鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型的優(yōu)化與適用性研究

樊嬌嬌 李發(fā)榮 趙崇軍 徐柯心 楊冉 喬藝涵 倪媛媛 王雨彤 馬志強(qiáng) 林瑞超

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鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型的優(yōu)化與適用性研究

樊嬌嬌 李發(fā)榮 趙崇軍 徐柯心 楊冉 喬藝涵 倪媛媛 王雨彤 馬志強(qiáng) 林瑞超

目的 優(yōu)化鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型的條件，并考察此模型在中藥抗血栓活性篩選中的適用性。方法 應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)，以斑馬魚尾靜脈紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度為定量指標(biāo)，考察鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型的最佳條件。利用該模型，對(duì)臨床常用的11味中藥的抗血栓活性進(jìn)行篩選，探討該模型在中藥抗血栓活性篩選中的適用性與可靠性。結(jié)果 鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型的最佳條件為：受精后3天(3 dayspost fertilization，3dpf)的斑馬魚在濃度為15 μmol/L鹽酸腎上腺素溶液中暴露16小時(shí)。9味活血化瘀中藥川芎、郁金、延胡索、丹參、紅花、虎杖、三棱、莪術(shù)、水蛭在斑馬魚血栓模型中表現(xiàn)出顯著的預(yù)防和治療血栓作用，而甘草和黨參兩味中藥在斑馬魚血栓模型中未表現(xiàn)出預(yù)防和治療血栓的作用。結(jié)論 鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)建立的斑馬魚血栓模型在中藥抗血栓活性的篩選與療效評(píng)估中具有良好的適用性。

鹽酸腎上腺素； 斑馬魚血栓模型； 定量； 抗血栓活性； 藥物篩選

Correspondinganthor：LINRuichao,E-mail:linrch307@sina.com

血栓形成是導(dǎo)致心腦血管疾病的重要因素，此類疾病嚴(yán)重威脅人類健康，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全世界每年約有2300萬(wàn)人死于血栓性疾病[1]。活血化瘀中藥具有良好的抗血栓活性，從中藥中篩選出較好的抗血栓物質(zhì)，進(jìn)行藥物研發(fā)，已引起國(guó)內(nèi)的普遍重視。目前抗血栓藥物的篩選主要采用體外凝血實(shí)驗(yàn)和傳統(tǒng)的嚙齒類動(dòng)物在體血栓模型，前者只能針對(duì)其中部分靶點(diǎn)[2]，難以模擬體內(nèi)血栓發(fā)生的真實(shí)情況；后者在進(jìn)行活性篩選時(shí)，操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)、費(fèi)用高，尚不適用于抗血栓藥物的大規(guī)模篩選[3]。因此，開發(fā)出操作便捷、準(zhǔn)確、高通量，并與臨床病理生理機(jī)制相似的的血栓模型具有重大的意義[4]。

斑馬魚作為一種新的動(dòng)物模型，與人類基因相似度高達(dá)87%，且繁殖能力強(qiáng)，發(fā)育周期短，養(yǎng)殖成本低，并且早期幼魚透明，可在顯微鏡下直接觀察斑馬魚的血液流動(dòng)情況[5]，已廣泛應(yīng)用于藥物毒性和活性方面的研究。本課題組利用鹽酸腎上腺素成功建立了斑馬魚血栓模型，此模型既能克服體外凝血實(shí)驗(yàn)的弊端，又能實(shí)現(xiàn)高通量篩選。本研究應(yīng)用正交試驗(yàn)，以斑馬魚尾靜脈紅細(xì)胞染色強(qiáng)度為定量指標(biāo)，優(yōu)化鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型的建模條件，并通過斑馬魚尾靜脈組織病理學(xué)檢查，進(jìn)一步驗(yàn)證該血栓模型的形成。利用此模型，篩選川芎、丹參、甘草等中藥的抗血栓活性，探討此模型在中藥抗血栓活性研究中的適用性，期望為抗血栓藥物的篩選與新藥研發(fā)提供高通量和重復(fù)性良好的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鹽酸腎上腺素(adrenaline hydrochloride，AH)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：Y03J7C15662；阿司匹林(aspirin)購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：50-78-2；鄰聯(lián)茴香胺購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：119-90-4；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自西隴化工股份有限公司，批號(hào)：160306；NaCl購(gòu)自北京化工，批號(hào)20150905；KCl購(gòu)自北京化工，批號(hào)20151203；K2HPO4購(gòu)自西隴化工，批號(hào)：7758-11-4；Na2HPO4購(gòu)自北京化工，批號(hào)20150814；NaHCO3購(gòu)自北京化工，批號(hào)20160521；MgSO4購(gòu)自西隴化工，批號(hào)：7487-88-9；CaCl2購(gòu)自西隴化工，批號(hào)：10035-04-8。

斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技公司)，1000 μL、5000 μL移液器 (eppendorf)，恒溫培養(yǎng)箱LRH-250Z(廣州瑞明儀器有限公司)，真空干燥箱DZF-6050B(上海恒科學(xué)儀器有限公司)，體視顯微鏡SMZ64(株式會(huì)社尼康)，微循環(huán)觀測(cè)系統(tǒng)Eclipse Lv100No(株式會(huì)社尼康)，生物熒光顯微鏡80i(株式會(huì)社尼康)。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品的制備

川芎、延胡索、郁金、丹參、紅花、虎杖、莪術(shù)、三棱、水蛭、甘草、黨參各30 g，均購(gòu)自北京同仁堂有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015版要求。中藥水提液制備方法為：取藥材飲片粉碎，過40目篩，稱取約100 g藥材粉末，加入10倍量的水，回流提取2次，每次2 小時(shí)，過濾，濃縮，真空干燥。

胚胎培養(yǎng)水的配制：按照Z(yǔ)ebrafish Book[6]的標(biāo)準(zhǔn)，配制NaCl濃度為0.137 mol/L、 KCl濃度為5.4 mol/L、Na2HPO40.25 mol/L、K2HPO40.44 mol/L、CaCl21.3 mol/L、MgSO41.0 mol/L、NaHCO34.2 mol/L的水溶液。

鄰聯(lián)茴香胺染色液的配制：精密稱取鄰聯(lián)茴香胺30 mg、醋酸鈉41 mg，置于50 mL容量瓶中，加35%的過氧化氫溶液0.11 mL，再用40%的乙醇定容，搖勻。

1.3 斑馬魚的養(yǎng)殖

AB系野生型斑馬魚和血小板熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚(CD41：GFP)均購(gòu)自于國(guó)家斑馬魚中心，由本實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)，參照Westerfield等[6-7]的方法繁殖，水溫 27.5～28.5℃，電導(dǎo)率 450～850 μS/cm，pH值6.8～7.2，明/暗周期為14 h /10 h。挑選健康性成熟的斑馬魚，按雌雄1∶2的比例放入交配缸內(nèi)，次日清晨獲得胚胎，用胚胎培養(yǎng)水進(jìn)行清洗，除去死卵，放入28℃下恒溫控光培養(yǎng)箱，每日更換胚胎培養(yǎng)水兩次。

1.4 單因素考察

鹽酸腎上腺素濃度的單因素考察：在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的5 dpf斑馬魚幼魚，并將其隨機(jī)放入含有不同濃度AH溶液的6孔板中，每孔30條，每組1孔。依據(jù)AH對(duì)斑馬魚幼魚的最大非致死濃度，確定AH的濃度為5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L，置于28.5℃恒溫生化培養(yǎng)箱中16小時(shí)。取不同親本的幼魚重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

定性分析：在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，從每組隨機(jī)抽取10條斑馬魚，用質(zhì)量濃度為0.3%的三卡因?qū)⒂佐~麻醉，用自制的發(fā)圈將幼魚取出，側(cè)位放置于雙凹載玻片上，用熒光顯微鏡觀察斑馬魚體內(nèi)血小板的聚集情況，進(jìn)行直觀定性分析。

定量分析：從每組隨機(jī)抽取10條斑馬魚，用鄰聯(lián)茴香胺染色液進(jìn)行染色，用發(fā)圈將幼魚取出，側(cè)位放置于雙凹載玻片上，置于顯微鏡下對(duì)尾部進(jìn)行拍照。利用Image-Pro Plus 6圖像處理軟件，統(tǒng)計(jì)尾部靜脈紅細(xì)胞染色強(qiáng)度，進(jìn)行定量分析。

誘導(dǎo)時(shí)間的單因素考察：在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的5 dpf斑馬魚幼魚，并將其隨機(jī)放入含有AH溶液(濃度：15 μmol/L)的6孔板中，每孔30條，每組1孔，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定誘導(dǎo)時(shí)間為4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)，取不同親本的幼魚重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，定性定量分析同上。

1.5 正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素考察的結(jié)果，選取AH的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的3個(gè)水平。根據(jù)斑馬魚的發(fā)育規(guī)律(斑馬魚在36 hpf時(shí)表達(dá)出功能性血小板和凝血因子[8-10]，72 dpf完全孵化，7 dpf之內(nèi)可以從卵黃獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，無需喂食[6])，選取斑馬魚魚齡的3個(gè)水平，見表1，分別以斑馬魚尾靜脈血小板的聚集情況和紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度為定性、定量指標(biāo)，進(jìn)行L9(3^4)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化造模條件，見表2，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差與方差分析。

