藥用植物寧夏枸杞 (Lycium barbarum L.) 土壤細(xì)菌群落演替特征

張俊華，張翼，李明

藥用植物寧夏枸杞 (Lycium barbarum L.) 土壤細(xì)菌群落演替特征

張俊華1，張翼2，李明1

（1 寧夏大學(xué)環(huán)境工程研究院，寧夏銀川 750021；2 寧夏大學(xué)教育學(xué)院，寧夏銀川 750021）

【目的】研究土層、季節(jié)和樹齡對寧夏枸杞土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，對揭示枸杞種植區(qū)域土壤質(zhì)量變化規(guī)律具有重要意義?！痉椒ā恳詫幭蔫坭街l(xiāng)—寧夏回族自治區(qū)中寧縣為研究區(qū)，采用高通量測序分析了不同土層、季節(jié)和樹齡條件下枸杞土壤細(xì)菌生物量及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和豐度的變化趨勢?！窘Y(jié)果】隨著枸杞樹齡增加，與幼齡 (種植當(dāng)年，< 1 年) 枸杞土壤相比，春季和夏季 0—20 cm 中齡 (6 年) 和老齡 (12 年) 土壤總有機(jī)碳(total organic carbon，TOC) 及 0—40 cm 土壤總有機(jī)氮 (total organic nitrogen，TON) 含量先增加后減少；春季不同樹齡 0—20 cm 土壤微生物生物量碳 (microbial biomass carbon，MBC)和微生物生物量氮(microbial biomass nitrogen，MBN)一直增加，但春季和秋季 20—40 cm 則呈相反趨勢。夏季中齡植株表層土壤 MBC 最高，但MBN 卻最低。隨著樹齡增加，枸杞表層土壤細(xì)菌多樣性普遍呈先增加后減小的趨勢。枸杞土壤變形菌門Proteobacteria、放線菌門 Actinobacteria、擬桿菌門 Bacteroidete 在細(xì)菌群落中占絕對優(yōu)勢。相同季節(jié)老齡土壤Proteobacteria 相對豐度普遍高于幼齡和中齡，幼齡土壤 Planctomycetes 和綠彎菌門 Chloroflexi 豐度高于中齡和老齡。變形桿菌中黃色單胞菌 Xanthomonadales、紅桿菌 Rhodobacterales 和根瘤菌 Rhizobiales 占主導(dǎo)地位，尤其是在秋季中齡和 3 個(gè)季節(jié)的老齡枸杞土壤。土層、季節(jié)和樹齡對土壤微生物數(shù)量影響不同?！窘Y(jié)論】隨著樹齡增加，寧夏枸杞表層土壤微生物生物量和細(xì)菌多樣性呈先增加后降低的趨勢。老齡植株土壤 Xanthomonadales數(shù)量相對最多。土層對枸杞土壤碳分布有極顯著影響，樹齡主要顯著影響土壤氮源和細(xì)菌群落多樣性，季節(jié)對枸杞土壤碳源、微生物量碳氮均有極顯著影響。

寧夏枸杞；細(xì)菌群落；多樣性；季節(jié)；土層；樹齡

土壤微生物能夠影響許多生態(tài)過程、參與生物地球化學(xué)循環(huán)，如有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化與循環(huán)[1]，故其多樣性對生態(tài)功能的維持至關(guān)重要。植物種類在養(yǎng)分吸收、累積、分布和回歸中充當(dāng)了一個(gè)重要角色，而土壤微生物在控制植物養(yǎng)分有效性和土壤質(zhì)量方面具有重要作用[2]。藥用植物是對人類健康非常重要的資源。在微生物方面，許多學(xué)者對不同藥用植物根際土壤組分和微生物群體、根際效應(yīng)都做了較深入研究[3–4]。也有學(xué)者對不同耕作或施肥措施下藥用植物土壤有機(jī)質(zhì)、碳氮比、微生物多樣性和功能性指數(shù)、灌木菌根真菌、微生物生物量等的差異進(jìn)行了研究[5–6]。同時(shí)，雖然許多證據(jù)顯示植物品種對根際區(qū)系、內(nèi)生菌根真菌有較大影響[7–8]，但也有研究表明土壤因素 (尤其是土壤 pH)、種植年限或植物生長階段對微生物多樣性影響較植物品種更顯著[9]。微生物與植物根系防御和植物所需養(yǎng)分的獲取密切相關(guān)，因而，有必要證明植物生長年限和發(fā)育階段對微生物的影響[10]。

