結果為準。線性探針技術檢測利福平和異煙肼的靈敏度為91.43%和75.68%，利福平和異煙肼的特異性分別為94.20%和95.89%，兩種方法檢測RFP和INH耐藥性的kappa值分別為0.830和0.731，(見表1、2)。

二、線性探針技術檢測耐多藥的性能以絕對濃度法藥敏結果為準。線性探針技術的靈敏度為75.44%，特異性分別為95.25%，兩種方法檢測MDR-TB的kappa值為0.692(見表3)；兩種方法用于MDR的檢測無顯著性差異，(見表3)。

表1 兩種方法檢測415例患者RFP耐藥情況

表2 兩種方法檢測415例患者INH耐藥情況

表3 兩種方法檢測415例患者耐多藥情況

三、通過線性探針技術檢測出的rpoB耐藥基因80%以上的突變主要分布在WT7、WT8和MUT3(S531L)[2-3](見表4)。

討 論

我國2007-2008年結核病耐藥性基線調查和第五次全國結核病流行病學調查顯示[4-5]，結核病耐藥性已經成為目前結核病防治中的難題，根據WHO公布的數據，我國耐藥結核病的控制仍有巨大提升空間，耐藥結核病已成為我國結核病的控制難題，國家結核病防治在“十三”期間已將耐藥結核病列為三大難點之一。有研究顯示，耐藥結核病的流行病學主要是通過人群之間傳播[6]；因此耐藥結核病的早期診斷和治療對控制傳播有重要意義。

表4 rpoB耐藥基因分布

目前，我國基層結核病實驗室對于耐藥結核病的診斷主要仍依賴細菌學診斷，傳統(tǒng)的藥敏試驗花費時間較長，一般需要4周時間才能得到藥敏結果，在耐多藥肺結核患者的早期診斷上無法發(fā)揮作用，滿足不了臨床需求。隨著分子生物學方法的發(fā)展，近年來涌現(xiàn)出很多基于PCR原理的方法用于結核分枝桿菌的耐藥性檢測，線性探針方法是其中之一，該方法可以直接檢測涂陽痰標本，可在8小時左右完成結核分枝桿菌耐藥性檢惻，極大的縮短了耐藥性檢測時間，能夠及時為臨床診斷提供科學依據[7-9]。

本研究采用臨床結核病人的培養(yǎng)物作為標本，經過提取核酸DNA進行PCR擴增后，通過反相雜交方法檢測結核分枝桿菌耐藥基因的突變。研究結果顯示，線性探針方法檢測利福平和異煙肼的靈敏度分別為91.43%和75.68%，特異性分別為94.20%和95.89%，與李強等研究結果相似[10-11]，可以較大限度的發(fā)現(xiàn)耐藥結核病人。在兩種方法的一致性分析中可以看出，HAIN在檢測RFP的耐藥性有著相當滿意的一致性，在檢測INH和發(fā)現(xiàn)MDR病人是有著比較滿意的一致性。

此外，LPA方法檢測耐多藥結核病的陽性率達到14.46%、傳統(tǒng)藥敏法是13.73%，二者差異無統(tǒng)計學意義。

本研究顯示LPA方法檢測耐多藥結核病的陽性率略高于傳統(tǒng)方法，經復做兩項檢測后，HAIN的重復性很高。與傳統(tǒng)方法比較，傳統(tǒng)方法可能存在技術方面的缺陷，受各方面因素的影響，而LPA方法比較直觀，按照標準操作程序操作，可將影響因素控制在一定范圍以內。此外，LPA方法的檢測報告時間大為縮短，可作為耐藥結核病快速檢測的理想方法，可以為耐多藥結核病人的早期診斷和治療提供了技術保證。

有研究提示，耐RFP的患者約有70%是耐多藥病人[12-13]，WHO建議通過檢測RFP來完成對耐多藥病人的快速篩查。本研究顯示，我院RFP耐藥的rpoB基因主要突變位點在WT8、WT7和MUT3，如表4所示，說明我院RFP的主要耐藥基因的突變位點可能存在于526-533位，最常見是H526Y 和S531L突變。這些主要基因突變位點的分布，可為以后的基因檢測方法的選擇提供參考，可以據此選擇有針對性的方法來進行耐多藥病人的快速篩查[14]。

綜上所述，線形探針技術具有時間短、靈敏度高、特異度好的特點，能夠為耐多藥結核病的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供診斷依據。但由于線性探針檢測技術需要特殊設備和環(huán)境，操作技術和防污染措施要求嚴格，實驗室必須是經過衛(wèi)生部臨檢中心驗收過的基因擴增診斷實驗室才能開展臨床檢測工作，檢測人員同樣需要經過培訓、嚴格按照標準化程序進行操作，按照基因擴正實驗室的要求，儀器設備和耗材要做到專區(qū)專用，避免交叉污染，只有滿足以上要求，線性探針技術才能作為耐多藥結核病的快速診斷技術，才能更加有效的保護健康人群，在控制耐多藥結核病疫情等方面才具有重大意義[15]。

[1] 中國防癆協(xié)會基礎專業(yè)委員會．結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程[M]．北京：中國教育文化出版社，2006．

[2] Telenti A, Imboden P, Marchesi F,et al. Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis[J]. Lancet, 1993, 341(8846):647-650.