在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的3 dpf、5 dpf、7 dpf斑馬魚幼魚，并將其隨機(jī)放置在含有3 mL胚胎培養(yǎng)水的6孔板中[6,11]，每孔30條，每組1孔，分為10組，1個(gè)空白組，空白組為胚胎培養(yǎng)水。根據(jù)正交表設(shè)計(jì)9個(gè)模型組，取不同親本的幼魚重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，定性定量分析同1.4。

表1 因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.6 組織病理學(xué)檢查

進(jìn)行斑馬魚尾靜脈組織病理學(xué)檢查，進(jìn)一步驗(yàn)證AH誘導(dǎo)斑馬魚尾靜脈血栓的形成。3 dpf的斑馬魚在濃度為15 μmol/L鹽酸腎上腺素溶液中暴露16小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，將斑馬魚浸泡并固定在中性福爾馬林溶液(10%的甲醛溶液)中，再用發(fā)圈將幼魚取出，并用不同濃度梯度的乙醇溶液進(jìn)行脫水，石蠟包埋，縱向切片，蘇木精和伊紅(HE)染色[3]。

1.7 鹽酸腎上腺素誘導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型的重復(fù)性檢驗(yàn)

選取5個(gè)不同親本的斑馬魚幼魚，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行建模，定性定量分析同1.4。

1.8 斑馬魚血栓模型在中藥抗血栓活性篩選中的適用性

在中藥預(yù)防血栓形成活性篩選中的適用性：利用AH誘導(dǎo)建立的斑馬魚血栓模型，篩選9味現(xiàn)已報(bào)道有抗血栓作用[12-14]的中藥(川芎、郁金、延胡索、丹參、紅花、虎杖、莪術(shù)、三棱、水蛭)和2味臨床常用的中藥(甘草、黨參)預(yù)防血栓形成的活性。在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的5 dpf斑馬魚幼魚，隨機(jī)放置在含有3 mL胚胎培養(yǎng)水的6孔板中，每孔30條，每組1孔，分為14組，空白組為胚胎培養(yǎng)水，模型組為15 μmol/L的AH，陽(yáng)性對(duì)照組為15 μmol/L的AH 和15 ug/mL阿司匹林的混合液，給藥組為15 μmol/L的AH和測(cè)試藥物(濃度如表5)，暴露處理16小時(shí)，取不同親本的幼魚重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，定性定量分析同1.4。

在中藥治療血栓活性篩選中的適用性：利用AH誘導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型，篩選上述11味中藥治療血栓的活性。在體視顯微鏡下挑選發(fā)育正常的5 dpf斑馬魚幼魚，隨機(jī)放置在含有3 mL胚胎培養(yǎng)水的6孔板中，每孔30條，每組1孔，分為14組，先將斑馬魚暴露在15 μmol/L的AH 溶液中16小時(shí)，再將模型組更換為胚胎培養(yǎng)水，給藥組更換為所測(cè)試藥物的樣品溶液(濃度如表5)，陽(yáng)性對(duì)照組更換為15 ug/mL的阿司匹林溶液，放置于28.5℃恒溫生化培養(yǎng)箱中16小時(shí)，取不同親本的幼魚重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，定性定量分析同1.4。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 單因素考察

鹽酸腎上腺素濃度的單因素考察：低濃度時(shí)，斑馬魚尾靜脈紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度與AH濃度成正相關(guān)，15 μmol/L時(shí)尾靜脈紅細(xì)胞的的染色強(qiáng)度最大，20 μmol/L時(shí)尾靜脈紅細(xì)胞的染色出現(xiàn)下降趨勢(shì)，25 μmol/L時(shí)尾靜脈紅細(xì)胞的染色大幅度下降(如圖1A所示)，并且斑馬魚出現(xiàn)游動(dòng)緩慢、側(cè)位、心包水腫的現(xiàn)象，因此選取10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L三個(gè)水平。

誘導(dǎo)時(shí)間的單因素考察：4小時(shí)至16小時(shí)，尾靜脈紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度與誘導(dǎo)時(shí)間成正相關(guān)，在16小時(shí)尾靜脈紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度最大，并逐漸趨于平穩(wěn)(如圖1B所示)，因此選取12小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)三個(gè)水平。