枸杞 (Lycium barbarum L.) 是茄科多年生灌木，其果實(shí)、葉片、根系都是傳統(tǒng)中藥。近年來，由于長期密集型管理，寧夏枸杞在 10～15 年就會出現(xiàn)果實(shí)產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降的現(xiàn)象。因此，我們假設(shè)寧夏枸杞在生長前期和中期土壤微生物多樣性豐富，但隨著樹齡的增加，出現(xiàn)特有的土壤微生物種群并成為優(yōu)勢種群，或它們的數(shù)量達(dá)到了危害枸杞植株正常生長的程度。在此，本研究通過分析寧夏枸杞不同樹齡、不同季節(jié)、不同土層土壤微生物組成和多樣性，確定不同條件下枸杞土壤微生物細(xì)菌群落多樣性及引起土壤退化的微生物種群。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)市中寧縣，位于東經(jīng) 105°15′～106°05′，北緯 36°49′～37°47′，是中國枸杞之鄉(xiāng)，也是寧夏枸杞的主產(chǎn)區(qū)。該地區(qū)年平均氣溫 9.5℃，降水202.1 mm，日平均氣溫 ≥ 10℃ 的天數(shù)約 170 d，積溫 3200℃～3300℃。本研究在中寧縣寧安鎮(zhèn)南橋村選擇樹齡分別為幼齡 (種植當(dāng)年，< 1 年)、中齡(6 年) 和老齡 (12 年) 枸杞地各 3 塊 (每塊面積約666 m2)。該地區(qū)土壤以灌淤土為主, 質(zhì)地為砂壤土。

1.2 樣品采集

分別于春季 (枸杞展葉期，4 月 26 日)、夏季 (盛果期，7 月 14 日) 和秋季末期 (落葉期，10 月 25 日)采集土壤樣品。每塊地按 S 形選擇 9 株枸杞樹，在樹冠投影范圍內(nèi)，先去除地表枯枝落葉后，在表層(0—20 cm) 和亞表層 (20—40 cm) 取其土壤，挖取具有完整根系的土體，先輕輕抖落大塊不含根系的土壤，然后用力將根表面附著的土壤全部抖落下來，獲得目標(biāo)土壤。每塊地 9 株枸杞分別分層采樣，然后將同一地塊相同層次的土壤充分混勻，將新鮮土樣分成 2 份，一份低溫冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室，在–20℃ 下冷凍保存，用于土壤含水量和土壤微生物的測定，另一份帶回室內(nèi)風(fēng)干用于測定土壤 TOC、TON。

1.3 樣品分析

1.3.1 土壤樣品理化性狀測定 TOC 用重鉻酸鉀容量法；TON 用酸解法；微生物碳、氮 (MBC, MBN) 用氯仿熏蒸浸提法。

1.3.2 土壤 DNA 提取 每個(gè)樣品取 0.5 g 土樣提取DNA，本試驗(yàn)采用 FastDNA?SPIN Kit For Soil 試劑盒提取土壤微生物基因組 DNA，按說明書操作步驟進(jìn)行。用 1% 的瓊脂糖凝膠檢驗(yàn) DNA 純度。DNA濃度用 NanoDrop (ND-2000) 檢測。

1.3.3 illumina HiSeq 測序及數(shù)據(jù)分析 本研究目標(biāo)基因?yàn)榧?xì)菌的 16S rRNA V4 區(qū)基因片段，所用的引物為 515f (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)/806r (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。反應(yīng)體系：15μL Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs, UK)，F(xiàn)orward Primers (0.2 μmol/L)，Reverse Primers (0.2 μmol/L)，10 ngDNA 模板。PCR 反應(yīng)條件：98℃ 1 min，30 × (98℃ 10 s, 50℃ 30 s, 72℃ 60 s)，72℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物用 2% 瓊脂糖凝膠檢測，選擇位于 200～300 bp 的目標(biāo)條帶，切膠回收純化進(jìn)行下一步的分析。

