LDH法測定纖維蛋白膠對人脂肪干細胞的細胞毒性

徐濤　易陽艷

[摘要] 目的 采用LDH法測定纖維蛋白膠對人脂肪干細胞的細胞毒性。 方法 取成人吸脂術(shù)后的廢棄脂肪組織并從中得到人脂肪干細胞，分別制成50%浸提液組、100%浸提液組、陰性對照組、陽性對照組，并采用LDH檢測試劑盒測定各組纖維蛋白培養(yǎng)液中LDH的含量。 結(jié)果 原代ASCs生長緩慢，傳代后生長加速，且ASCs呈成纖維樣細胞形態(tài)；24 h和72 h兩個時間點中50%纖維蛋白膠浸提液組、100%纖維蛋白膠浸提液組分別與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 纖維蛋白膠對ASCs無明顯細胞毒性，可為以纖維蛋白膠為支架材料的脂肪組織工程研究提供參考。

[關(guān)鍵詞] LDH法；纖維蛋白膠；脂肪干細胞；細胞毒性

[中圖分類號] R622 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）13-0038-03

[Abstract] Objective To determine the cytotoxicity of fibrin glue to human adipose stem cells by LDH method. Methods The abandoned adipose tissue of human liposuction was taken and the human adipose stem cells were obtained and made into the 50% leaching solution group， 100% leaching solution group， negative control group and positive control group.And the LDH test kit was used to detect the content of LDH in each fibrin culture medium. Results The growth of primary ASCs was slow. The growth of ASCs was accelerated after passage， and ASCs appeared fibroblast-like morphology. There was no significant difference between 50% fibrin glue extract group ，100% fibrin glue extract group and the negative control group at 24 and 72 hours（P>0.05）. Conclusion Fibrin glue has no obvious cytotoxicity on ASCs， and it can give a reference to the study of adipose tissue engineering with fibrin glue as scaffold.

[Key words] LDH method； Fibrin glue； Adipose stem cells； Cytotoxicity

軟組織缺損是整形外科臨床工作中經(jīng)常遇到的問題，中老年人面部軟組織容量減少的矯正也有著廣泛需求。目前臨床上常用的作為軟組織填充的材料可大致分為兩類：一類是暫時性填充材料，它們一般是人工合成的機體組織中的正常成分，如透明質(zhì)酸或膠原蛋白，其因具有生物相容性好、可被降解吸收的優(yōu)點而應(yīng)用廣泛，但也存在填充效果維持時間短的缺點；另一類是永久性填充材料，它們一般是人工合成的惰性材料組成，如硅膠，其作為軟組織填充具有異物植入、效果不自然的缺點[1，2]。自體脂肪顆粒移植近年來發(fā)展較快，但移植后的脂肪顆粒的存活尚不理想，導(dǎo)致移植存活率較低，需要多次手術(shù)才能達到需要的填充效果[3，4]。近年來，隨著脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ASCs）的發(fā)現(xiàn)，基于組織再生原理的脂肪組織工程得到了極大發(fā)展，以脂肪干細胞為種子細胞的脂肪組織工程研究成為熱點[5]。本研究擬采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）法研究纖維蛋白膠對于ASCs的細胞毒性，以期為以纖維蛋白膠為支架材料的脂肪組織工程的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

FBS、低糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco）；Ⅰ型膠原酶、纖維蛋白原、凝血酶（Sigma）；乳酸脫氫酶檢測試劑盒（南京凱基）。倒置相差顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱，多功能酶標儀（Thermo）。