[3] Spinato J, lyse Boivin, milie Bélanger-Trudelle,et al. Genotypic characterization of drug resistant mycobacterium tuberculosisin Quebec 2002-2012[J]. BMC Micr, 2016, 16(1):164.

[4] 王勝芬，趙冰，宋媛媛,等，我國耐藥結核病的危險因素—2007年全國結核病耐藥基線調查資料分析[J].中國防癆雜志，2013, 35(4)：221-226.

[5] 全國第五次結核病流行病學抽樣調查技術指導組 ,全國第五次結核病流行病學抽樣調查辦公室. 2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告[J].中國防癆雜志，2012,34(8)：485-508.

[6] Yang C, Luo T, Shen X,et al. Transmission of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China: a retrospective observational study using whole-genome sequencing and epidemiological investigation[J/OL]. www.thelancet.com/infection Published online December 2, 2016, http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(16)30418-30422.

[7] Jin J,Zhang Y,Fan X,et al. Evaluation of the GenoType(R)MTBDRplus assay and identification of a rare mutation for improving MDR-TB detection[J]. Int J Tuberc Lung Dis,2012,16(4) : 521-526.

[8] Huyen MN,Tiemersma EW,Lan NT,et al. Validation of the GenoType MTBDRplus assay for diagnosis of multidrug resistant tuberculosis in South Vietnam[J]. BMC Infect Dis,2010,10(1):149.

[9] Singhal R, Myneedu VP, Arora J, et al. Detection of multidrug resistance & characterization of mutations in Mycobacterium tuberculosis isolates from North-EasternStates of India using GenoType MTBDRplus assay[J]. Indian J Med Res,2014,140(4) :501-506.

[10] 李強，趙雁林．197例臨床結核分枝桿菌分離株的快速耐藥性檢測報告[J]．中國防癆雜志，2009，31(12)：709-712．

[11] 汪明，袁樂永，劉樂,等，MTBDRplus方法快速檢測結核分枝桿菌耐藥性的研究[J].國際呼吸雜志，2015,35(21)：1601-1605

[12] 陰靈芳，孫惠平，周永,等，耐利福平作為篩選耐多藥結核病指標的評估[J].臨床肺科雜志,2013.18(9)：1656-1658.

[13] 賴慧芹，陳笑冰,結核分枝桿菌利福平敏感性測定在耐多藥結核病診斷中的價值[J],國際醫(yī)藥衛(wèi)生導報，2006,12(16)：99-102

[14] World Health Organization．Policy statement．molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk of multi-drug resistant tuberculosis (MDR-TB) ，2008[EB/OL]．http：//www．who．int/tb/dots/laboratory/lpa - policy.pdf．

[15] 李強，夏輝，歐喜超,等，應用線性探針技術與傳統(tǒng)藥敏試驗檢測耐藥結核病的成本比較[J]，中國防癆雜志，2013,35(3)：187-190.

Application of LPA method in analysis of multi-drug resistant TB

BAOXun-di,WANGChao,KANXiao-hong,WANGQing.

DepartmentofLabrtory,AnhuiChestHospital,Hefei,Anhui230022,China

Objective To evaluate the application of molecular linear probe hybridization method (LPA) in rapid detection of multi-drug resistant tuberculosis. Methods It used LPA to detect 415 cases of mycobacterium tuberculosis clinical isolates. At the same time, it also used conventional DST method to detect the samples. Results The sensitivity and specificity of RFP and INH clinical isolates was 91.43% and 94.2%, and 75.68% and 95.89% respectively by LPA method, and the value of kappa was 0.830 and 0.731 for the two methods. The sensitivity and specificity of MDR by PLA method was 75.44% and 95.25% respectively, and the kappa value was 0.692. The mutant resistant strains of RFP mainly distributed in WT7, WT8 and MUT3 (S531L). Conclusion LPA method can detect RFP and INH drug resistance and other common resistant genes rapidly and accurately, which means it can sharply reduce the susceptibility test time for timely clinical drug treatment.

LPA; INH; RFP; drug resistance

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.002

安徽省衛(wèi)計委課題(No 15tb011)；安徽省胸科醫(yī)院課題(No xk2015010)

230022 安徽 合肥，安徽省胸科醫(yī)院檢驗科

王慶，E-mail：ahtbwangqing@163.com

2017-03-04]