用于 PCR 擴(kuò)增的引物外側(cè)都會加入一段 barcode序列進(jìn)行區(qū)分，序列為一段 6 bp 堿基的寡核苷酸序列，每個(gè)樣品用不同 barcode 序列進(jìn)行區(qū)分。Barcode 序列由上海吉美生物醫(yī)藥科技有限公司設(shè)計(jì)并合成。所得 PCR 產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后 (Qiagen 膠回收試劑盒)，用 NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc. USA) 測定濃度，等摩爾混合后采用完成文庫構(gòu)建，安排上機(jī)測序。高通量測序由諾禾致遠(yuǎn) Illumina MiSeq 2500 平臺運(yùn)行 (Beijing, China, http://www.novogene.com/index.php)，最后所測得數(shù)據(jù)在 250～300 bp 之間產(chǎn)生。

序列分析流程如下：MiSeq 測序序列首先需要得到的雙端序列數(shù)據(jù)根據(jù) PE reads 之間的 overlap 關(guān)系，使用軟件 Seqprep 將成對的 reads 拼接 (merge)成一條序列，同時(shí)對 reads 的質(zhì)量和 merge 的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，并根據(jù)序列末端的 box 序列校正序列方向，然后按照 barcode 標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到有效數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用 SAS 中 Duncan 法檢驗(yàn)不同樹齡、季節(jié)和土層枸杞土壤微生物指標(biāo)間的差異顯著性，用MANOVA 法研究土層、季節(jié)和樹齡對土壤理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)的交互影響，采用 Pearson 相關(guān)進(jìn)行土壤理化性狀與土壤微生物指標(biāo)間的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤營養(yǎng)元素和微生物生物量

隨著枸杞樹齡的增加，春季和夏季 0—20 cm 土壤 TOC 先增加后減少，夏季變幅較大 (表 1)；秋季表層和春季、夏季亞表層土壤 TOC 有逐漸降低的趨勢；亞表層土壤 TOC 變幅普遍小于表層。不同樹齡土壤 TON 差異顯著；隨著樹齡的增加，0—40 cm 土壤 TON 均顯著增加后顯著降低，中齡土壤 TON 最高，其次為老齡。夏季土壤 TOC 和 TON 普遍高于春季和秋季，秋季最低；表層高于亞表層。春季表層土壤 MBC 和 MBN 隨樹齡的增加而增加，但春季和秋季亞表層則呈相反趨勢；夏季 MBC 隨樹齡的增加先增大后減小，中齡表層土壤 MBC 最高，但MBN 卻最低，亞表層該樹齡兩者均最低。秋季土壤MBC 相對最低。春季和夏季土壤不同樹齡 MBN 差異較小，但秋季中齡土壤 MBN 顯著高于其他 2 個(gè)樹齡。微生物生物量 C/N 變化范圍很大 (0.07～9.19)，其中春季亞表層最高，秋季亞表層最低，幼齡樹土壤微生物生物量 C/N 較高 (夏季表層除外)。

2.2 不同樹齡枸杞土壤細(xì)菌群落多樣性

可操作分類單元 (operational taxonomic units，OTU) 的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度，Chao1指數(shù)和 Shannon 指數(shù)則都指示了群落多樣性、豐富度和均勻度的變化。由表 2 可以看出，春季和夏季 0—20 cm 土壤中齡土壤表層序列數(shù)、OUTs 值、Chao1和 Shannon 指數(shù)最大，老齡土壤序列數(shù)、OUTs 值、Chao1 和 Shannon 指數(shù)普遍最??；該土層秋季老齡土壤 OTUs 和 Chao1 指數(shù)最大。20—40 cm 土壤序列數(shù)和各指數(shù)沒有一致的變化趨勢。夏季土壤 OTUs、Chao1 和 Shannon 指數(shù)大于春季和秋季，表層土壤OTUs、Chao1 和 Shannon 指數(shù)大于亞表層。