1.2 人脂肪干細胞的獲取

人脂肪干細胞從吸脂術(shù)后廢棄的脂肪組織中提取，術(shù)前已征得患者征得同意，研究經(jīng)由醫(yī)院倫理委員會批準。

取成人吸脂術(shù)后的廢棄脂肪組織5 mL，加入等體積的濃度為1.0 mg/mL的Ⅰ型膠原酶溶液，搖晃混勻后置于水浴箱37℃消化30 min。消化后以1000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，去除上層油脂及液體成分。用含有10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，并調(diào)整細胞濃度為（5～10）×105個/L，接種至25 cm培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)。48 h后首次換液，融合至80%左右時用胰蛋白酶消化傳代。傳至第3代用于后續(xù)的實驗。

1.3 纖維蛋白膠浸提液的制備

參考ISO 10993醫(yī)療器械生物學(xué)評價標準，提取纖維蛋白膠浸提液。首先用雙聯(lián)注射器分別吸取等體積的50 mg/mL纖維蛋白原溶液和500 IU/mL凝血酶溶液，均勻注射于6孔板中，使所形成的纖維蛋白膠鋪滿6孔板底部。待成膠后按照材料表面積/液體體積=3 cm2/mL的標準加入DMEM培養(yǎng)基，37℃孵箱中浸提72 h后獲得100%纖維蛋白膠浸提液，將該浸提液加入等體積DMEM培養(yǎng)基稀釋獲得50%纖維蛋白膠浸提液。將獲得的纖維蛋白膠浸提液加入10%的胎牛血清，于4℃保存待后續(xù)實驗使用。

1.4 LDH檢測試劑盒測定各組培養(yǎng)液中LDH的含量

細胞毒性檢測分為以下四組：陰性對照組、50%纖維蛋白膠浸提液組、100%纖維蛋白膠浸提液組、陽性對照組（最大酶活性釋放對照）。將傳至第3代的ASCs胰酶消化后調(diào)整細胞濃度為1×107/L的細胞懸液，每孔100 μL接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h細胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液，按上述分組分別加入以下四種培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)基（陰性對照組）、50%纖維蛋白膠浸提液、100%纖維蛋白膠浸提液、含6.4%的苯酚的DMEM培養(yǎng)基（陽性對照組）。每組設(shè)置復(fù)孔5個，共種板2板。然后置于37℃孵箱中培養(yǎng)。分別在孵育24 h、72 h后取出一塊96孔板，吸取各孔培養(yǎng)液，1000 r/min離心5 min去除沉淀。使用LDH檢測試劑盒按照說明書檢測各組培養(yǎng)液中LDH的含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人脂肪干細胞形態(tài)學(xué)觀察

從人脂肪抽吸物中經(jīng)酶消化法提取原代ASCs，原代ASCs生長緩慢，約7 d長滿培養(yǎng)瓶。傳代后生長加速，約3 d左右即可傳代。傳代后的ASCs形態(tài)典型，呈成纖維樣細胞形態(tài)，有粗大的足突，核仁明顯，細胞生長較密時呈明顯的漩渦狀分布（封三圖1）。

2.2 各組培養(yǎng)液中LDH的含量檢測結(jié)果

各組細胞培養(yǎng)24 h和72 h后的上清液中LDH濃度測定結(jié)果顯示，24 h和72 h兩個時間點中50%纖維蛋白膠浸提液組、100%纖維蛋白膠浸提液組分別與陰性對照組比較，均無顯著差異（P>0.05），提示纖維蛋白膠浸提液并不增加ASCs的LDH釋放。見表1。

3 討論

在脂肪組織工程構(gòu)建中，支架材料是關(guān)鍵的組成部分，組織工程中的支架材料需要滿足多個條件，如具有良好的生物相容性、在特定的時間內(nèi)可以被降解等。纖維蛋白膠（fibrin gel）是模擬凝血反應(yīng)，纖維蛋白原在凝血酶的作用下形成的具有一定物理強度的膠狀物[6]。已經(jīng)有報道纖維蛋白膠作為支架材料用于多種組織工程的研究中，但是，纖維蛋白膠作為支架材料復(fù)合ASCs用于構(gòu)建組織工程脂肪尚缺乏足夠研究[7]。本研究中，我們通過酶消化法從脂肪組織中獲取了人的ASCs。通過檢測纖維蛋白膠浸提液培養(yǎng)人ASCs后LDH的釋放量，評估纖維蛋白膠對于體外培養(yǎng)的ASCs的細胞毒性，結(jié)果顯示纖維蛋白膠對于ASCs無明顯的細胞毒性，為纖維蛋白膠作為支架材料復(fù)合ASCs構(gòu)建組織工程脂肪的深入研究提供參考。