圖1 AH濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)尾靜脈血栓形成的影響

2.2 斑馬魚尾靜脈血栓的定性分析

在顯微鏡下對(duì)斑馬魚尾靜脈血栓進(jìn)行直觀觀察并拍照，如圖2所示，空白組(A)斑馬魚無血栓形成，模型組(B)斑馬魚形成嚴(yán)重血栓，陽(yáng)性對(duì)照組(C)斑馬魚有少量血栓形成。

圖2 斑馬魚尾靜脈紅細(xì)胞鄰聯(lián)茴香胺染色圖

在熒光顯微鏡下對(duì)斑馬魚尾靜脈血小板的聚集進(jìn)行直觀觀察并拍照，如圖3所示，空白組(A)斑馬魚的血小板在血管內(nèi)沒有出現(xiàn)聚集的現(xiàn)象，模型組(B)斑馬魚的血小板有大量聚集的現(xiàn)象，陽(yáng)性對(duì)照組(C)斑馬魚的血小板有少量的聚集。

圖3 斑馬魚尾靜脈血小板熒光聚集圖

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

如表3所示，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，見表3，對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行方差分析，見表4。由表3可知，極差RA>RB>RC，即AH的濃度是影響血栓形成的主要影響因素，其次是誘導(dǎo)時(shí)間和魚齡。根據(jù)各因素的K值可知，最佳組合為A2B2C3。由表4可知，AH的濃度對(duì)血栓形成有顯著性差異，誘導(dǎo)時(shí)間和魚齡對(duì)血栓形成無顯著性差異，并且魚齡3個(gè)水平的極差較小，因此，可以選取3 dpf的斑馬魚幼魚進(jìn)行造模，以減少養(yǎng)殖時(shí)間與實(shí)驗(yàn)周期。以此條件建立的血栓模型，斑馬魚游動(dòng)正常，無明顯的畸形和臟器毒性。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

2.4 斑馬魚尾靜脈組織病理學(xué)檢查

由圖4可知，空白組(A)斑馬魚尾靜脈血管內(nèi)紅細(xì)胞無聚集現(xiàn)象，模型組(B)斑馬魚尾靜脈血管內(nèi)紅細(xì)胞出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。

圖4 斑馬魚尾靜脈組織HE染色圖

2.5 重復(fù)性考察

五次尾靜脈紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度分別為294.73、289.85、299.12、317.49、302.85 ，RSD為1.16%，小于5%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AH誘導(dǎo)建立的斑馬魚血栓模型的重復(fù)性良好。

2.6 斑馬魚血栓模型在中藥抗血栓活性篩選中的適用性

采用非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由表5可知，與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組斑馬魚尾靜脈紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度明顯減少，并有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。在中藥預(yù)防血栓形成活性篩選的實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，丹參、紅花、虎杖、三棱、水蛭組斑馬魚尾靜脈紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度減少(P<0.01)，表現(xiàn)出明顯抑制血栓形成的活性，川芎、郁金、延胡索、莪術(shù)組斑馬魚尾靜脈紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度也減少(P<0.05)，有抑制血栓形成的活性。在中藥治療血栓活性篩選的實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，川芎、丹參、紅花、虎杖、三棱、水蛭組斑馬魚尾靜脈紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度減少，并有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，有明顯治療斑馬魚血栓的活性。郁金、延胡索、莪術(shù)組斑馬魚尾靜脈紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度也減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表現(xiàn)出治療血栓的活性。但在預(yù)防與治療實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，甘草、黨參組斑馬魚尾靜脈紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度都未減少(P>0.05)，未表現(xiàn)出抗血栓的活性。因此，AH誘導(dǎo)建立的斑馬魚血栓模型可以對(duì)抗血栓藥物的活性進(jìn)行篩選與評(píng)估。

表5 不同中藥對(duì)斑馬魚血栓的預(yù)防與治療作用比較±s)

注： 與模型組相比，aP< 0.05，bP< 0.01。

3 討論與分析

斑馬魚與人類基因相似度高達(dá)87%，在心血管系統(tǒng)不完善的情況下，仍可以存活，并且Williams等[15]研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚血液系統(tǒng)與人類血液系統(tǒng)的血小板和凝血因子有許多共同的特點(diǎn)，因此逐步成為了研究血栓和抗血栓藥物篩選的模型生物。本研究旨在優(yōu)化AH誘導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型的建模條件，并研究此模型在中藥抗血栓活性的篩選與療效評(píng)估中的適用性。

實(shí)驗(yàn)選取了AH的濃度，誘導(dǎo)時(shí)間，魚齡三個(gè)因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，考察AH誘導(dǎo)建立斑馬魚血栓模型的最佳條件，即3 dpf的斑馬魚在濃度為15 μmol/L AH溶液中暴露16小時(shí)，在此條件下所建的斑馬魚血栓模型重復(fù)性良好，RSD為1.16%，小于5.0%，結(jié)果表明，正交實(shí)驗(yàn)在斑馬魚建模條件的篩選實(shí)驗(yàn)中具有良好的適用性。