2.3 不同樹齡枸杞土壤細(xì)菌群落相對豐度分析

從門的角度來計(jì)算不同微生物相對豐度 (圖 1)，表層土壤中 Proteobacteria 相對豐度最大，為 35.3%～48.4% (平均為 41.4%)；其次為 Actinobacteria，平均豐度為 13.6%；Bacteroidetes、Planctomycetes 和Chloroflexi 平均豐度也大于 7%，而 Nitrospirae 相對最低，只有 0.8%。亞表層土壤中 Proteobacteria 相對豐度依舊最大，平均為 39.6%；其次是 Actinobacteria，相對豐度為 12.3%；Nitrospirae 平均相對豐度有所增加 (1.4%)。夏季表層土壤 Proteobacteria 豐度在三個(gè)季節(jié)中最高，春季和秋季差異很小，Actinobacteria豐度在秋季相對豐度最高，春季和夏季基本持平，此外，秋季 Chloroflexi 和 Planctomycetes 豐度高于春季和夏季，春季 Firmicutes 豐度高于夏季和秋季，其它門類豐度在三個(gè)季節(jié)表層土壤中無明顯差異。夏季亞表層土壤 Proteobacteria 豐度高于春季和秋季，秋季 Actinobacteria、Planctomycetes、Gemmatimonadetes、 Cloroflexi 均高于春季和夏季，春季 Crenarchaeota 高于夏季和秋季。相同季節(jié)老齡土壤 Proteobacteria 普遍豐度高于幼齡和中齡，幼齡土壤 Planctomycetes 和Chloroflexi 豐度高于中齡和老齡，春季幼齡 Bacteroidetes高于中齡和老齡。表層中齡土壤 Firmitutes 豐度最高，老齡最低；亞表層幼齡最高。表層幼齡土壤 Nitrospirae均高于其他兩個(gè)樹齡，其中夏季差異極顯著，中齡土壤 Nitrospirae 豐度最低，亞表層無明顯變化規(guī)律。2.4不同樹齡枸杞土壤群落結(jié)構(gòu)組成分析

表1 土壤營養(yǎng)元素和微生物指標(biāo)Table1 Values of nutrient elements and microbial biomass for soils in different conditions

表2 不同季節(jié)和土層各樹齡高通量序列數(shù)、OTUs 和 Shannon 指數(shù)Table2 Summary of high quality sequence numbers, numbers of operational taxonomic units (OTUs, ≥ 97% sequence similarity) and Shannon index in different conditions

圖1 不同季節(jié)和樹齡土壤在 0—20 cm (左) 和 20—40 cm (右) 細(xì)菌各門類相對豐度圖Fig. 1 The relative abundance of bacterial phylum in 0–20 cm (Left) and 20–40 cm (Right) in the soil of L. barbarum in different seasons

將微生物屬數(shù)量大于 0.005 作為標(biāo)準(zhǔn)做熱圖 (圖2)，表層土壤篩選出 65 個(gè)屬，亞表層篩選出 62 個(gè)屬。表層土壤 Xanthomonadaceae 數(shù)量最多，尤其是在秋季中齡和 3 個(gè)季節(jié)的老齡枸杞土壤；Prielluflaceae含量次之，Candidatus、Flavobacteriaceae、o-iii1-15、Acidimicrobiales、Piscirickettsiaceae、Rhizobiales 和Bacullus 數(shù)量相對也較多。亞表層土壤微生物屬類組成與表層相似，但 Xanthomonadaceae、Flavobacteriaceae、Piscirickettsiaceae 和 Bacullus 較表層有不同程度的減少，Priellulaceae、Candidatus、o-iii1-15 和Rhizobiales 較表層有不同程度的增加。從聚類分析結(jié)果看，表層土壤秋季中齡和老齡土壤微生物數(shù)量及結(jié)構(gòu)相似，相同樹齡土壤春季和夏季微生物數(shù)量及結(jié)構(gòu)相似，亞表層土壤也有類似的變化趨勢。