傳統(tǒng)的組織工程構(gòu)建策略是將種子細胞與支架材料復(fù)合，經(jīng)過一定誘導(dǎo)處理之后植入體內(nèi)，因此，種子細胞和支架材料是其兩大關(guān)鍵要素。Zuk PK等[8]在2001年首先報道了在脂肪抽吸物中培養(yǎng)出了具有間充質(zhì)干細胞特性的細胞種群，命名為ASCs。由于脂肪獲取容易以及獲取量大，因而從脂肪中獲取ASCs具有很好的應(yīng)用前景。ASCs的發(fā)現(xiàn)促進了脂肪組織工程的發(fā)展，探索利用ASCs構(gòu)建出組織工程化的脂肪組織是近年來的熱點研究領(lǐng)域[9，10]。

在組織工程中，需要將種子細胞種植于三維支架上，因此，支架材料是影響組織構(gòu)建的另一個重要因素。根據(jù)支架材料的塑形特點，大致可分為預(yù)塑形多孔支架材料和可注射性凝膠材料[11]。一般而言，對于脂肪組織工程，可注射型凝膠支架構(gòu)建的可注射型軟組織填充物具有明顯優(yōu)勢：手術(shù)創(chuàng)傷??；填充均勻，特別是修復(fù)不規(guī)則缺損效果更好[12]。

纖維蛋白膠是將纖維蛋白原和凝血酶混合，模擬凝血反應(yīng)的最后通路，纖維蛋白聚合形成水凝膠，通過雙聯(lián)注射器可以很容易實現(xiàn)注射填充。由于纖維蛋白膠具有良好的可降解性能，因而具有作為支架材料用于組織工程中的潛力。已經(jīng)有報道將纖維蛋白膠用于多個領(lǐng)域的研究，如用于平滑肌、骨、軟骨組織工程研究中[13，14]。對于任何需要植入機體的材料而言，其生物相容性是必須要評價的因素。植入材料的生物相容性評價根據(jù)國際標準主要分為三個步驟：第一步是體外細胞毒性檢測，觀察其對于體外培養(yǎng)的細胞的生長增殖的影響，以此來評價其細胞毒性；第二步是動物體內(nèi)實驗，主要用于評價材料對于機體局部和全身的毒性作用；第三步為臨床試驗。因此，在研究一個材料的生物相容性時，首先要評價的就是其細胞毒性作用。LDH是用于評價細胞毒性的常用指標之一，其在細胞膜受到損傷或者破裂時被釋放到細胞外，因而，LDH釋放程度就反映了細胞受損程度，其釋放越多，細胞損傷越嚴重[15]。

在本實驗中我們分別制備了兩種不同濃度的纖維蛋白膠浸提液，即100%浸提液和50%浸提液，并且在培養(yǎng)的第1、3天進行檢測，結(jié)果顯示100%浸提液組和50%浸提液組與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。該結(jié)果提示纖維蛋白膠浸提液不影響ASCs的LDH的釋放，也就提示纖維蛋白膠對于ASCs無明顯細胞毒性。

纖維蛋白膠作為支架材料用于脂肪組織工程尚無足夠的研究報道，本研究僅通過LDH法評估了纖維蛋白膠對于體外培養(yǎng)的ASCs的細胞毒性，還需要更多深入而全面的研究來確定纖維蛋白膠作為組織工程支架材料的可行性和安全性。

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（收稿日期：2017-03-14）