斑馬魚早期幼魚透明，可在體視顯微鏡下對(duì)尾靜脈血栓形成進(jìn)行可視化追蹤與定性分析，結(jié)果顯示，AH可以引起斑馬魚血流速度減慢，血小板聚集增多，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[16-17]，并且尾靜脈血栓形成的大小與尾靜脈紅細(xì)胞的染色強(qiáng)度相一致。斑馬魚尾靜脈組織病理學(xué)診斷顯示，模型組紅細(xì)胞聚集明顯增多，進(jìn)一步驗(yàn)證了AH誘導(dǎo)斑馬魚尾靜脈血栓。因此，AH誘導(dǎo)建立的斑馬魚血栓模型可以較好地模擬人類疾病狀態(tài)下血栓的發(fā)生，用于體內(nèi)血栓形成的研究。

活血化瘀類中藥具有較好的抗血栓作用，在臨床實(shí)踐中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用與驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)利用AH誘導(dǎo)建立的斑馬魚血栓模型對(duì)11味中藥進(jìn)行抗血栓活性篩選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，9味活血化瘀中藥在斑馬魚血栓模型中表現(xiàn)出顯著的抗血栓的作用，甘草、黨參在斑馬魚血栓模型中未表現(xiàn)出抗血栓的作用，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[18-19]。本模型是基于整體動(dòng)物建立的在體血栓模型，符合中藥治療的整體性作用特點(diǎn)，對(duì)于中藥抗血栓的活性篩選與評(píng)價(jià)尤為適用。實(shí)驗(yàn)后期將利用此模型研究活血化瘀中藥的抗血栓物質(zhì)基礎(chǔ)與機(jī)制，并考察此模型在活血化瘀藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中的適用性，以期為活血化瘀中藥的生物活性評(píng)價(jià)提供一種新的方法。

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(本文編輯： 韓虹娟)

Optimization and adaptability of the zebrafish thrombosis model induced by Adrenaline Hydrochloride

FANJiaojiao，LIFarong，ZHAOChongjun，etal.

BeijingKeyLaboratoryofTraditionalChineseQualityEvaluation，SchoolofChineseMateriaMedica，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China

Objective To optimize the conditions of the zebrafish thrombosis model induced by Adrenaline Hydrochloride, and investigate the adaptability of the model in antithrombotic activity screening of traditional Chinese medicine. Methods This study applied orthogonal experiment to inspect the optimum conditions of the zebrafish thrombosis model induced by Adrenaline Hydrochloride. Quantitative index was quantitatively evaluated by the dyeing strength of zebrafish tail vein red blood cells. The model was used to screen the antithrombotic activity of 11 herbs, and applicability and reliability was discussed. Results Zebrafish at 3dpf(days post-fertilization，3dpf)treated with Adrenaline Hydrochloride at a concentration of 15 μmol·L-1for a time period of 16 hours were determined as the optimum conditions for the zebrafish thrombosis model development. 9 kinds of traditional Chinese medicine with invigorating blood circulation and eliminating blood stasis, such as, Salvia miltiorrhiza, Sparganii Rhizoma, Ligusticum chuanxiong Hort, etc showed significant preventive and therapeutic effects on zebrafish thrombosis model. However, Glycyrrhizae Radix and Codonopsis pilosula did not display the effect on this zebrafish thrombosis model. Conclusion Zebrafish thrombosis model induced by Adrenaline Hydrochloride has good applicability in antithrombotic activity screening and efficacy assessments of traditional Chinese medicine.

Adrenaline Hydrochloride; Zebrafish thrombosis model; Quantitative; Antithrombotic activity; Drug screening

北京市科委創(chuàng)新環(huán)境與平臺(tái)建設(shè)專項(xiàng)(Z16111000500000)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)局北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[樊嬌嬌(碩士研究生)、趙崇軍(博士研究生)、徐柯心(碩士研究生)、楊冉(碩士研究生)、喬藝涵(碩士研究生)、倪媛媛(碩士研究生)、王雨彤(碩士研究生)、馬志強(qiáng)、林瑞超]；陜西師范大學(xué)(李發(fā)榮)

樊嬌嬌(1989- )，女，2014級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：中藥毒性與活性。E-mail：276050202@qq.com

林瑞超(1954- )，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥、天然藥物的質(zhì)量控制方法的研究。E-mail：linrch307@sina.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.06.006

2016-09-19)