2.5 不同因素對土壤微生物量和細(xì)菌多樣性的影響

從不同因素對土壤微生物指標(biāo)的影響程度來看(表 3)，土層對土壤 MBC 和細(xì)菌群落 Shannon 指數(shù)分別有極顯著和顯著影響，季節(jié)對 MBC、MBN、MBC/OM、MBC/TN、細(xì)菌群落 Chao1 和 Shannon指數(shù)均有極顯著或顯著影響；樹齡對 MBN、MBN/ TN 和 Shannon 指數(shù)都有極顯著影響，季節(jié)和樹齡交互對 MBN、MBN/TN 有極顯著影響。土層和季節(jié)、土層和樹齡 2 因子交互及土層、季節(jié)和樹齡 3 因子交互對土壤微生物指標(biāo)均無顯著影響。所以，土層主要影響土壤碳分布，樹齡主要影響土壤氮分布，而季節(jié)對土壤碳和氮都有顯著影響；樹齡能夠極顯著影響細(xì)菌數(shù)量及其多樣性。

2.6 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) PCA 分析

圖3 為 0—20 cm (A) 和 20—40 cm (B) 土層不同季節(jié)和不同樹齡土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主成分分析結(jié)果，該結(jié)果可以提供土壤微生物群落結(jié)構(gòu)信息。樣品點(diǎn)距離的遠(yuǎn)近代表了樣品中微生物群落的相似性，距離越遠(yuǎn)，差異越大。0—20 cm土層主成分 1 (PC1)和主成分 2 (PC2) 可以解釋 56.58% 的信息，由圖可知，不同季節(jié)幼齡土壤微生物結(jié)構(gòu)與中齡和老齡差異最大，而春季 3 個(gè)樹齡土壤微生物結(jié)構(gòu)與夏季和秋季差異也較大。與表層不同，秋季 3 個(gè)樹齡亞表層土壤微生物結(jié)構(gòu)與春季和夏季差異最大，不同季節(jié)幼齡土壤微生物與其他 2 個(gè)樹齡間差異也較大。從圖可以看出，亞表層土壤季節(jié)差異大于表層。說明樹齡和季節(jié)都可以改變枸杞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

3 討論

3.1 枸杞土壤營養(yǎng)元素與微生物碳氮

土壤有機(jī)碳 (TOC) 不僅是土壤養(yǎng)分的重要組成部分，而且也是微生物活性的物質(zhì)和能量源泉；土壤有機(jī)氮 (TON) 進(jìn)行礦化，形成的礦質(zhì)氮是作物吸

圖2 土壤細(xì)菌在不同樹齡枸杞 0—20 cm (上圖) 和 20—40 cm (下圖) 土壤分布情況Fig. 2 Distribution of the selected bacteria in 0–20 cm (Up) and 20–40 cm (Down) soils under different age of L. barbarum[注（Note）: 圖例中熱圖顏色表示不同樹齡土壤細(xì)菌屬類相對百分?jǐn)?shù)The heat map colors represent the relative percentages of the bacterial genus within different age of soils with the legend indicated of each panel.]

收氮素的主要來源；土壤微生物量碳 (MBC) 是土壤有效養(yǎng)分的流動庫和土壤變化的媒介物，它在土壤保持肥力和植物養(yǎng)分吸收方面具有重要作用；而土壤微生物量氮 (MBN) 則是土壤有機(jī)氮的來源[11–12]。隨著寧夏枸杞樹齡的增加，春季和夏季表層土壤TOC 及 0—40 cm 土壤 TON 都先增加后降低，與Ying 等[13]結(jié)論一致，這是因?yàn)橹旋g枸杞處于旺盛生長期，雖然對養(yǎng)分消耗很大，但由于產(chǎn)量高，農(nóng)民對中齡枸杞施用的化肥和有機(jī)肥量大，以保證其高產(chǎn)，故 TOC 和 TON 都處于最高值，同時(shí)，由于植物根系在土壤中的分布影響有機(jī)碳含量的垂直分布，大量腐爛根系為土壤有機(jī)碳積累提供來源[14]，故老齡枸杞土壤 TOC 和 TON 普遍高于幼齡枸杞土壤。春季表層土壤 MBC 和 MBN 隨樹齡的增加而增加[15]，但春季和秋季亞表層則呈相反趨勢，這可能是由于當(dāng)?shù)剞r(nóng)民施肥普遍施在 10—20 cm，春季和秋季表層土壤養(yǎng)分豐富，能為微生物提供豐富的食物來源，而亞表層施肥量少，而該層枸杞根系對養(yǎng)分消耗量也較大，所以該層土壤養(yǎng)分缺乏，植株與微生物產(chǎn)生了養(yǎng)分競爭[16]，導(dǎo)致主要以氮素為營養(yǎng)來源的微生物量下降，隨著樹齡的增加，MBC 和 MBN 逐漸減少，枸杞土壤環(huán)境逐步惡化[17]。由于夏季盛果期枸杞鮮果 7 天左右采摘一次，中齡植株產(chǎn)量高，對氮素的消耗非常大，故夏季亞表層中齡枸杞 MBC 和MBN 都最小，說明該季亞表層中齡植株氮素和碳源都需要補(bǔ)充。秋季枸杞果實(shí)采摘很少或不再采摘，所以土壤 MBN 大量累積，但中齡和老齡枸杞土壤MBC 均偏低，說明這些樹齡需要大量增加碳源，農(nóng)民需要多施用有機(jī)肥。此外，根系分布及根系分泌物在此過程中也起著積極作用[18–19]。

表3 季節(jié)、土層、樹齡及其交互作用影響土壤微生物因子的多因素方差分析Table3 F-values form three-way ANOVA testing effects of season, layer, planting age, and their interactions on physicochemical and soil microbial parameters

圖3 不同樹齡枸杞土壤 0—20 cm (A) 和 20—40 cm (B) 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的 PCA 分析Fig. 3 Principal components analysis of bacteria communities in 0–20 cm (A) and 20–40 cm (B) in the soil of L. barbarum intercropping under different standing ages

一般來說，土壤微生物群落的季節(jié)變化與土壤溫度和濕度的季節(jié)變異密切相關(guān)[20]，故夏季 TOC、TON 和 MBC 高于春季，秋季最低，這是由于 4 月底當(dāng)?shù)販囟入m然有所升高，但是土溫依舊很低，10月底土壤溫度已經(jīng)下降至 15℃ 左右，這兩個(gè)時(shí)期植物生長緩慢，不利于土壤微生物的生存，而 7 月份，是植株生長茂盛時(shí)期，豐富的植物生物量為土壤提供大量的凋落物，另外發(fā)達(dá)的灌叢植物地下根系，其分泌物和死根是土壤微生物的重要能源物質(zhì)，有利于土壤微生物的生長繁殖與土壤養(yǎng)分的積累。但何容等[21]對武夷山不同海拔植被土壤微生物量碳隨季節(jié)的變化研究表明均為早春最大，夏季最小，研究結(jié)果的差異源于海拔高帶來的溫濕度差異而致。因此，影響土壤微生物的因素較多，其生物量的高低仍取決于起關(guān)鍵作用的影響因素[22]。

3.2 枸杞土壤微生物多樣性

本研究中隨著樹齡增加，枸杞表層土壤 Chao1和 Shannon 指數(shù)普遍呈先增加后減小的趨勢，說明中齡枸杞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與幼齡和老齡相比最豐富，植株生長至 12 年左右時(shí)多樣性減小，土壤微環(huán)境惡化。但亞表層隨樹齡的增加微生物群落多樣性變化規(guī)律不同，中齡土壤 Chao1 和 Shannon 指數(shù)普遍最低，說明中齡植株土壤在亞表層微生物多樣性較差，這可能是施肥多在表層，亞表層養(yǎng)分含量相對較少，根系對養(yǎng)分吸收與微生物形成競爭，抑制或阻礙了微生物群落的繁殖[15]。

在門的分類水平上，不同樹齡間活性微生物組成比較一致，但各門相對豐度不同。從細(xì)菌的組成來看，35% 以上的細(xì)菌基因源于 Proteobacteria，在活性微生物中占絕對優(yōu)勢，其他門如 Actinobacteria、Bacteroidetes、Planctomycetes、Chloroflexi、Firmicutes、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Nitrospirae 均為農(nóng)田土壤中的常見門類[23]。研究表明，Acidobacteria 廣泛分布于理化性質(zhì)迥異的各種土壤環(huán)境，是土壤中僅次于 Proteobacteria 的第二大微生物類群，其數(shù)量和組成受 pH 值影響較大[30]，但本研究中 Actinobacteria 為該地區(qū)枸杞土壤微生物的第二大類群，這是因?yàn)槠溥m合生長在中性或微堿性的土壤中[24]。李晨華等[25]指出 Actinobacteria 與Proteobacteria 是灰漠土表層土壤中的優(yōu)勢類群，此結(jié)論與本研究基本一致，但該研究指出隨土壤深度的增加，Actinobacteria 相對豐度減少，Proteobacteria相對豐度增加，逐漸成為深層土壤的絕對優(yōu)勢類群，也有相關(guān)研究表明Proteobacteria 相對豐度會隨土壤深度降低，Actinobacteria 相對豐度則在深土層中較高[26]。而本研究發(fā)現(xiàn)隨著深度增加，Actinobacteria與 Proteobacteria 都略有降低。通常情況下放線菌適應(yīng)好氧環(huán)境，而周期性灌溉與研究區(qū)較高的地下水位，使得土壤含水量隨土壤深度的增加而升高，氧氣含量隨之下降，這可能是 Actinobacteria 隨深度其相對豐度降低的一個(gè)原因。有研究指出，Acidobacteria是可以作為較貧瘠土壤環(huán)境的指標(biāo)[25]，中齡土壤Acidobacteria 最低，幼齡和老齡都較高，說明幼齡和老齡土壤質(zhì)量都較差。幼齡枸杞表層土壤硝化螺桿菌相對豐度最高，這表明了幼齡枸杞土壤的硝化作用較強(qiáng)，從而可以促進(jìn)氧化亞氮的排放[27]。研究區(qū)中 Firmicutes 的絕對優(yōu)勢類群為芽孢桿菌綱(Bacilli)，其在抗鹽堿方面具有優(yōu)勢[28]，表層中齡樹土壤 Firmitutes 豐度最高，說明該樹齡表層抗鹽堿能力最強(qiáng)，老齡抗鹽堿能力最弱。

本研究變形桿菌中 Xanthomonadales、Rhodobacterales 和 Rhizobiales 占主導(dǎo)地位，尤其是在秋季中齡和 3 個(gè)季節(jié)的老齡枸杞土壤中。Xanthomonadales 是革蘭氏陰性菌，其中的很多物種是植物的病原體，能夠?qū)е罗r(nóng)作物病害[9]，其含量與土壤遭受脅迫有關(guān)[29]。雖然表層土壤拮抗微生物L(fēng)ysobacter 比例高于亞表層，對病原菌有一定的制約作用[30]，但含量較少，其作用也有限。亞表層Xanthomonadaceae、Bacullus 等減少，Priellulaceae、Rhizobiales 較表層有不同程度的增加，其中Rhizobiales 具有固氮作用[31]，說明亞表層土壤較表層土壤略健康。

3.3 枸杞土壤微生物影響因素

從不同因素對土壤微生物指標(biāo)的影響程度來看，土層主要對土壤碳源和微生物生物量碳有極顯著影響[32]。季節(jié)對枸杞土壤碳源、微生物生物量碳氮均有極顯著影響，而樹齡主要顯著影響土壤氮源和細(xì)菌群落多樣性，土層、季節(jié)和樹齡 3 因子交互對土壤微生物均無顯著影響。從 PCA 結(jié)果也可以看出，季節(jié)和樹齡都可以顯著影響枸杞土壤微生物結(jié)構(gòu)，表層樹齡影響更顯著，但亞表層季節(jié)影響更大。

4 結(jié)論

隨著寧夏枸杞樹齡的增加，春季和夏季表層土壤 TOC 及 0—40 cm 土壤 TON 都先增加后降低，春季表層土壤 MBC 和 MBN 隨樹齡的增加而增加，但春季和秋季亞表層則呈相反趨勢。隨著樹齡增加，枸杞表層土壤微生物多樣性普遍呈先增加后減小的趨勢，說明中齡枸杞土壤微生物群落結(jié)構(gòu)最豐富，植株生長至 12 年左右時(shí)多樣性減小，土壤微環(huán)境惡化。但 6 年樹齡植株根系在亞表層微生物多樣性較差，所以建議中齡枸杞施肥深度增加。枸杞土壤Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidete 在活性微生物中占絕對優(yōu)勢。本研究變形桿菌中Xanthomonadales，Rhodobacterales 和 Rhizobiales 占主導(dǎo)地位，尤其是在秋季中齡和 3 個(gè)季節(jié)的老齡枸杞。不同因素對枸杞土壤細(xì)菌群落演替影響程度不同：季節(jié)對枸杞土壤碳源、微生物生物量碳氮均有極顯著影響，而樹齡主要顯著影響土壤氮源和細(xì)菌群落多樣性，土層、季節(jié)和樹齡 3 因子交互對土壤細(xì)菌群落均無顯著影響。

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Evolution characteristics of bacteria in soil of medical plant (Lycium barbarum L.)

ZHANG Jun-hua1, ZHANG Yi2, LI Ming1
( 1 Institute of Environmental Engineering, Ningxia University, Yinchuan 750021, China; 2 College of Education, Ningxia University, Yinchuan 750021, China )

【Objectives】Studying effects of soil layer, seasons and stand ages on soil bacteria of Lycium barbarum L. is very important to reveal trends of soil quality change in cultivated regions of L. barbarum.【Methods】The study was achieved by high throughput sequencing analysis of bacteria community structure and abundance of soil samples from L. barbarum fields in Zhongning County, Ningxia Province, which is the origin of L. barbarum. Three stand ages of L. barbarum were selected, small-age (< 1 year), middle-age (6 year) and old-age (12 year). The soil samples (three plots each) were collected in spring, summer and autumn in surface (0–20 cm) and subsurface (20–40 cm) layers.【Results】Compared to the small-age of soil, the total organic carbon (TOC) of 0–20 cm in spring and summer and total organic nitrogen (TON) of 0–40 cm of the middle-age and old-age were increased and then decreased and the microbial biomass carbon (MBC) andmicrobial biomass nitrogen (MBN) of 0–20 cm in spring were increased from the small-age to old-age, while those of 20–40 cm in spring and autumn were decreased. The MBC of 0–20 cm of the middle-age in summer was highest, while the MBN was lowest. With the increase of stand age, the soil bacteria community diversity of L. barbarum was increased and then decreased. Proteobacteria, Actinobacteria and Bacteroidete were prodominent plyumn. The relative abundance of Proteobacteria of the old-age was higher than that of the smallage and middle-age, Planctomycetes and Chloroflexi of small-age were higher than the middle-age and old-age. Xanthomonadales, Rhodobacterales and Rhizobiales were the prodominent classes, especial for the middle-age in autumn and old-age in three seasons. There were different effects of soil layer, seasons and stand ages on the microbial biomass.【Conclusions】With the increase of stand age, microbial biomass and diversities of soil of L. barbarum have an increased–decreased tendency. Compared to the small-age and middle-age, the soil of the old-age had maximum Xanthomonadales. Carbon of soil was influenced significantly by soil layers in our study, nitrogen and bacterial community diversities were influenced significantly by stand ages and carbon, MBC and MBN were all influenced significantly by seasons.

Lycium barbarum L.; bacteria community; diversity; season; soil layer; stand age

2016–09–02 接受日期：2016–11–28

國家自然科學(xué)基金（41261080）；寧夏自治區(qū)環(huán)保專項(xiàng)資金項(xiàng)目資助。

張俊華（1977—），女，寧夏中衛(wèi)人，博士，研究員，主要從事精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)和土壤質(zhì)量提升方面研究。E-mail：zhangjunhua728@163.com